שיטה זו יכולה לסייע בחקר ההתפתחות המוחית האנושית המוקדמת וכיצד היא עשויה להשתנות בהפרעות נוירופסיכיאטריות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא יצירת תאי המוח הקטן האנושיים המוקדמים מבחינה התפתחותית במבנה שכבה דו-ממדי מבלי לבצע שלבים מסובכים. זה גם חסכוני.
הכנת פיפטות משיכה יכולה להיות מסובכת בהתחלה, אך עם תרגול וזמן, קל יותר למשוך את הפיפטות באופן שיהיה קל יותר לעבוד איתו. התחילו את ההכנה הניסיונית על ידי משיכת פיפטה פסטר באורך 22.9 ס"מ כשני סנטימטרים מתחת לצוואר, מעל מבער הבונזן כדי ליצור שתי פיפטות זכוכית. הצד הדק יותר יהיה קצר בכארבעה סנטימטרים מהצד השני.
כופפו את קצות הצד המשוך על הלהבה כדי ליצור R חלק, ואז הניחו את הפיפטות הנמשכות בשרוולים של אוטוקלאב ועקרו אותן באוטוקלאב. ביום אפס, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום התמיינות המוח הקטן בתוספת 10 מיקרומולר Y-27632 ו- SB-431542 לכל באר של שש בארות חיבור אולטרה-נמוך, או ULA, צלחת, והניחו אותו באינקובטור עד שהמושבות המורמות מוכנות להוספה לבארות. נקו את התאים הממוינים באמצעות פיפטה מזכוכית משוכה.
שאפו את המדיום והוסיפו מילימטר אחד של תמיסת מעבר iPSC עבור כל צלחת של 35 מילימטר. לאחר שלוש דקות של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, שאפו את המדיום והוסיפו שני מילימטרים של מדיום התמיינות המוח הקטן בתוספת 10 מיקרומולר Y-27632 ו-SB-431542 תחת הגדלה 4x של מיקרוסקופ הפוך של אור מועבר, הרימו את המושבות באמצעות הקצה הכפוף של פיפטה הזכוכית הנמשכת. לאחר הרמת כל מושבה, העבירו בעדינות את כל המושבות לבאר אחת מתוך צלחת ULA בעלת שש הבארות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר.
חזור על תהליך זה עבור כל צלחת iPSC ודגירה של התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ביום השני, הוסיפו FGF2 לכל באר כדי להתאים ריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר. ביום השביעי, לשנות שליש מהמדיום על ידי שאיפה מיליליטר אחד של בינוני בילה ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום הבחנה cerebellar טרי.
לדגור על גופות העוברים במשך שבעה ימים. ביום ה-14, סובבו את הצלחת כדי לאסוף את כל גופי העובר במרכז הצלחת. לאחר מכן הטה את הצלחת ושאף את כל המדיום בילה באמצעות פייפטר 1000 microliter מהקצה.
ככל שהכמות הבינונית פוחתת, לאט לאט מניחים את הצלחת שטוחה וממשיכים לשאוף, משאירים מספיק בינוני כדי להימנע מלמשוך את גופי העובר החוצה. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של מדיום הבחנה cerebellar טרי בתוספת 10 micromolar Y-27632. לאחר מכן מעבירים את גופי העובר באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר לצלחת מצופה פולי-L-אורניתין למינין.
ביום 15, שאפו את המדיום והחליפו אותו במדיום הבחנה cerebellar טרי. ביום האפס, מושבות iPSC נוקו והוסרו למדיום התמיינות המוח הקטן המכיל SB-431542 ו- Y-27632 והוכנסו ללוחות חיבור נמוכים במיוחד ליצירת גופים עובריים. התוספת של FGF2 ביום השני ושינוי של 1/3 מדיום ביום השביעי הביאו לכך שגופים עובריים הראו הגדלה ביום ה-14.
תאים החלו לנדוד החוצה מגופי העובר לאורך המשטח המצופה ביום ה-15. השינוי המוחלט של מדיום ההבשלה של המדיום לתווך המוח הקטן מהיום ה-21 הביא לחד-שכבתי של תאים עם מורפולוגיה דמוית נוירונים ומורכבות עד היום ה-35. ניתוח ביטוי הגנים ביום ה-35 גילה כי התאים מבטאים סמני אב מוקדמים של המוח הקטן כגון אבות גלוטמטרגיים, ATOH1, אבות GABAergic, אלפא PTF1, וסמני תאי האב של Purkinje KIRREL2 ו-SKOR2.
בנוסף, נצפו גם הביטוי של סמן שפתיים רומבי OTX2 ובעיקר נוירון קדמי ספציפי SIX3. התיוג האימונופלואורסצנטי של התאים שנקטפו ביום ה-35 הראה כתמים חיוביים עבור סמני המוח הקטן EN2 ו-PTF1 אלפא, הסמן העצבי בטא טובולין III וסמן ההתרבות KI67. צביעה גרעינית עם 4'6-דיאמידינו-2-פנילינדול, או DAPI, הראתה גרעיני תאים.
כדי לקבל בידול מוצלח, חשוב להתחיל עם מושבות iPSC בריאות ולא מובחנות ולהשתמש בריאגנטים ששוחזרו מחדש ככל האפשר.
