תרבות פרוסות אורגנוטיפיק היא כלי רב עוצמה לחקר תהליכים נוירו-התפתחותיים ותהליכים ניווניים או רגנרטיביים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לסנן במהירות מולקולות מועמד עבור הפוטנציאל הנוירו-קרן שלהם. שיטה זו מחקה באופן הדוק בתנאי vivo, בהשוואה לתרבויות תאים ראשיים ניתקו, כתוצאה מארכיטקטורת ערכת הרקמות וחיבורי תאי תא מקוריים נשמרים בתוך מישורי המקטעים.
כאן אנו מדגימים את המחקר של מוות תאי Purkinje המוח הקטן המתפתח. אבל תרבות פרוסה אורגנותית מתאימה באותה מידה למודל מחלות ניווניות כמעט בכל אזור במערכת העצבים המרכזית. הדגמת ההליך עם ג'ניפר Rakotomamonjy יהיה שון מקדרמוט, טכנאי מהמעבדה שלי.
לפני קצירת פרוסות המוח הקטן, בארון ביו-בטיחותי מעוקר, ממלאים כל באר של צלחת תרבות בת שש בארות במיליליטר אחד של מדיום תרבות מסונן ואקום, ומוסיפים את הסוכן הפרמקולוגי המעניין את בארות הטיפול, ונפח שווה של רכב לבארות הבקרה. באמצעות ממטרים סטריליים, מניחים מסנן ממברנה PTFE אחד בגודל 0.4 מיקרומטר מוכנסים לתוך כל באר, דואגים להימנע מבועות בממשק של כל קרום והבינוני, וציידים את המדיום בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים. כדי לקצור את המוח הקטן, להשתמש מטליות ההלבשה ישר לתפוס את הראש גור על ידי האף, ולהשתמש מספריים העין ישר לחתוך לפתוח את הקרקפת מהקצה האחורי בצד השני עד קו האמצע.
חותכים את הגולגולת באותו אופן, מצביעים על טיפים מספריים כלפי חוץ, כדי למנוע פגיעה במוח הקטן, ולהשתמש מרית להעביר את המוח לצלחת 60 מילימטר המכיל HBSS קר וחמישה מיליגרם למיליליטר של גלוקוז. השתמש מטלפסי ההלבשה ישר לנתח בזהירות את המוח הקטן, ולהשתמש מטלפס דק מעוקל סטרילי למקם את הרקמה על דיסק פלסטיק על שולחן החיתוך של מסוק רקמות. סובב את שולחן החיתוך כדי לכוון את הרקמה כדי לאפשר רכישה של מקטעים parasagittal, ולמשוך את ידית שחרור השולחן ימינה כדי להזיז את שולחן החיתוך עד הלהב ממוקם בקצה הרקמה.
לאחר מכן כווננו את עובי הפרוסה ל-350 מיקרומטר, ואת מהירות הלהב לבינונית, והתחלו את המסוק. כאשר כל המוח הקטן נחתך, לכבות את המסוק. באמצעות ממטרים סטריליים, החזק את הדיסק מעל צלחת חדשה של 60 מילימטר.
השתמש פיפטה העברה כדי לשטוף HBSS בתוספת גלוקוז על הדיסק, כך הפרוסות ליפול לתוך המנה. לאחר מכן, נוגעים בדגימות בצורה מינימלית ככל האפשר, משתמשים במיקרו-חיידק כדי להפריד בין הפרוסות. השתמש פיפטה העברה כדי לבחור חלקים של המוח הקטן קרוב vermis על תרבות תא בודדים מוסיף בצלחת שש באר, ולהשתמש במיקרופרוב כדי למקם את הפרוסות למרכז של כל הכנס.
כאשר כל הפרוסות הונחו, בזהירות שאפו כל HBSS עודף בתוספת גלוקוז, ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא. עבור כתמי שפעת חיסונית, להסיר את supernatant מכל באר, ולשטוף את מוסיף עם PBS. תקן את הפרוסות עם מיליליטר אחד של קר 4% paraformaldehyde באר של כל הכנס, ו 500 microliters על גבי כל הכנס במשך שעה אחת.
בסוף קיבעון, לשטוף את מוסיף ארבע פעמים במשך 10 דקות עם מיליליטר אחד של PBS טרי תחת כל הכנס ו 500 microliters של PBS טרי על גבי כל הכנס לכל לשטוף על שייקר מסלולית. ממלאים מראש כל באר של צלחת של 24 בארות עם 500 מיקרוליטרים של PBS-TB, ולהשתמש במברשת צבע כדי להעביר את פרוסות המוח הקטן מכל תרבות תא להוסיף לתוך בארות בודדות של צלחת 24 בארות. permeabilize ולחסום את הפרוסות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
בסוף הדגירה, סמן את התאים עם 200 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של עניין מדולל PBS-TB ל הבאר לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית. למחרת בבוקר, לשטוף את הפרוסות ארבע פעמים במשך 10 דקות ו 500 microliters של PBS טרי לכל לשטוף על שייקר, לפני תיוג הדגימות עם נוגדנים משניים פלואורופור משותף המתאים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר על השייקר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, נגדי את החלקים עם 500 microliters של כתם גרעיני מתאים לגם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
ולהשתמש פיפטה העברה כדי לטעון את הפרוסות על מגלשות זכוכית. לאחר מכן תן את החלקים אוויר להתייבש לחלוטין לפני התייבשות עם PBS הרכבה את הרקמות עם כיסויים מצופה כ 80 microliters של מדיום הרכבה. לאחר המדיום הרכבה נרפא, החלקים המוח הקטן מוכנים להיות בתמונה.
ביום השישי שלאחר הלידה, הישרדות תאי Purkinje נמוכה בדגימות הבקרה, בהתאם לחלון הפגיעות הידוע שלהם. ההישרדות גוברת ככל שהחיה התורמת מתבגרת ויוצאת מתקופה קריטית זו. הטיפול בפרוסות מוחיות עם ריכוז גבוה של אשלגן כלורי גורם אינדוקציה מוצלחת של depolarization שלהם והישרדות.
כדי להשיג תוצאות עקביות לשחזור, חשוב מאוד לבחור מקטעים מוחיים בריאים, ולבצע את הגדרת התרבות בצורה יעילה ככל האפשר. יישומים פוסט-תרבותיים חורגים משפעת חיסונית. כמו פרוסות organotypic יכול לשמש למחקרים ביטוי חלבון הגנום, ולניטור פעילות מעגל עצבי באמצעות אלקטרופיזיולוגיה סידן חי הדמיה.
