Diese Studie wurde zum Teil durch die IPSEN-Stiftung finanziert. IMV ist ein American Cancer Society Professor für Molekularbiologie, und hält die Irwin und Joan Jacobs Lehrstuhl in Beispielhafte Life Sciences. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem NIH, Leducq Foundation, Mériaux Stiftung Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, und die HN und Frances C. Berger Stiftung unterstützt. PAS wird von McKnight Endowment Fund for Neuroscience und dem National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022) finanziert. Die Autoren bedanken sich bei Mark Schmitt bedanken. Graphik wurde von Jamie T. Simon entwickelt. Sponsorship wurde freundlicherweise von Invitrogen zur Verfügung gestellt.

1. Organotypische Cerebellar Cultures: <ol><li> Um erfolgreich zu generieren organotypischen Kleinhirn Kulturen verwenden Mäusen zwischen P0-P3 oder P8-P12. Für unser Experiment benutzten wir Mäuse in der P8-P12 Bereich, weil dieser Entwicklungsstufe war besser geeignet für unsere Studie. </li><li> Bereiten Sie die Präparation und das Kulturmedium: <ol><li> Brain-Dissektion und in Scheiben schneiden Zubereitung sind in niedrigen Natriumgehalt Artificial Liquor (ACSF) mit 1 mM Calciumchlorid, 10 mM D-Glucose, 4mm Kaliumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid, 26mm Natriumbicarbonat, 246mm Saccharose und Phenolrot-Lösung (1:1000) durchgeführt , pH 7,3. Zu sterilisieren die Lösung, zu filtern durch eine .22 um Filter und lagern bei 4 ° C. </li><li> Zerebelläre Scheiben sind in 75% Minimum Essential Medium Eagle (MEM), 25% Hitze-inaktiviertem Pferdeserum, 25mm HEPES, 1 mM Glutamin, 5 mg / ml Glucose, Penicillin (100 U / ml) und Streptomycin (100 U / ml) kultiviert. Filter das Medium durch ein 0,22 um-Filter und lagern bei 4 ° C für maximal zwei Wochen. </li></ol></li><li> Dissect Gehirn in eiskaltem ACSF Medium zuvor mit Carbogen (95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid) Hinweis sprudelte, wird diese Sättigung mit Carbogen Änderung des pH-Wertes der Lösung so aus rot bis orange werden sich verschieben. Die Dissektion sollte im Minimum an Zeit möglich darauf achten, daß die Struktur des Gehirns Schäden durchgeführt werden. </li><li> Scheiben des Gehirns in Sagittalschnitten von 400 um mit einer Vibratom. <ol><li> Machen Sie einen sagittalen Schnitt mit einer Rasierklinge in einer Hemisphäre, versuchen, so wenig wie möglich des Kleinhirns geschnitten, das wird eine ebene Fläche zum Schneiden bieten. Der Kortex ist nur zur Unterstützung eingesetzt, um das Schneiden leichter, aber da die Zeit ein wichtiges Thema ist es bequemer, schneiden Sie die rostralen Hälfte des Kortex mit einer Rasierklinge. </li><li> Verwenden Sie Cyanacrylat (Sekundenkleber), um die Position des Gehirns auf das Metall Vibratom befestigen. Es ist wichtig, die Platte auf Eis, bevor Sie den Kleber entspannen und es gut verteilt mit der Spitze des Rohres zu einer dünnen Klebeschicht zu bilden. Wenn es einen Überschuss von Sekundenkleber, wird es von der Platte zu lösen, wenn es in Kontakt mit dem ACSF und die Probe verloren geht. </li><li> Sobald das Gehirn ist es, die Vibratom befestigt, fügen Sie genug ACSF Medien an das Gehirn abdecken und Eis unter der Platte zu halten es kalt. </li><li> Cut 400 um Scheiben schneiden und übertragen Sie sie mit einem Kunststoff-Pasteurpipette (Schnitt die Spitze, um es zu erweitern und Vermeidung von Schäden an den Scheiben) zu einer 6-well Zellkulturplatte mit ACSF auf Eis. </li><li> Separate das Kleinhirn aus dem Rest des Gehirns mit Hilfe von zwei Insulinspritzen (Spritzen mit kleinem Durchmesser 28-Gauge-Nadeln) unter dem Binokular. Einige Scheiben haben Sekundenkleber an den Rändern befestigt: Das ist der Moment, um zu versuchen, es zu entfernen, da sie die Lebensfähigkeit der Scheibe auswirken kann. Es ist wichtig, um es vorsichtig tun, ohne die Struktur des Kleinhirns. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die zerebelläre Scheiben auf 6-well-Platten mit 30mm Zellkulturplatten-Einsätze mit 0,4 pm Poren. 1 ml der Kultur Medien pro Vertiefung, die durch Inkubation für mindestens 2 Stunden vorkonditioniert bei 37 ° C und 5% CO 2 (in der Zellkultur-Inkubator). Legen Sie die Einsätze auf der Oberseite der Medien machen, dass es keine Luftblasen unter und dann die zerebelläre Scheiben (1-3 pro Einsatz) auf der Oberseite der Einsätze machen, dass sie voll ausgefahren sind und dass keine Flüssigkeit zu überdecken. Saugen Sie über Medien, falls erforderlich. Bei 37 ° C und 5% CO 2 Änderung der Kulturmedien alle 2 oder 3 Tage. Am besten ist es nur ein Teil des Mediums (zB ½ Volumen) auf einmal zu ersetzen, da verwendete Medium enthält slice-derived trophischen Faktoren, die wichtig für das Überleben der Zelle. </li></ol> 2. Fas Behandlung und Färbung von zerebelläre Scheiben: <ol><li> Für die apoptotischen Herausforderung Experiment haben wir zunächst Kultur die Scheiben für 5 Tage verändernden Medienlandschaft am Tag in vitro 3 (DIV3). Auf DIV5 Kulturen werden mit 0,5 g / mL der Fas-Agonisten-Antikörper Jo2, indem Sie es direkt an die Medien, um einen sauberen Hintergrund des Zelltods, da die Veränderungen der Medien behandelt induzieren können einige Sterblichkeit in den Kulturen. Die Hälfte der Brunnen sind unbehandelt als Kontrolle. </li><li> Nach 24 Stunden entfernen Sie die Medien unter der Einsätze durch Absaugen. Zur Fixierung der Scheiben, 1 mL eiskaltem 4% PFA unter und 1 mL oberhalb des Einsatzes. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 10 Minuten entfernen Sie die PFA und waschen kurz mit kaltem PBS. </li><li> Nächstes entfernen Sie die PBS und 1 ml unter und 1 mL oberhalb des Einsatzes von 20% eiskaltem Methanol in PBS und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Dann wird noch einmal mit PBS und 1 ml unter und 1 mL oberhalb des Einsatzes von 0,5% Triton-X-100 in PBS zur Permeabilisierung. Inkubieren für ein Minimum von 12 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Nach Permeabilisierung mit 20% BSA in PBS-Block für ein Minimum von4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. In diesem Stadium der Scheiben können in Blocking-Lösung für mindestens 3 Tage bei 4 ° C aufbewahrt werden </li><li> Um Flecken auf den Scheiben schneiden Sie vorsichtig das Stück der Membran auf die Kleinhirn-Scheibe befestigt einfügen und sie auf 24-Well-Platten mit PBS. </li><li> Die Immunfärbung erfolgt sequentiell, getan zuerst mit TUNEL-Reagenz für 1 Stunde und dann mit Calbidin Antikörper über Nacht. <ol><li> Saugen Sie das PBS und fügen 250 ul off TUNEL-Reagenz in jedes Well sicherstellen, dass es auf der gesamten Oberfläche der Scheibe. Bei 37 ° C für eine Stunde im Dunkeln. </li><li> Nach einer Stunde entfernen Sie die TUNEL-Mix und waschen mit PBS dreimal für 10 Minuten. </li><li> Nach der letzten Waschung, entfernen Sie die PBS und fügen 250 ul einer 1 / 1000 Verdünnung des Calbindin Antikörper in PBS und Inkubation über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Entfernen Sie den primären Antikörper-Lösung und Waschen mit PBS dreimal für 10 Minuten. </li><li> Add 250 ul des sekundären Antikörper verdünnt 1 / 500 in PBS und Inkubation für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Die TUNEL-Kit verwendeten wir mit TMR rot markiert, damit unsere sekundären Antikörper für Calbindin konjugiert ist Alexa-488. </li><li> Dreimal 10 Minuten lang mit PBS und montieren Sie die Scheiben auf einem Glasobjektträger mit einem Eindeckmittel dass DAPI enthält. </li><li> Bild die Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop mit der 488 nm und 561 nm Wellenlänge Anregung für Calbindin und TUNEL jeweils. </li></ol></li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Die größte Herausforderung dieses Protokolls ist in der Lage sein, gesunde Kleinhirn Scheibe Kulturen zu generieren, zumal unsere letzte Anzeige wird Zelltod werden. Eine gesunde Kultur erscheint als eine, wo die Zellkörper Schicht ist transparent und erlaubt Ihnen, die blättrige Struktur des Kleinhirns unter dem Mikroskop (Abbildung 1) zu sehen. Nach wenigen Tagen in Kultur die Scheiben beginnen zu dünn und nicht-neuronalen Zellen zu beobachten Migration weg von den Rändern der Scheibe sein. Die dunkle runde Zellen (wahrscheinlich Makrophagen), dass die Scheiben bedecken nach wenigen Tagen in Kultur, wird schließlich an Zahl abnehmen nach 10-14 Tagen in vitro (Abbildung 2) 5. Der ultimative Beweis für die Lebensfähigkeit der Scheiben ist für unterschiedliche zelluläre Marker, wie Calbindin für die Purkinjezellen Fleck. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative konfokalen Mikroskop Bild der Purkinje-Zellschicht mit mehreren TUNEL positive Kerne. Es ist wichtig zu bedenken, dass, selbst wenn einige Scheiben erhielt einen apoptotischen Stimulus, sie seien nur für 24 Stunden ausgesetzt. Dies ermöglichte es genügend Zeit, um DNA-Fragmentierung in den sterbenden Zellen mit der TUNEL-Färbung zu beobachten, sondern eine definierte Purkinje-Zellschicht noch vorhanden war. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Gesunde Kleinhirn Scheibe bei DIV2. Dieses Bild zeigt die transluzente Zellkörper Schicht und die blättrige Struktur des Kleinhirns in einem gesunden Stück. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Gesunde Kleinhirn Scheibe an DIV 7. In diesem Bild können wir immer noch beobachten, die blättrige Struktur des Kleinhirns und das Auftreten von dunklen Zellkörper. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Repräsentatives Bild der Fas-behandelten Kleinhirn in Scheiben schneiden. Das konfokale Abbildung zeigt die Purkinje-Zellen mit Calbindin (grün) und die apoptotischen Zellen positiv für TUNEL-Färbung (rot) gefärbt. Purkinje-Zellen nicht in einer einzigen Zeile erscheinen, sind aber geclusterten Bildung einer folium-ähnliche Struktur.

<ol>
	<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures.">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures.">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li><li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Beat, H., G&#228;hwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. , 461-498 (1998).</li></ol>

Alle tierischen Arbeit durchgeführt wurde in Übereinstimmung mit den Sicherheitsrichtlinien des IACUC gegründet getan. Die Salk-Institut ist eine AAALAC akkreditierten Labor.

Diese Methode beschreibt eine der vielen möglichen Anwendungen von neuronalen organotypischen Kulturen und es hat uns erlaubt, die Wirkung von apoptotischen Stimuli in Wildtyp und Mutante zerebelläre Scheiben zu studieren. Der wichtigste Teil dieses Experiments ist in der Lage sein, konsequent zu erzeugen gesunde Kleinhirn Scheibe Kulturen. Die wichtigsten Faktoren sind Dissektion und Schneiden-Technik und die Fähigkeit, das Protokoll in der kürzesten Zeit möglich durchzuführen, aber gleichzeitig darauf achten, daß die Scheiben beschädigt. Ein weiterer entscheidender Faktor ist die Herstellung und Zusammensetzung der Nährmedien, werden diese Kulturen sehr empfindlich, so mussten wir einige Rezepte und Marken der Medien zu testen. Selbst unterschiedliche Chargen von Serum oder andere Komponenten der Medien konnte die Lebensfähigkeit der Scheiben. Wir haben die besten Ergebnisse mit dem Pferd Serum von Invitrogen Lot # 480116. Sobald die zerebelläre Scheiben erzeugt werden kann Studie des Kleinhirns Entwicklung, Elektrophysiologie, das Überleben der Zelle allein oder in Reaktion auf apoptotische Stimuli, Exzitotoxizität oder Sauerstoffmangel. Vergleichende Studien mit Wildtyp und Mutante zerebelläre Scheiben sind sehr aufschlussreich in vielen Aspekten des Kleinhirns Funktion und Entwicklung.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/ Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krazy Glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6 well / 24 well cell culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning Incorporated</td>
<td>3506/ 3527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30mm culture plate inserts (0.4-&mu;m pore)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICM03050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>554254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>In situ cell death detection kit, TMR red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>12 156 792 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Swant</td>
<td>CB-38a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular probes)</td>
<td>A-11008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector labs</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss Stemi SV 11</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica TCS SP2 AOBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

organotypic cerebellar cultures: apoptotic challenges and detection

Organotypischen Kulturen von neuronalen Gewebe wurden zuerst von Hogue 1947 1,2 eingeführt und war ein wichtiger Durchbruch auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Seitdem wurde die Technik weiter entwickelt und derzeit gibt es viele verschiedene Möglichkeiten, um organotypischen Kulturen vorzubereiten. Die hier vorgestellte Methode wurde von der von Stoppini et al angepasst. Für die Vorbereitung der Scheiben und von Gogolla et al. Für die Färbung 3,4. Ein einzigartiges Merkmal dieser Technik ist, dass man auf verschiedene Teile des Gehirns wie Hippocampus oder Kleinhirn in ihrer ursprünglichen Struktur Studium ermöglicht und bietet einen großen Vorteil gegenüber dissoziierten Kulturen, in denen alle zellulären Organisation und neuronale Netzwerke gestört werden. Im Falle des Kleinhirns ist es noch vorteilhaft, weil sie das Studium der Purkinje-Zellen, äußerst schwierig, wie distanziert primären Kultur erhalten können. Diese Methode kann verwendet werden, um bestimmte Entwicklungsstörungen Funktionen des Kleinhirns in-vitro-Studie, sowie für die elektrophysiologischen und pharmakologischen Experimente sowohl in Wildtyp-und mutierten Mäusen werden. Die hier beschriebene Methode wurde entwickelt, um die Wirkung von apoptotischen Stimuli wie Fas-Ligand in den Entwicklungsländern Kleinhirn Studie mit TUNEL-Färbung zur Apoptose zu messen. Wenn TUNEL Färbung mit Zelltyp spezifische Marker, wie Calbindin für Purkinjezellen kombiniert wird, ist es möglich, den Zelltod in einer Zellpopulation gezielt auszuwerten. Die Calbindin Färbung dient auch dem Zweck der Beurteilung der Qualität des Kleinhirns Kulturen.

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Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Diese Methode beschreibt die Erzeugung von organotypischen Kleinhirn Kulturen und die Wirkung bestimmter apoptotischen Stimuli auf die Lebensfähigkeit der verschiedenen Zelltypen des Kleinhirns.

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.1K Aufrufe.  The Salk Institute for Biological Studies. Diese Methode beschreibt die Erzeugung von organotypischen Kleinhirn Kulturen und die Wirkung bestimmter apoptotischen Stimuli auf die Lebensfähigkeit der verschiedenen Zelltypen des Kleinhirns.

Serie: Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Selektive Depletion von Mikroglia von Kleinhirn-Körnerzellkulturen Mit L-Leucin-Methylester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

Untersuchung funktionelle Regeneration im Organotypische Spinal Cord Co-Kulturen auf Multi-Elektroden-Arrays Grown

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...