המחברים רוצים להכיר את החוג לביולוגיה באוניברסיטת סירקיוז, ד&quot;ר מרילין קר עבור תפקידם בממשל של הקורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה. המעבדה Albertson נתמך על ידי מענק R21DE019223 מן המכון הלאומי לבריאות / המכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial, וכן מענק R01AG031922 מן המכון הלאומי לבריאות / המכון הלאומי להזדקנות.

<ol>
	<li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton.">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li><li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7,+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome.">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li><li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain.">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li><li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain.">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li><li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ Hybridization: Laboratory Companion. , (2003).</li><li>D'Costa, A., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+development+and+genetics:+Introducing+undergraduates+to+developmental+biology+and+genetics+in+a+large+introductory+laboratory+class.">Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class.</a> Zebrafish. 6, 169-177 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , (2010).</li><li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+limb+organogenesis.">Wnt signaling in limb organogenesis.</a> Organogenesis. 4, 109-115 .</li><li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+somite+development.">Wnt signaling in somite development.</a> Ann Anat. 190, 208-222 .</li><li>Huelsken, J., Behrens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+signaling+pathway.">The Wnt signaling pathway.</a> J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).</li><li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos.">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li><li>Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+function+of+deltaC+and+her7+in+anterior+segment+formation.">Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation.</a> Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).</li><li>Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., L&#243;pez, S., Paganelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs.">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).</li><li>Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+is+mutated+in+zebrafish+acerebellar+(ace)+mutants+and+is+required+for+maintenance+of+midbrain-hindbrain+boundary+development+and+somitogenesis.">Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis.</a> Development. 125, 2381-2395 (1998).</li><li>Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+differential+gene+expression+in+zebrafish+to+teach+basic+molecular+biology+skills.">Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills.</a> Zebrafish. 6, 187-199 (2009).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , (2008).</li><li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somite+development+in+zebrafish.">Somite development in zebrafish.</a> Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).</li><li>Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+zebrafish+MyoD+in+wild-type,+no+tail+and+spadetail+embryos.">Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos.</a> Development. 122, 271-280 (1996).</li><li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish.">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מאחלים שימש קורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה מעבדה כדי לסייע לתלמידים להבין את התפקידים של הגנטיקה בפיתוח אנטומי באמצעות ויזואליזציה של דפוסי ביטוי גנים ידועים. בחלק הראשון של הקורס, התלמידים ביצעו והניתוחים על אורגניזמים המייצגים chordate כמה מינים שונים, ומאפשר להם מספיק זמן ללמוד, להבין, להשוות, ו - חוליות האנטומיה הניגוד. כהקדמה לחלק השני של הקורס, הסטודנטים קיבלו הרצאה רשמי המתאר פיתוח דג הזברה אנטומיה. השיטות ואת התוצאות הצפויות של הניסוי מאחלים נדונו גם. הסטודנטים קיבלו אז דג הזברה לחיות somitogenesis ודקדקן-6 שלבים של התפתחות, ועל הפריה ימים 2 ו - 5 לתגובה (DPF) לבדוק תחת מיקרוסקופ לנתח. זה היה כדי לתת לתלמידים הבנה טובה יותר של מה עוברי דג הזברה נראית כמו וסוגי שינויים מורפולוגיים המתרחשות על פני ontogeny. בפגישה הבאה מעבדה, סטודנטים קיבלו עוברי דג הזברה שבה מאחלים נעשו בעבר. הם התבקשו ללמוד לתאר את דפוסי ביטוי גנים עבור כל גן של עניין (riboprobe בשימוש). עוברים המשמש מאחלים נגזרו הזדווגויות בין חברי קו ace/fgf8a הטרוזיגוטיים. על סמך ירושה מנדל, 25% עוברים מן ההזדווגויות ace/fgf8a היו אמורים להיות מוטנטים הומוזיגוטים ו להציג פגמים רבים של מבנים אנטומיים התמקדה בקורס זה. על פי דיווחים שפורסמו ותצפיות פורסם במעבדה Albertson, מומים במוח looping לב לא תקין היו צפויים, כמו גם ליקויים somites (Brand et al, 1996;. Albertson ו Yelick, 2005; תצפיות אישי). הסטודנטים התבקשו לבדוק את כל דגימות, סוג בר (בעלי חיים הטרוזיגוטיים הם נבדלים אחים סוג בר בשלבים המוקדמים של הפיתוח) לבין מוטציות הומוזיגוטים, עבור כל תבנית ביטוי הגן הציגו. לאחר מכן הם התבקשו לכתוב דוחות מעבדה לתאר את התוצאות שלהם, ועל סמך הידע שלהם באנטומיה גנטיקה, ביטוי גנים פגומים איך ייתכן זירז מומים אנטומיים. סטודנטים נראה לקבל את התרגיל מעבדה בהתרגשות ובסקרנות. רובם לא השתמשו מאחלים לפני התעניינו מאוד בחלק הזה של הקורס. הסטודנטים מצאו את דפוסים שונים של ביטוי גנים העוברים דג הזברה מסקרן, חלקם אף תיארו את דפוסי מכתים דמיינו ידי שיוך אותם עם הידוע עיצובים וסמלים, כמו פרצוף מחייך. דוחות מעבדה וכתוצאה מכך הראו התלמידים היו הבנה כללית של פרוטוקול מאחלים ואת הביטוי של גנים במבנים אנטומיים ספציפיים. התלמידים נדרשו גם להבין את פונקציות ספציפיות של גנים שנבדקו באמצעות מאחלים במהלך (Stickney et al, 2000 במעבדה;. Huelsken et al, 2002;. קומאראסינגות-Loganathan et al, 2008a,.. קומאראסינגות-Loganathan et al, 2008b ). היה ברור עם זאת, כי תלמידים מסוימים היה ידע מוגבל רקע של מסלולי איתות וגנים של עניין. מידע נוסף על מושגים אלה, מאחלים הרצאת מבוא עשוי להיות תוספת ברוכה השימוש מאחלים בעתיד קורסים ביולוגיה השוואתי החולייתנים. מאז פרוטוקול בדרך כלל לוקח ארבעה ימים רצופים, תלוי בלוח הזמנים של הקורס, התלמידים יכולים רק להיות מסוגל להשלים חלק בניסוי בכיתה המורה חייב להיות אחראי על שאר. בשיעור ביולוגיה חוליות השוואתי שלנו, התלמידים סיימו את התגובות מכתים במעבדה, ואילו עוזר הוראה לבצע את כל השלבים הקודמים. אם הוא מעדיף את התלמידים לבצע מאחלים בכיתה, פרוטוקול ניתן לחלק את יחידות משנה שניתן לבצע על מפגשי מעבדה מספר, תלוי במסגרת הזמן של הכיתה. אם זה לא ריאלי עבור התלמידים לבצע את הפרוטוקול כולו, כפי שהיה כאן בגלל הפגישה במעבדה רק פעם בשבוע, סטודנטים יכולים להוסיף את הפתרון מכתים בתחילת בכיתה, בהתאם riboprobe בשימוש, יש מכתים המלא בתוך שעה. הזמן שלוקח את הכתם לפתח משתנה מאוד עם כל riboprobe ועוד מגוון של תנאי הניסוי, ויש קבוע מראש לפני השיעור. יש לציין, אם התלמידים יהיה רק ​​לפתח את הכתם במעבדה, מדריכים יהיה אחראי על כל השלבים הקודמים, וזה ידרוש זמן ומאמץ משמעותיים מחוץ לכיתה. אם תרצה, חלופה קצרה לאחל יכול להיות אימונוהיסטוכימיה, באמצעות תוויות נוגדן לדמיין לוקליזציה חלבון, אולם בשלב זה, דג הזברה נוגדנים ספציפיים עבור גנים התפתחותיים אינם זמינים. אפשרות נוספת תהיה לבצע מאחל בעלי החוליות השונותnd יש לתלמידים להשוות את דפוסי הביטוי של אותם גנים באורגניזמים שונים (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. אורגניזמים דגם מתעוררים, 2008; אורגניזמים דגם מתעוררים, 2010). מטרת העל של שימוש משאלה קורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה היה כדי להדגים לתלמידים איך בשיטות ביולוגיות מולקולריות משמשים במחקר ופיתוח אנטומי. היא גם סיפקה הזדמנות לתלמידים לשער, כיצד שינו ביטוי גנים עשויה להוביל לא רק מומים התפתחותיים, אלא גם שינוי אבולוציוני. פורמלית כמו בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית (המכונה לעתים קרובות &quot;Evo-Devo&quot;), שדה זה הולך וגדל במהירות של המחקר נועד לקשר גנוטיפ לבין פנוטיפ באמצעות פיתוח, וכדי להבהיר בסיסים מכניסטית פוטנציאל של שינוי אבולוציוני. עם עלייתו של תחום זה, אקולוגים יותר, ביולוגים האורגניזם, ו פיזיולוגים הם שימוש בטכניקות מולקולריות במחקר שלהם. אנו טוענים כי השימוש משאלה קורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה יעזור לשמור על תוכנית הלימודים מעודכן עם ההתקדמות הטכנולוגית והמושגית הנוכחית המחקר, כדי להקל על היישור האופקי יותר קורסים בביולוגיה ברמה העליונה על ידי שילוב של תת תחומים ביולוגיים. יתר על כן, גישה אינטגרטיבית זו תספק לסטודנטים הזדמנות ללמוד מגוון של טכניקות מחקר ביולוגי במהלך אחד, המוביל השכלה מגוונת יותר וקידום המחקר המדעי בעתיד תחומית.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוד לחץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרו צנטריפוגות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 37 ° C אינקובטור (עם מטרף) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ° C מיקרו צנטריפוגות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים באמבטיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל אלקטרופורזה מנגנון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -20 ° C במקפיא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -80 ° C במקפיא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Rocker / שייקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ° C מקרר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ הביתור (רצוי עם מסך הוראה או מצלמה) </li></ul>

using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology

הר שלמים הכלאה באתרו (בכך) היא טכניקה נפוצה במעבדות הביולוגיה המולקולרית בשימוש ללמוד ביטוי גנים באמצעות לוקליזציה של תעתיקי mRNA ספציפי בתוך הדגימה הר שלם. טכניקה זו (עיבוד Albertson ו Yelick, 2005) שימש במפלס העליון השוואתי ראשון בכיתה חוליות מעבדה לביולוגיה באוניברסיטת סירקיוז. הראשונה שני שלישים של הקורס החולייתנים השוואתית במעבדה לביולוגיה נתן לסטודנטים הזדמנות ללמוד את אמבריולוגיה ואנטומיה ברוטו של אורגניזמים שונים המייצגים מינים שונים chordate בעיקר באמצעות חתכים המסורתית ושימוש במודלים. החלק הסופי של הקורס מעורב גישה חדשנית ללימוד אנטומיה באמצעות תצפית של התפתחות החולייתנים שימוש בטכניקות מולקולריות שבה מאחלים בוצעה על עוברי דג הזברה. פיברובלסטים הטרוזיגוטיים גורם הגדילה 8 קו (fgf8a) מוטציה, אס, היה בשימוש. בשל ירושה מנדל, אס intercrosses סוג בר הפיק, הטרוזיגוטיים, ו הומוזיגוטים מוטנטים ace/fgf8a ביחס 01:02:01. בדיקות RNA עם דפוסי הביטוי הידוע קו האמצע לבין בפיתוח מבנים אנטומיים כגון הלב, somites, tailbud, myotome, והמוח היו בשימוש. מאחלים בוצעה באמצעות דג הזברה ב somite 13 ו חסודה-6 שלבים, עם התלמידים מבצעים את התגובה מכתים בכיתה. המחקר של עוברי דג הזברה בשלבים שונים של פיתוח נתן לסטודנטים את היכולת לבחון כיצד אלה מבנים אנטומיים השתנה במשך ontogeny. בנוסף, חלק מוטנטים ace/fgf8a מוצג looping לב לא תקין, ועל פגמים somite והתפתחות המוח. הסטודנטים במעבדה זו צפו התפתחות תקינה של מערכות איברים שונים הן באמצעות האנטומיה חיצוניים, כמו גם דפוסי ביטוי גנים. הם זיהו גם ותיאר עוברים הצגת התפתחות אנטומית גן תקין הביטוי (כלומר, מוטציות המשוערת). למדריכים במוסדות כי עדיין אין את הציוד הדרוש או שם כספים עבור המעבדה לחדשנות הלימודים מוגבלים, העלות הכספית של ריאגנטים המנגנון עשוי להיות גורם לשקול, כמו את הזמן והמאמץ הנדרש יהיה על החלק של מאמן ללא קשר להגדרה. עם זאת, אנו טוענים כי השימוש מאחלים זה סוג של הגדרה מעבדה בכיתה יכולים לספק חוליה חשובה בין גנטיקה התפתחותית ואנטומיה. עם התקדמות הטכנולוגיה ואת היכולת ללמוד התפתחות האורגניזם ברמה המולקולרית נעשה קל יותר, זול יותר ויותר פופולרי, ביולוגים אבולוציוניים רבים, אקולוגים, ו פיזיולוגים פונים אסטרטגיות ומחקר בתחום הביולוגיה המולקולרית. שימוש משאלה כיתה חוליות השוואתי ביולוגיה מעבדה היא דוגמה אחת כיצד מולקולות האנטומיה יכול להתכנס בתוך קורס בודד. זה נותן העליון סטודנטים ברמה הזדמנות לתרגל טכניקות מודרניות במחקר ביולוגי, המוביל השכלה מגוונת יותר וקידום המחקר המדעי בעתיד תחומית.

Watch this Scientific Journal Video about Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology at JoVE.com

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

שלמה הר<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (בכך) שימש במפלס העליון כמובן השוואתי ראשון בביולוגיה חוליות בנוסף חוליות והניתוחים. זה נתן לסטודנטים הזדמנות ללמוד דפוסי ביטוי גנים כמו גם האנטומיה ברוטו, המקשר את לימודי הביולוגיה המולקולרית בתוך האורגניזם במהלך אחד.

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

using-whole-mount-situ-hybridization-to-link-molecular-organismal

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

21.5K Views.  Syracuse University. שלמה הר באתרו הכלאה (בכך) שימש במפלס העליון כמובן השוואתי ראשון בביולוגיה חוליות בנוסף חוליות והניתוחים. זה נתן לסטודנטים הזדמנות ללמוד דפוסי ביטוי גנים כמו גם האנטומיה ברוטו, המקשר את לימודי הביולוגיה המולקולרית בתוך האורגניזם במהלך אחד.

Video: Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...