עבודה זו נתמכה על ידי הקנדי הלאומי לבריאות מחקר (CIHR) מענק ויין ס Sossin. קרול א פרח הוא מקבל המלגה הבתר מן Fonds de la משוכלל ונדיר en סנטה קוויבק (FRSQ) וכן הרינגטון קונרד המילגה. המחברים מבקשים להודות ג&#39;ואנה פתילון, מרגרט הייסטינגס מרגרט Labban לעזרה עם לירות וידאו בריכת מדליין ריצ&#39;מונד לעזרה עם סקירה הגרפיקה.

1. הכנה ותחזוקה של Sf9 תרבויות monolayer Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sf9 תרבית תאים והתחזוקה מתבצעת במנדף בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sf9 תאים מתאי Spodoptera frugiperda השחלות (Sf21 תאים) וכן ניתן לרכוש תאים קפואים התקשורת של גרייס מן Invitrogen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 8 מ&quot;ל של מדיום החרק של גרייס, בתוספת (1X), אשר 30% עוברי שור בסרום (FBS) נוספה ב 75 ס&quot;מ 2 בקבוק תרבית תאים עם צוואר הנטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה הצינור הקפוא של Sf9 תאים במהירות אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים על ידי העברת צינור הלוך ושוב (כ 1-2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת Sf9 תאים 75 ס&quot;מ 2 בקבוק התרבות תאים צלחת רוק בעדינות ביד כדי לפזר את התאים באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1-2 שעות ב 27 ° C עד התאים המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הישן ולהחליף עם 10 מ&quot;ל של מדיום של חרקים freshGrace עם 30% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 27 מעלות צלזיוס עד התאים ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על תרבויות monolayer, להסיר בינוני הישן מהבקבוק ומחוברות של Sf9 תאים להוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום החרק של גרייס עם 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברז קלות בצד של הבקבוק כמה פעמים כדי לנתק Sf9 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל ו pipettor, פיפטה התקשורת מעלה ומטה פעם בעדינות, ריסוס קיר בקבוק תוך pipetting למטה. העברת התאים צינור סטרילי מ&quot;ל 15 Polysterene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של השעיה Sf9 התא 8 מ&quot;ל של מדיום החרק של גרייס עם FBS 10% (בדילול 01:05 כדי לשמור על שלב הצמיחה יומן) של 75 ס&quot;מ חדש בקבוקון 2 תאים תרבות צלחת רוק בעדינות ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 27 מעלות צלזיוס עד התאים ומחוברות. </li></ol> 2. הביטוי של PKCS Tagged fluorescently ב Sf9 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשביל לחיות הדמיה הניסוי, תרבות Sf9 תאים על 35 מ&quot;מ MatTek זכוכית התחתונה תרבות disheswith משטח זכוכית של 14 מ&quot;מ עובי ו coverslip של 0.16-0.19 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PKCS מתוייגים עם חלבוני ניאון באים לידי ביטוי Sf9 תאים באמצעות Cellfectin מגיב II transfection ההמלצה הבאה של היצרן בשינויים המפורטים להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: לפני ציפוי התאים, להתייחס לכל צלחת MatTek בינוני עם החרק של גרייס עם FBS של 10% לפחות במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן Sf9 תאים משלב 11 (לעיל) באמצעות hemacytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 0.05 x 10 6 תאים coverslip כל MatTek זכוכית בנפח כולל של 150 μL. אפשר לצרף את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של גרייס בתוספת 10% FBS כדי מ&quot;ל כל מנה 1 בכל פעם לאט, כדי למנוע ניתוק התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 27 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו ואילך, להשתמש המלצה של היצרן עבור transfection Sf9 של תאים עם פלסמיד דנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: Transfect Sf9 תאים עם PKCS מתויג fluorescently באמצעות Cellfectin מגיב II transfection. יש לנו לעתים קרובות שיתוף לידי ביטוי במערכת זו PKCS מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (eGFP) ו monomeric חלבון פלואורסצנטי אדום (mRFP) (פרטים לבנייה פלסמיד תוארו בעבר 2,5). הביטוי של חלבון אחד ניאון בזמן התשואות על 70-80% להביע תאים 72 שעות לאחר transfection. עמית הביטוי של שני חלבונים פלורסנט פוחתת יעילות transfection כדי כ -30% משותף המבטא תאים. כאשר שיתוף להביע eGFP-tagged PKC ו-mRFP מתויג PKC, להשתמש 2x-DNA פלסמיד יותר חלבון mRFP-tagged עבור ביטוי חלבון אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע לחיות הדמיה 48-72 שעות שלאחר transfection (ביטוי חלבון אופטימלי, להמתין 72 שעות). </li></ol> 3. הביטוי של PKCS Tagged fluorescently בנוירונים Aplysia חושי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תרביות תאים עצביים Aplysia תוארה במאמר וידאו על ידי ג&#39;או 4 עמיתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PKCS מתוייגים עם חלבוני ניאון באים לידי ביטוי נוירונים Aplysia חושית באמצעות הליך microinjection כמפורט להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של גרין מהיר 1% (FCF) של מים מזוקקים, מסנן באמצעות מזרק מזרק 28 מ&quot;מ פילטר (0.20 מיקרומטר). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microinjection של עצב סנסורי יכול להתבצע ביום 1 או 2 אחרי יום לבודד את הנוירונים אך אנו מוצאים כי מחכה 2 ימים מאפשר היצמדות התא עדיף coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2 לאחר בידוד של נוירונים חושיים, להפשיר aliquot של גרין מהיר לסנן אותו שוב באמצעות מזרק מזרק מסנן 28 מ&quot;מ (0.20 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ה-DNA פלסמיד המכיל מים מזוקקים בתוך הירוק מהיר 0.5%. ריכוזים של DNA פלסמיד גבוה ככל 0.4 מיקרוגרם / μL ניתן להשתמש אך לא מומלץ ללכת מעל ערכים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ה-DNA פלסמיד / פתרון ירוק מהיר באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל ו 4 מ&quot;מ מזרק מסנן (0.20 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הדנ&quot;א פלסמיד / גרין פתרון מהיר ב XG 16,110 במשך 15 דקות באמצעות מיקרופוןrocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודות חדה microinjection של הנוירונים באמצעות חולץ microelectrode (סאטר Flaming / בראון micropipette פולר, דגם P-97). שימוש נימה תיבת, למשוך microelectrodes זכוכית בקוטר 1 מ&quot;מ החיצוני, 0.75 מ&quot;מ בתוך בקוטר 100 מ&quot;מ אורך באמצעות קיר זכוכית דק נימים עם נימה בפנים (World Precision מכשירים TW100F-4). לקבלת מידע נוסף על משיכת אלקטרודות microinjection עיין ספר בישול אלקטרודה סאטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כל אלקטרודה עם μL 2 של ה-DNA פלסמיד / גרין פתרון מהיר באמצעות פיפטה microloader קצה (Eppendorf CA32950-050). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את תחתית הכוס MatTek תרבות צלחת המכילה תרבויות Aplysia העצבית לתחנת microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחנת microinjection מורכב מהפעולות הבאות: תוצרת בית בשלב זכוכית גדול להחזיק את הכלים תרבות על השולחן רטט בידוד (קינטי בידוד מערכות עבודה רטט), מערכת סטריאו, היקף עם תאורה הלוגן חיצוני, micromanipulator (סאטר האקסלי Micromanipulator וול סוג אשר מאפשר מיצוב הן גס ו-Ultra קנס של שלושה צירים), מחזיק microelectrode מחוברת משאבה פנאומטי (מכשירים העולם Precision PV820 פניאומטיים Pico-Pump). קלט הלחץ של המשאבה פנאומטי מחובר טנק חנקן דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס microelectrode לתוך מחזיק microelectrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפייה במיקרוסקופ, סטריאו, הכנס את קצה micropipette לתוך גרעין התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פולסים קצרים הלחץ של חנקן (10-100 ms משך: 20 £ / ב 2) עד בגרעין הופך ירוק uniformely. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. עבור טרנסלוקציה PKC אופטימלי, לבצע הדמיה לחיות הניסוי 20-24 שעות לאחר ההזרקה. </li></ol> 4. ויזואליזציה של טרנסלוקציה של PKC חיים Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה, אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss LSM510 confocal הפוכה עם 200 Axiovert. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה פרוטוקול זהה עבור Sf9 תאים עבור נוירונים Aplysia חושית למעט הבאים: Sf9 התאים הם צילמו עם מטרה x63 טבילה שמן ואילו נוירונים Aplysia חושית הם צילמו עם מטרה טבילה שמן X40. Sf9 התאים הם צילמו בחדר בקרת טמפרטורה שמרה על 26-27 מעלות צלסיוס ואילו נוירונים Aplysia חושית הם צילמו בטמפרטורת החדר נשמר סביב 18-20 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים 30 mW ארגון לייזר (עירור ב 488nm) עם פלט לייזר 50% PKC תמונה מתוייגים עם חלבון ו eGFP לייזר HeNe (עירור ב 543nm) כדי PKC תמונה מתוייגים עם חלבון mRFP. ארגון ו HeNe קווי לייזר נחלש ל -4% ואת התפוקה העברת 50% בהתאמה לפני הדמיה חריר מותאם אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לקבל את המנה תרבות התייצב על הבמה הדמיה כדי למנוע תנועה או רטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 1 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות מצלחת בעדינות בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל עוזב נפח 1 מ&quot;ל סך המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות בחלק האמצעי של התאים בהם את הגרעין ניתן לראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סדרת זמן של 10-20 תמונות confocal לצלם כל 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחילו את סדרת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 תמונות נלקחים (אחרי נקודת זמן 30 שניות), מוסיפים 1 מ&quot;ל של התרופה (2X ריכוז) בעדינות טיפה אחר טיפה על גבי התאים בעזרת פיפטה P1000. התרופה היא הוסיפה ברציפות במשך כ -30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק מהתרופות לגרום טרנסלוקציה מהיר אשר ניתן לראות מיד לאחר טיפול תרופתי (בנקודת זמן 60 שניות), בעוד שאחרים לגרום טרנסלוקציה איטי וזה רק 50-10 דקות אופטימלי שלאחר הטיפול (סרט 1 סרט ו 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התרופה צריכה להיות נשטף, להשתמש 2 x 10 מ&quot;ל pipets לעשות כביסה, pipetting החיץ לשטוף בעדינות עם פיפטה אחת על צד אחד של תבשיל ו pipeting את המדיה בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לשטוף את כבר יעיל אם את האפקט של התרופה הוא הפיך, PKC יחזרו cytosol בתוך 30-60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הסרט כקובץ LSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש NIH תוכנה J תמונה כדי לפתוח את הקבצים LSM ולכמת תמונות הקדם ואת הטיפול התרופתי הודעה. כימות תוארה במקום אחר 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons.">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li><li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2+-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation.">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li><li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia.">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia.">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תיארנו טכניקה הדימוי של טרנסלוקציה PKCS מתויג fluorescently בזמן אמת Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושית. Sf9 תאים לספק מערכת פשוטה טרנסלוקציה תמונה PKC מאז culturing ו transfecting אותם הוא די ישר קדימה. לעומת זאת, microinjection של נוירונים Aplysia חושית לוקח קצת זמן כדי לשלוט; עד כמה חודשים. קשיי...

<table><tbody><tr><td>Sf9 frozen cells</td><td>&lt;em&gt;Spodoptera frugiperda&lt;/em&gt; ovarian cells</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid</td><td>Reagent</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11605-094</td><td>Use to culture Sf9 cells</td></tr><tr><td>Corning 75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; canted neck cell culture flask</td><td>Tool</td><td>Corning</td><td>430720</td><td>Use to culture Sf9 cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Reagent</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>Supplement Grace&amp;rsquo;s media with FBS prior to use</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Tool</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Use to filter Fast Green solution</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Tool</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Tool</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>Use to filter Fast Green solution</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Tool</td><td>Corning</td><td>431212</td><td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td></tr><tr><td>Glass Bottom Dish</td><td>Tool</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagent</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into &lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt; sensory neurons</td></tr><tr><td>Thin wall glass capillaries</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>Use to make micr&amp;#8211;lectrodes for microinjection</td></tr><tr><td>Microloader pipette tip</td><td>Tool</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>Autoclave before using to fill up the micr&amp;#8211;lectrodes for microinjection</td></tr><tr><td>PV820 Pneumatic PicoPump </td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td>Part of microinjection station</td></tr><tr><td>Micr&amp;#8211;lectrode holder</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>Use to hold micr&amp;#8211;lectrode </td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Tool</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>Use to position micr&amp;#8211;lectrode in the three-axis</td></tr></tbody></table>

live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons

חלבון קינאז Cs (PKCS) הם סרין קינאזות תראונין כי תפקיד מרכזי בוויסות מגוון רחב של תהליכים תאיים כגון צמיחת תאים למידה וזיכרון. ישנן ארבע משפחות הידועים של isoforms PKC בבעלי חוליות: PKCS קלאסית (α, βI, βII ו γ), סוג הרומן אני PKCS (ε ו η), רומן מסוג II PKCS (δ ו θ), ו PKCS טיפוסיות (ζ ו ι ). PKCS קלאסית מופעלים על ידי Ca 2 + ו diacylclycerol (דאג), בעוד PKCS רומן מופעלים על ידי DAG, אבל הם Ca 2 + עצמאית. PKCS טיפוסיות מופעלים על ידי לא Ca 2 + וגם לא דאג. ב Aplysia californica, מערכת המודל שלנו ללמוד היווצרות הזיכרון, ישנם שלושה ספציפיים מערכת העצבים isoforms PKC אחד מתוך כל שיעור גדול, כלומר קונבנציונלי PKC Apl אני, סוג הרומן אני PKC Apl השנייה טיפוסיות PKC Apl III. PKCS הם שומנים בדם מופעל קינאזות ובכך ההפעלה של PKCS קלאסית רומן בתגובה לאותות תאיים כבר בקורלציה לעתים קרובות עם טרנסלוקציה PKC מן הציטופלסמה אל קרום התא. לכן, טרנסלוקציה PKC חזותי בזמן אמת בתאים חיים הפך להיות כלי רב ערך עבור הבהרת הולכת אותות מסלולים שיובילו הפעלת PKC. לדוגמה, טכניקה זו אפשרה לנו לקבוע כי isoforms שונים של PKC translocate בתנאים שונים לתווך סוגים שונים של הפלסטיות הסינפטית וכי (5HT) סרוטונין הפעלת PKC Apl השנייה דורשת ייצור של שני DAG ו phosphatidic חומצה (רש&quot;פ) עבור טרנסלוקציה 1-2. חשוב לציין, את היכולת לדמיין את אותו הדבר שוב ושוב נוירון אפשרה לנו, למשל, כדי למדוד את הפחתת רגישות התגובה PKC בפירוט מעולה 3. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כל שלב הכנת Sf9 תרביות תאים, תרביות של נוירונים Aplysia חושית תוארו במאמר אחר וידאו 4, להביע PKCS מתויג fluorescently ב Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי לחיות הדמיה טרנסלוקציה של PKC בתגובה activators שונים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית.

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons at JoVE.com

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

בסרטון הזה אנחנו מדגימים להדמיה טרנסלוקציה של PKC בתאים חיים באמצעות PKCS מתויג fluorescently.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

live-imaging-pkc-translocation-sf9-cells-aplysia-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Views.  McGill University. בסרטון הזה אנחנו מדגימים להדמיה טרנסלוקציה של PKC בתאים חיים באמצעות PKCS מתויג fluorescently.

Video: Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioengineering

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

יישומים של קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין להדמיה חיה

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Developmental Biology

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה של חלבונים בתאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס באמצעות הדמיה של תאים חיים

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal transport is disrupted in multiple neurodegenerative diseases, and projection neurons are particularly vulnerable because of the need to transport cellular materials over long distances and sustain substantial axonal mass. Pathological modifications of several disease-related proteins negatively affect transport, including tau, amyloid-&#946;, &#945;-synuclein, superoxide dismutase, and huntingtin, providing a potential common mechanism by which pathological proteins exert toxicity in disease. Methods to study these toxic mechanisms are necessary to understand neurodegenerative disorders and identify potential therapeutic interventions.
Here, cultured primary rodent hippocampal neurons are co-transfected with multiple plasmids to study the effects of pathological proteins on fast axonal transport using live-cell confocal imaging of fluorescently-tagged cargo proteins. We begin with the harvest, dissociation, and culturing of primary hippocampal neurons from rodents. Then, we co-transfect the neurons with plasmid DNA constructs to express fluorescent-tagged cargo protein and wild-type or mutant tau (used as an exemplar of pathological proteins). Axons are identified in live cells using an antibody that binds an extracellular&#160;domain of neurofascin, an axon initial segment protein, and an axonal region of interest is imaged to measure fluorescent cargo transport.
Using KymoAnalyzer, a freely available ImageJ macro, we extensively characterize the velocity, pause frequency, and directional cargo density of axonal transport, all of which may be affected by the presence of pathological proteins. Through this method, we identify a phenotype of increased cargo pause frequency associated with the expression of pathological tau protein. Additionally, gene-silencing shRNA constructs can be added to the transfection mix to test the role of other proteins in mediating transport disruption. This protocol is easily adaptable for use with other neurodegenerative disease-related proteins and is a reproducible method to study the mechanisms of how those proteins disrupt axonal transport.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: הבנת ההשפעה של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית במחלות נוירודגנרטיביות

Here, we demonstrate how to combine transfection of primary hippocampal rodent neurons with live-cell confocal imaging to analyze pathological protein-induced effects on axonal transport and identify mechanistic pathways mediating these effects.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video