ברצוננו להכיר את תרומתם של Dörthe Jülich, ג&#39;ניפר עגול ואנדרו מארה בפיתוח פרוטוקול זה. מחקר תמיכה הניתנים על ידי NICHD, האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן ואת מצעד הפרוטות.

1. קיבעון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן עוברים לילה ב 4 ° C עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לתקן ולשטוף 2 x PBS, 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים dechorionate ידני PBS בצלחת זכוכית דיכאון באמצעות מלקחיים שען. לאחר dechorionation, העוברים מועברים באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר כיוון שהם עלולים לדבוק pipettes פוליפרופילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים דרך סדרה של 25%, 50% מתנול 75% PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלפת נוזל עם 100% מתנול, דגירה 5 דקות ולאחר מכן להחליף עם מתנול טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בו עוברים -20 ° C למשך תקופה מינימלית של שעה אחת. (אנחנו בדרך כלל לדגור העוברים בין לילה. רגיל ב הכלאה באתרו יעבוד על עוברי מאוחסן במשך יותר משנה, אבל אנחנו לא בחנו אם ברזולוציה גבוהה של ניאון הכלאה באתרו הוא איבד ידי אחסון ממושך.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברים במשך 5 דקות כל אחד 75%, 50% מתנול 25% PBST ב RT. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBST ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן שוב למשך 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBST ב RT. </li></ol> הערה לגבי PFA: אנו מאחסנים PFA 4% aliquots ב -20 º C (ראה טבלה של ריאגנטים). עבור קיבעון הראשוני, אנחנו רק להשתמש PFA שלא הופשר קודם לכן. עבור הקיבועים הבאים, אנו מרבים להשתמש PFA כי הופשר קודם לכן. קיבוע ראשוני נראה קריטי עבור מכתים מוצלחת עם פרוטוקול זה. 2. Proteinase AND POSTFIXATION <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר עם proteinase K (5μg/ml ב PBST) בשעה RT במשך 3 עד 12 דקות כדי permeabilize את העוברים. (זמן הדגירה תלוי בגילו של עוברים כמו שלבים צעירים רגישים יותר. זה גם תלוי אצווה של האנזים.) לקבלת עוברים שלב somitogenesis, אנחנו בדרך כלל permeabilize במשך 3-4 דקות. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בקצרה PBST ולשטוף פעם במשך 5 דקות בתוך PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן שוב למשך 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד, PBST ב RT. </li></ol> 3. PREHYBRIDIZATION <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים במשך 5 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות ב-HYB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prehybridize ב-C º 65 במשך שעה לפחות 1 ב HYB +. </li></ol> 4. הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל אבל 50 μl של preHYB, אך הקפד לשמור את העוברים שקוע לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1-2 μl של כל riboprobe (digoxygenin ו והעמסת שכותרתו riboprobes) על ידי עוברי ומערבבים בעדינות מצליף את הצינורית. כמות בדיקה הוא בדרך כלל 1-2μl מ תגובה בדיקה 20μl סינתזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתחשב בכך והעמסת הוא רגיש לאור, צינורות יש לעטוף בנייר אלומיניום או אחרת חשוף לאור מינימלי מרגע זה והלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים לילה בשעה 65 º C. </li></ol> 5. בדיקה הסרת ראוי לציין, כי הפתרונות של חומר ניקוי זה חוסר קדימה נקודה. ביעור של חומר ניקוי מופיעה לעזור התגובות מכתים אך גורם העוברים להיות דביק למדי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את riboprobe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 x 30 דקות ב-C º 65 ב formamide/2xSSC 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות ב 2 x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במשך 30 דקות 65 מעלות צלזיוס ב 0.2 x SSC. </li></ol> 6. אנטי נוגדנים והעמסת הדגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום במשך שעה לפחות 1 ב RT ב 500μl של פתרון של חיץ 1x חומצה maleic בתוספת 2% ריאגנט חוסם (ראה טבלה של ריאגנטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנוגדן אנטי והעמסת-POD, כפי שסופק על ידי חברת רוש, בדילול 1:500 בפתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה ב 4 º C. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי 4 x 20 דקות חיץ 1x חומצה maleic. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBS. </li></ol> 7. זיהוי של בדיקה והעמסת-מדביקים לו תווית של <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 30-60 דקות פתרון ה-TSA והעמסת פלוס. (ספין למטה המצע TSA לפני קבלת פתרון מכתים. עבור התגובה, לדלל מגיב tyramide 1:50 במאגר פרקין אלמר diluent הגברה.) במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. זמן התגובה צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל בדיקה. למרבה הצער, התגובה מכתים לא ניתן לנטר חזותית כמו המצע הוא פלורסנט, ואחד יראה פלואורסצנטי ירוק בכל מקום ברחבי התגובה מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במשך 10 דקות כל אחד 30%, 50%, 75% ו 100% מתנול ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתמיסה של 1% H 2 0 2 מתנול במשך 30 דקות כדי להשבית peroxidase הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי 10 דקות כל אחד 75%, 50% ו - 30% מתנול PBS. לאחר מכן לשטוף פעמיים במשך 10 דקות כל אחד PBS. חשוב שכל נפגשוhanol להסירו. </li></ol> הערות על הגברה האות TYRAMIDE: We have been באמצעות פרקין אלמר ערכות ה-TSA. אנו מוצאים כי Alexa-Tyramide מצעים כתם גם באמצעות פרקין אלמר diluent חיץ הגברה, אבל אנחנו לא נחלו הצלחה באמצעות חיץ מכתים מסופק עם ערכות בדיקות Invitrogen / מולקולרית. לבסוף, מצאנו כי Cy5 הקרינה מסולק על ידי טיפול שלאחר מכן מתנול / H 2 O 2 ואילו והעמסת Alexa ו-647 אינם מושפעים. Cy3 עשוי גם להיות מושפע לרעה את הטיפול מתנול / H 2 O 2 כפי שהוא קשור מבנית Cy5. מסיבה זו, Cy3 ו Cy5 תגובות TSA יש להשתמש רק עבור התגובה מכתים השני ניאון כפול פרוטוקול באתרה. 8. אנטי Digoxygenin נוגדן הדגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את העוברים שוב במשך שעה לפחות 1 ב RT בתמיסה של חיץ 1x חומצה maleic בתוספת 2% ריאגנט חוסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנוגדן אנטי DIG POD כפי שסופק על ידי רוש בדילול 1:1000 ב לעיל חסימת פתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה ב 4 º C. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי 4 x 20 דקות חיץ 1x חומצה maleic. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBS. </li></ol> 9. זיהוי של בדיקה Digoxygenin-מדביקים לו תווית של <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 30-60 דקות TSA פלוס Cy5 פתרון (ספין למטה המצע TSA לפני קבלת פתרון מכתים. עבור התגובה, לדלל מגיב tyramide 1:50 במאגר diluent הגברה) במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. זמן התגובה צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל בדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד PBST. </li></ol> 10. PROPIDIUM מכתים יודיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל 2 x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס 50 μl 2 x SSCT עם 10 RNAse μl (ריכוז סופי של 100μg/ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שש פעמים במשך 3 דקות כל אחד 2 x SSC ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עוברים במשך 8 דקות בתמיסה של יודיד propidium 330μg/ml ב 2 x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שש פעמים במשך 3 דקות כל אחד 2 x SSC ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד, PBST ב RT. </li></ol> 11. הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים במשך 10 דקות כל אחד 25% גליצרול ו 50% PBST. נקה לילה גליצרול 75% ב 4 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו מחלקים את העוברים ואת deyolk ושטוח הר אותם בשקופית מיקרוסקופ. החלמון יכול לייצר הקרינה רקע משמעותי. Dissection הרבה יותר קל אחרי העוברים ניקית ovenight ב gylcerol. </li></ol> פתרונות: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> PBST </td><td> PBS פלוס 0.1% Tween </td><td></td></tr><tr><td> SSCT </td><td> SSC פלוס 0.1% Tween </td><td></td></tr><tr><td> HYB- </td><td> 50% לפוראמיד 5xSSC 0.1% Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> HYB + </td><td> HYB- 5mg/ml torula (שמרים) RNA 50μg/ml הפרין </td><td style="width: 300px;"> RNA torula מוכן ידי עיכול K proteinase של רנ&quot;א עם פנול, לאחר מכן, פנול, כלורופורם, ו כלורופורם extraction.The-RNA הוא זירז ו מומס במים DEPC שטופלו. </td></tr><tr><td> 1 x חיץ חומצה maleic </td><td> 150mm חומצה maleic, NaCl 100mm (pH 7.5) </td><td></td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1229/Brend_Holley_Fig1.png" alt="איור 1" width="600" height="688" /> באיור 1. תוצאות נציג הר שלם פלורסנט כפול הכלאה באתרה. (AC). תמונות להראות קטע confocal יחיד דרך האזור האחורי של עובר דג הזברה בשלב עשר somite. הנוף הגב עם הקדמי למעלה. מוכתם גרעינים עם יודיד propidium הם בצבע כחול. (א) mRNA deltaC זוהה באמצעות riboprobe digoxygenin שכותרתו ו-TSA Cy5 מגיב. (ב) mRNA עיבד מן הגן her1 זוהה עם riboprobe והעמסת שכותרתו ו-TSA והעמסת מגיב. (ג) תעלות מיזוג ירוק ואדום באופן חד משמעי מזהה אזורים של ביטוי גנים שונים או חופפים של שני גנים. (D, E) פירוט הביטוי her1 הוכחת ברזולוציה גבוהה של הליך זה. לוקליזציה subcellular של mRNA ניתן להבחין בבירור. ראשי חץ להצביע על תא מציג שעתוק פעיל, חשף ידי נקודות של מכתים בגרעין. החצים מצביעים על התא המציג לוקליזציה cytoplasmic של mRNA. (F, G) מכתים פעמיים עבור her1 ו deltaC מגלה התאים לתעתוק שני גנים (חץ לבן), או גן או בנפרד (ראשי חץ אדום וירוק).

<ol>
	<li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo.">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish.">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li><li>J&#252;lich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming,+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC.">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li></ol>

הפרוטוקול המובא כאן עובד היטב עם בדיקות שנותנות איתות חזק נקי לאחר מכתים עבור 30-45 דקות phosphatase בתיווך אלקליין טיפוסי התגובה. לפני ביצוע פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו, אנחנו תמיד לבדוק בדיקות שלנו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שאינו ניאון (בתנאי בחומר משלים יחד עם פרוטוקול סינתזה בדיקה). היו לנו פחות הצלחה עם פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו כאשר באמצעות בדיקות חלש, אבל זה עשוי להיות אפשרי במקרים מסוימים. יש לנו שילוב בהצלחה ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו עם immunolocalization של β-catenin 3. בעת ביצוע וריאציה זו, אנחנו עושים את HYB-, HYB + ו incubations הכלאה על 55 מעלות צלסיוס במקום 65 מעלות צלזיוס כפי epitopes מופיעים להישמר טוב יותר בטמפרטורה נמוכה יותר. Incubations immunolocalization המבוצעות לאחר התגובות TSA. מאחר והעמסת שכותרתו בדיקות בדרך כלל חלש יותר בדיקה-digoxygenin שכותרתו עבור אותו הגן, אנחנו בדרך כלל לדמיין את החללית והעמסת שכותרתו הראשון. מקרה אחד שבו אפשר היה רוצה לדמיין את החללית digoxygenin הראשון הוא אם אחד משני הגנים מתבטאת ברמה נמוכה. במקרה זה, אחד עושה digoxygenin-riboprobe עבור הגן חלש כתמים על זה קודם כדי למקסם את האות לרעש. שים לב שאם אתה לדמיין השנייה בדיקה והעמסת, אתה לא צריך לדמיין את החללית digoxygenin עם והעמסת TSA כמו נוגדן אנטי והעמסת תכיר TSA את הכתם כמו גם riboprobe והעמסת שכותרתו.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>15710</td>
<td>Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Proteinase K, recombinant PCR grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>03115879001</td>
<td>Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11096176001</td>
<td>Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at &#x2013;20&deg;C. Stable over multiple freeze/thaws.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426346910</td>
<td>Aliquot and store at -20&deg;C. Keep one working aliquot at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11207739910</td>
<td>As above.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Fluorescein system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL741001KT</td>
<td>Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60&mu;l DMSO. Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine5 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL745001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine3 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL744001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>T20926</td>
<td>Dissolve tyramide reagent in 150&mu;l DMSO, aliquot and store at &#x2013;20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase, DNase free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11119915001</td>
<td>Supplied as 500&mu;g/ml solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>P-3566</td>
<td>Supplied as 1mg/ml solution in water.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization

שלמה הר<em&gt; באתרו</emהכלאה&gt; היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה כפול פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה פרוטוקול לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. הפרוטוקול הוא גירסה שונה של תקן<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה באמצעות phosphatase אלקליין מצעים כגון NBT / BCIP ומהירה האדום<sup&gt; 1,2</sup&gt;. פרוטוקול זה מנצל תקן digoxygenin והעמסת בדיקות שכותרתו יחד עם הגברה אות tyramide (TSA)<sup&gt; 3</sup&gt;. ערכות זמינים מסחרית TSA לאפשר עיצוב ניסיוני גמישה כמו פליטת הקרינה מירוק עד אדום ניתן להשתמש בשילוב עם כתמים גרעיני שונים, כגון יודיד propidium, או אימונוהיסטוכימיה הקרינה של חלבונים. TSA מייצרת המצע פלורסנט תגובתי כי במהירות קוולנטית נקשר moieties, שאריות טירוזין בדרך כלל, בסביבה הקרובה של riboprobe antisense שכותרתו. דפוסי מכתים וכתוצאה מכך הם ברזולוציה גבוהה בלוקליזציה כי subcellular-mRNA ניתן לצפות באמצעות לייזר מיקרוסקופיית confocal<sup&gt; 3,4</sup&gt;. אפשר לצפות תמלילי המתהווה על לוקוסים כרומוזומליות, להבדיל מכתים גרעיני cytoplasmic ולדמיין דפוסים אחרים כגון בלוקליזציה קליפת המוח של mRNA. מחקרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עולה כי כ 70% mRNAs התערוכה דפוסים ספציפיים של לוקליזציה subcellular כי לעתים קרובות לתאם עם הפונקציה של החלבון המקודד<sup&gt; 5</sup&gt;. בשילוב עם שחזור בעזרת מחשב של מערכי נתונים confocal 3D, פרוטוקול שלנו מאפשרת ניתוח מפורט של חלוקת mRNA עם רזולוציה משנה הסלולר עוברי החולייתנים כולה.

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization at JoVE.com

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

zebrafish-whole-mount-high-resolution-double-fluorescent-situ

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

23.1K Views.  Yale University. הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגי?...

Video: Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...