שיטה זו תאפשר לחוקר לחקור מערכות קשות למחקר, כמו פפטידים ויוני מתכת מעבר בשורה הראשונה, שניהם בדרך כלל מאתגרים באמצעות יישומים סטנדרטיים יותר. היתרון העיקרי כאן הוא באמצעות טכניקות אורתוגונליות כי הם משלימים זה את זה היטב, וזה יכול לתת תובנה נוספת לתוך המערכת ולעזור לנו לא לפספס שום תופעה. השיטה המפורטת בסרטון זה מתאימה מאוד ללימוד מערכות אחרות.
למרות שאנו מראים אותו עם Cu(II) ופפטיד, הוא יכול לשמש לאינטראקציות רבות ושונות של פפטידי מתכת וחלבון מתכת. אני חושב שהחלק הקשה ביותר יהיה למצוא בחירת חיץ טובה עבור יון המתכת והפפטיד שלך. הייתי מעיין בספרות כדי לראות אילו מאגרים שימשו אחרים בעבר.
מי שתדגים את ההליך תהיה סוהי צ'וי, סטודנטית לתואר שני במעבדת המחקר שלי. כדי להתחיל, הפעל את ספקטרופוטומטר הקליטה האלקטרוני ותן לו להתחמם במשך כ-15 עד 20 דקות לפני השימוש. לאחר מכן הפעל את תוכנת הספקטרופוטומטר והגדר את הפרמטרים, כגון טווח סריקה של 200 עד 900 ננומטר, טווח הסריקה של 200 ננומטר לשנייה, וקו הבסיס של קרן כפולה מתוקן.
לאחר מכן, אסוף קו בסיס ללא cuvettes או דגימות בנתיבי הקרן. באמצעות שני cuvettes תואמים בספקטרופוטומטר הקרן הכפולה, טען קובט אחד עם 115 מיקרוליטרים של מים אולטרה-טהורים ואת הקובט השני עם 115 מיקרוליטר של דגימת הפפטיד תוך הקפדה על כך שאין בועות אוויר ב- cuvettes מכיוון שאלו יפריעו לאות. לאחר מכן, הניחו את הקובט עם מים אולטרה-טהורים בקרן הייחוס ואת הקובט עם הפפטיד בקרן הדגימה.
לאחר מכן לאסוף את ספקטרום הספיגה של פפטיד ללא מתכת. הוסף כמות תת-שכבתית של תמיסת Cu(II) לתוך הקובטה עם דגימת הפפטיד ורשום את הנפח לניתוח מאוחר יותר. צנרת בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב את התמיסה תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר.
לאחר שיווי משקל במשך חמש דקות החזירו את הקובט למחזיק תא הדגימה ורשמו את ספקטרום הקליטה. לאחר מכן חזור על התוספת של Cu(II)aliquots לתמיסת הפפטידים עבור מקבילות שונות ורשום את הנפח הכולל של Cu(II) שנוסף לקובט. לאחר אתחול התוכנה כפי שתואר קודם לכן בשתי cuvettes תואמות לטעון cuvette אחד עם 115 microliters של מים טהורים במיוחד ו cuvette אחרים עם 115 microliters של תמיסת נחושת-פן מורכב.
מניחים את הקובט עם מים בקרן הייחוס ואת הקובטה עם תמיסה מורכבת מנחושת-פן בקרן הדגימה. לאחר מכן לאסוף את ספקטרום הקליטה של קומפלקס ליגנד מתכת. לאחר מכן, הוסיפו כמות סטויכיומטרית של פפטיד לתמיסה המורכבת מנחושת-פן והעבירו אותה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב היטב, תוך הקפדה שלא להכניס בועות אוויר.
לאחר מכן, דגירה של הפתרון במשך חמש דקות כדי להגיע לשיווי משקל. החזירו את הקובט למחזיק תא הדגימה ותעדו את ספקטרום הקליטה. מאוחר יותר, חזור על הוספת אליקוטים פפטידיים לתמיסה המורכבת של נחושת-פן עבור מקבילות שונות, ורשום את נפח הפפטיד שנוסף כך שניתן יהיה לקבוע את הריכוז המדולל.
תחילה הפעל את ה- ITC והפעל את תוכנת ה- ITC כדי להפעיל את המכשיר. לאחר האתחול הראשון, rehome את burette ופעל לפי ההוראות על המסך. לאחר מכן הסר את הבורט ואת הכיסוי מתא ההפניה.
לאחר מכן, הסר כל מים מתא הייחוס ושטוף שלוש פעמים עם 450 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד. לאט לאט לשאוב מים טהורים במיוחד עד סימן 450 microliters של מזרק העמסה נזהר לא להכניס בועות אוויר לתוך המזרק. לאחר מכן הכנס את מזרק הטעינה לתא הייחוס עד שהוא נמצא בערך מילימטר אחד מלמטה והזריק לאט חלק מהתמיסה עד שיישארו 150 מיקרוליטרים במזרק הטעינה.
לאחר מכן, הזיזו את בוכנת מזרק הטעינה במהירות למעלה ולמטה בכ-25 מיקרוליטרים מספר פעמים כדי לנתק את כל הבועות על פני התא. לאחר מכן מזריקים באיטיות עד שהבוכנה מגיעה לסימן 100 המיקרוליטרים על מזרק ההעמסה, ובכך מחלקים בסך הכל 350 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד לתוך תא הייחוס ומחליפים את כיסוי תא הייחוס. לאחר הסרת כל תמיסה שיורית מתא הדגימה, טען 450 מיקרוליטרים של EDTA 10 מילימולרי באמצעות מזרק טעינה והשרו במשך 10 דקות כדי להבטיח שיוני מתכת עקבות יוסרו מכיוון שה- EDTA יקשור מתכות קורט.
לאחר הסרת תמיסת EDTA יש לשטוף היטב את מזרק ההעמסה בכמויות גדולות של מים טהורים במיוחד. נקו את ה-ITC בהתאם להוראות היצרן על ידי שטיפת תא הדגימה במים טהורים במיוחד. הסר את שאריות המים מתא הדגימה ולאחר מכן התנאי את תא הדגימה על ידי שטיפה עם 450 מיקרוליטר של חיץ לפחות שלוש פעמים.
לאחר מכן, הסר את המאגר השיורי המתנה את תא הדגימה וטען את תמיסת הפפטיד לתא הדגימה באמצעות מזרק הטעינה. לאחר מכן לשטוף את מזרק טיטרציה עם 200 microliters של תמיסה buffered על ידי הסרת הבוכנה הראשונה. באמצעות מיקרו פיפטה, פיפטה את תמיסת החיץ דרך החור בחלק העליון של מזרק טיטרציה זכוכית דרך המזרק החוצה את המחט למטה.
מאוחר יותר, הכנס באופן מלא את הבוכנה לתוך מזרק טיטרציה. לאחר מכן טבלו את קצה מחט מזרק הטיטרציה בתמיסת המתכת ומשכו באיטיות את הבוכנה כלפי מעלה וגרמו לתמיסת המתכת למלא את המזרק וכתוצאה מכך נוצר נפח ריק בחלק העליון של חלק הזכוכית של מזרק הטיטרציה. כדי להסיר את עוצמת הקול הריק סובבו את מזרק הטיטרציה במקביל לרצפה.
לאחר מכן הסר את הבוכנה והטה מעט את חלק הזכוכית לכיוון הרצפה. נערו בעדינות את מזרק הטיטרציה כך שהתמיסה תעבור לחלק הכוס של מזרק הטיטרציה ותמלא את רוב נפח החלל. אבל להבטיח כי שניים עד שלושה microliters של נפח ריק להישאר.
תוך שמירה על המזרק במקביל לרצפה מכניסים מחדש את הבוכנה. לאחר מכן החזק את מזרק הטיטרציה זקוף וטבול את קצה המחט בחזרה בתמיסת המתכת. לאחר מכן, דחפו את הבוכנה כלפי מטה עד שהאוויר חדל לצאת מהמחט והעמיסו את מזרק הטיטרציה על ידי משיכה איטית של הבוכנה עד קצת מעל סימן 50 המיקרוליטרים תוך שמירה על קצה המחט בתמיסה.
מכניסים בזהירות את חלק הזכוכית של מזרק הטיטרציה לתוך הבורט ומבריגים עד שהאצבע מתהדקת. לאחר מכן, באמצעות מגב עדין קל לספוג את התמיסה שיוצאת ממזרק הטיטרציה עקב דחיסה של הבוכנה מבלי לגעת בקצה המחט. לאחר מכן, הכנס את הבורט עם מזרק טיטרציה לתוך תא הדגימה ומהדק אותו היטב.
כדי להגדיר את הפרמטרים של תוכנת ITC, בחר את בקרת מכשירים. קובעים את קצב הערבוב ואת הטמפרטורה. לאחר מכן, תחת פרטי ניסוי, הזן את המזרק ואת ריכוזי התאים ביחידות מילימולריות.
לאחר מכן, בסעיף שיטת ניסוי בחר טיטרציה מצטברת. לחץ על התקנה וציין 20 זריקות של 2.5 מיקרוליטר ואם נדרשת רזולוציה נוספת כדי לצפות באירוע הכריכה הגדל את מספר ההזרקות והקטנת הנפח בכל הזרקה. לאחר מכן, הזן את מרווח הזמן בין כל זריקה כך שיהיה ארוך מספיק כדי שהאות יתאזן ויחזור לקו הבסיס, בדרך כלל 300 שניות.
לאחר מכן לחץ על הפעלה לחצן כדי להתחיל את הניסוי ולציין היכן הנתונים נשמרים. טיטרציה של Cu(II) בוצעה לתוך C-פפטיד המדגימה כי תוספת של 150 מיקרומולר של Cu(II) גרמה לעלייה מיידית בפס ב-600 ננומטר המיוחסים לפס d-d של Cu(II) והמשיכה לגדול עד שנוספו 300 מילימולר Cu(II). תוספת נוספת מעל 300 micromolar Cu(II) לא הגדילה את ספיגת איסור ה- d-d המציין רוויה וכי Cu(II) נקשר ל- C-פפטיד בקומפלקס 1:1 עם ערך לוג K של יותר משישה.
C-פפטיד צויר לכ-10 מיקרומולר נחושת-פן קומפלקס והספיגה מפס העברת המטען ב-265 ננומטר פחתה, מה שמצביע על כך שה-C-פפטיד היה מסוגל לבצע chelate Cu(II) מהליגנד של פננתרולין עם ערך לוג K של 7.4 עד 7.8. התרמוגרמה של ITC מראה את הטיטרציה של 1.4 מילימולאר Cu(II) לתוך 154 מיקרומולר C-פפטיד במאגר MOPS של 15 מילימולר. נמצא כי זיקת הקשירה היא בעלת ערך לוג K של שמונה עם שינוי באנתלפיה כ-8 קילו-ג'ול לכל שומה.
גיבס אנרגיה חופשית כמינוס 46 קילו-ג'אול לכל שומה, ושינוי באנטרופיה כ-120 ג'אול לכל שומה לכל קלווין. טיטרציה מבוקרת של 1.4 מילימולאר Cu(II) לתוך חיץ MOPS של 15 מילימולר בהיעדר C-פפטיד לא מראה שום קשירה בתרמוגרמה. הייתי אומר לוודא שהכל נקי.
אם נשארו יוני מתכת או פפטידים מניסויים קודמים, זה יכול להשפיע באופן דרסטי על הסטויכיומטריה ולספק תחרות לא ידועה בניסויי הקשירה. דיכרואיזם מעגלי הוא שיטה נוספת לחקור אינטראקציות בין פפטידים מתכתיים או חלבונים מתכתיים מכיוון שהוא מסתכל על כיראליות. ספקטרומטריית מסות יכולה גם לחקור את הקומפלקסים האלה על ידי התבוננות בשינויים במסה.
קבוצה זו של טכניקות שימשה מעבדות רבות החוקרות יוני מתכת המקיימים אינטראקציה עם פפטידים או חלבונים.
