עבודה זו מומנה על ידי NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B זרע גרנט, וכן מענק משלים NIH כדי FR, אחוות BB ל CM, המלגה CDT ל RG.

1. הכנת שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 22 מ&quot;מ x 40 מ&quot;מ זכוכית שקופיות מיקרוסקופ ב 6 ס&quot;מ מנות תרבות התא, 1 שקופית לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף כל צד של כל שקופית, כמו גם את צלחת 6 ס&quot;מ אור אולטרה סגול (UV) במשך 15-20 דקות לעקר ברדס סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הכלים עם שקופיות בפנים עם parafilm ו חנות ב 4 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol> 2. הכנה של מדיה, Buffers, פתרונות, ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 L של פתרון מלח מאוזן של האנק (HBSS) במים deionized ולהוסיף 10 מ&quot;מ HEPES, 5 מ&quot;מ NaHCO 3 , ו 1 מ&quot;מ EGTA. התאם ל- pH 7.2-7.3 עם NaOH. חיץ מסנן עם מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 900 מ&quot;ל של גלוקוז גבוהה של Dulbecco השתנה של נשר בינוני (DMEM) ש במים deionized. הוסף 44 מ&quot;מ NaHCO 3 ולהתאים את ה- pH 7.2-7.3 עם HCl. סנן מדיה עם מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק autoclaved. הוסף 100 מ&quot;ל של עוברי boviNe בסרום (FBS) לתקשורת כדי להפוך את ריכוז FBS 10%. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 L למאגר תאיים (125 מ&quot;מ KCl, 25 מ&quot;מ NaCl, 10 מ&quot;מ HEPES, 0.2 מ&quot;מ CaCl 2 , 0.5 מ&quot;מ EGTA, 0.2 מ&quot;מ MgCl 2 ) במים deionized, ולהתאים את ה- pH ל -7.25. הסופי [Ca 2 + ] יהיה ~ 100 ננומטר. לפני השימוש, הוסף 0.5 מ&quot;מ ATP. חנות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 L של המאגר של רינגר (121 מ&quot;מ NaCl, 2.4 מ&quot;מ K 2 HPO 4 , 0.4 מ&quot;מ KH 2 PO 4 , 10 מ&quot;מ HEPES, ו 1.2 מ&quot;מ MgCl 2 ) במים deionized, ולהתאים את ה- pH 7.2. חנות בטמפרטורת החדר. כדי להשתמש, aliquot 50 מ&quot;ל לתוך צינור 50 מ&quot;ל ולהוסיף 1.8 מ&quot;מ Ca 2 + ו 10 מ&quot;מ גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 L של פתרון KCl לשטוף (125 מ&quot;מ KCl, 25 מ&quot;מ NaCl, 10 HEPES מ&quot;מ, 0.2 מ&quot;מ MgCl 2 ) במים deionized, ולהתאים את ה- pH ל 7.25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 5 מ&quot;ג של יונומיצין ב 1 מ&quot;ל של דימתיל sulfoxide (DMSO). Aliquot 30 μL לתוך microtubes ולאחסן ב -206; ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חומצה cyclopiazonic (CPA) המניות על ידי הפיכת CPA לתוך DMSO. ודא אחוז הסופי של DMSO הוא ≤ 1% עבור CPA הוסיף לתאים כדי למנוע אפופטוזיס. הכן 20 מ&quot;מ 4-chloro-m-cresol (4-cmc) על ידי המסת לתוך מסונן H 2 O ולתת לו לפזר בן לילה על ידי רועד ב 37 מעלות צלזיוס. הכן את מלאי ה- ATP על ידי המסת מסוננים H 2 O ל 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את K ב D באתרו , להכין 15 מ&quot;ל כל 1 מ&quot;מ EGTA, 0.2 מ&quot;מ, 0.6 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ, ו 100 מ&quot;מ Ca 2 + במאגר KCl באמצעות 100 MM EGTA המניות 1 מ &#39;CaCl 2 מלאי מומס במים deionized. </li></ol> 3. תרבות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות C2C12 myoblast ו HEK293 תאים על פי פרוטוקולים ATCC עבור כל שימוש 10 ס&quot;מ תרבית תרבות צלחות ברדס UV סטרילית. הערה: תאים C2C12 לא צריך להיות מותר לגדול גבוה יותר מאשר מפגש ~ 70% מאז myoblasts יתחילו differentiaTe לתוך myotubes. הן HEK293 ו C2C12 תאים לגדול בקלות ולא צריך להיות מותר לגדול בעבר 100% confluency לשמור על שלמות התא. בנוסף, תאים לא צריך להיות passaged יותר מ 10 פעמים לפני השימוש בהם עבור ניסוי כדי לשמור על בריאות התא. </li></ol> 4. transfection של תאים HEK293 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע HEK293 תאים על גבי 22 מ&quot;מ x x 40 מ&quot;מ זכוכית שקופיות מיקרוסקופ ב 6 ס&quot;מ צלחות כך שהם ~ 70% confluent יום transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בצע את הפרוטוקול של היצרן עבור מגיב transfection כדי transfect תאים באמצעות 2 מיקרוגרם של CDNA + CDNA ו 1: 3 (משקל / נפח) DNA: יחס מגיב transfection בתקשורת בסרום מופחת ( למשל Opti-MEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את התקשורת DMEM מהצלחת, ולהוסיף 3 מ&quot;ל של התקשורת בסרום מופחת. הוסף DNA: תערובת מגיב transfection למאכל ו דגירה של 4-6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 5-6 מ&quot;ל של HBSS. מחק את HBSS fROM את המנה ולהחליף עם 3 מ&quot;ל של DMEM טרי דגירה אותם על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לאפשר ביטוי של GECI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection של תאים C2C12 myoblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים C2C12 myoblast, תאים trypsinize על ידי הוספת מספיק טריפסין כדי לכסות את החלק התחתון של צלחת (1-2 מ&quot;ל). מניחים את המנה 37 ° C חממה עבור 2-6 דקות כדי לאפשר טריפסין כדי לשחרר את התאים מהחלק התחתון של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה הושלם, להסיר את טריפסין לשאוב את התאים 8 מ&quot;ל של DMEM. פיפטה התאים ביסודיות עם DMEM לפזר באופן שווה מחדש להשעות תאים te וזרע אותם על coverslips סטרילית ב 6 ס&quot;מ צלחות תרבות התא המכיל 3 מ&quot;ל של DMEM כך המפגש הסופי הוא 60%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים באותו היום כפי שתואר בשלב 4.2-4.3. לדגור על 24 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.4. </li></ol></li></ol> 5. הכנת מיקרוסקופ שקופיות פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את mIcroscope ומקור האור, ולאחר מכן לפתוח את תוכנית PCI פשוטה. אפשר המיקרוסקופ כדי להתחמם במשך 15-20 דקות או עד תשלום מצמידים המכשיר (CCD) המצלמה מתקרר ל -65 ° C. הכן את החדר שקופית עם תאים בזמן ההמתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את החלק התחתון של פרופיל נמוך יהלום פתוח תא הדמיה עם שכבה דקה של איטום, באמצעות צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את השקופית המכילה תאים transfected מתוך חממה בעדינות לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ&quot;ל של המאגר של רינגר עם 10 גלוקוז מ&quot;מ ו 1.8 מ&quot;מ CA 2 + שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו 1 מ&quot;ל של המאגר של רינגר בצלחת, כדי למנוע התייבשות תאים, ולהשתמש מלקחיים לקחת את השקופית מתוך המנה. אפשר פתרון עודף לספוג על רקמת מעבדה על ידי נגיעה בקצה השקופית לרקמה במעבדה. לאחר מכן מקום על הצד של החדר המכיל את השומן עם תאים הפונים כלפי מעלה לכיוון השמן ואת החדר מאובטח על הר הבמה באמצעות מברג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1מ&quot;ל של המאגר של רינגר לתא כדי למנוע תאים מתייבש בעת הרכבה החדר על הבמה ומשלים את שאר ההתקנה מיקרוסקופ. לאחר צינור שאיבה ואקום מחובר לתא, נפח הסופי החדר מחזיקה ~ 450 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המטרה מיקרוסקופ כדי 40X שמן טבילה המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנייר עדשות ובפתרון ניקוי העדשות לניקוי וייבוש המטרה. לא לשפשף את המטרה. מטפטפים בעדינות עד שהמשטח נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של שמן טבילה אל המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הר על הבמה מיקרוסקופ ולהוסיף את קצה ואקום לתא. לאחר צינור שאיבה ואקום מחובר לחדר מופעלת, נפח הסופי החדר מחזיקה ~ 450 μL. זה נפח סופי הוא ברמה עם הצדדים של החדר. זה הכרחי עבור הפתרון קאמרית להיות ברמה, במהלך הניסוי, כדי למנוע את הפתרון נשפך לתוך המטרה עקב מילוי יתר. </li><lI&gt; להרים את המטרה ולהשתמש התאמת גס עד השמן על המטרה נוגע בתחתית השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מצב שדה בהיר, להתאים את הרווח 175 ואת זמן החשיפה ל 0.03 s כדי למקד את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים ממוקדים, לעבור למצב הקרינה באמצעות עירור 488 ננומטר. שנה את זמן החשיפה ל- 0.07 s. אתר שדה תצוגה שיש בו מספיק תאים כי הם בריאים עם הקרינה נאותה לתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שדה הראייה נבחר, לצלם במצב הקרינה ואת שדה בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעגל אזור עניין (ROI) בתאים או מעגל את התא כולו כדי להקליט את העוצמה מהאזור הנבחר. </li></ol> 6. הדמיה סמים המושרה Ca 2 + חולפים ב Situ K ד כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את עוצמת העוצמה עם קצב המסגרת שנקבע בכל 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר את עוצמת הבסיס לייצב עבור 20-30 מסגרות (100-150 s). במידת הצורך, להקטין את frAmes / s במהלך שלב זה כדי למנוע photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב כמות של 4 ס&quot;מ נדרש ממלאי 20 מ&quot;מ מבוסס על נפח החדר הסופי של μL ~ 450 לעשות ריכוז סופי של 200 מיקרומטר. לעשות דילולים של המניה לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקחת 60 μL של חיץ רינגר מן החדר מקום בצינור microcentrifuge. לדלל את הסכום המחושב של 4-cmc עם פתרון זה ולהוסיף חזרה לחדר כדי לעורר את התגובה המיועדת מן התאים להיות צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הסכום המחושב של 4-cmc לצינור microcentrifuge ומערבבים על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסיפו בעדינות את הפתרון מעל שדה הראייה, תוך הוספת סמן האירוע במדידת העוצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זמן התרופה כדי לאגד את הקולטן ולאחר מכן ירידה האות, ולאחר מכן לשטוף עם 3-6 מ&quot;ל של המאגר של רינגר עם 1.8 מ&quot;מ Ca 2 + ו 10 מ&quot;מ גלוקוז בעת ובעונה אחת להוסיף את סמן האירוע. מאז נפח החדר הוא 450 &amp;# 181; L והוא מחובר ואקום, הוספת 3-6 מ&quot;ל של חיץ מבטיחה כי הפתרון הקודם המכיל את התרופה נשטף והחליף עם הפתרון החדש הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 6.1-6.7 עבור 100 מיקרומטר ATP ו -15 מיקרומטר מחיר לרכישה, באמצעות שקופית חדשה של תאים transfected עבור כל assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדידה תושלם, לסיים את איסוף הנתונים בחלון המדידה עוצמת בתוכנית פשוטה PCI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות פלואורסצנטי ו brightfield של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ הנתונים עבור הניסוי. הנה, מעגל מחדש את התאים או אזורים של עניין כדי לחשב מחדש את העוצמה ערכים, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את באתרו K ב C2C12 תאים myoblast, בצע את הפרוטוקול כפי שמתואר בסעיף 4.2 ו סעיף 5 ו לשים 1 מ&quot;ל של 0 mM Ca 2 + חיץ של רינגר בחדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize התאים עם 0.002-0.005% saponin במאגר תאיים עבור 15-30 s לרוקן את התאים של כלCatcher + זה יכול להיות cytosol. לשטוף את התאים עם 3-6 מ&quot;ל של 1 מ&quot;ל EGTA במאגר KCl עם 10 מיקרומטר ionomycin. אפשר את עוצמת הירידה עד להגיע לרמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 3-6 מ&quot;ל של חיץ KCl עם 10 מיקרומטר יונומיצין ולאפשר את העוצמה לייצב, ולאחר מכן להוסיף כל Ca 2 + פתרון מפורט בשלב 2.7. אפשר את העוצמה להגיע לרמה בין כל תוספת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכייל את החיישן עבור basal [Ca 2 + ] כימות, בצע את שלב 6.12. השתמש EGTA ואת 100 מ&quot;מ Ca 2 + חיץ משלב 2.7 כדי לקבל את עוצמת הקרינה המינימלית והמקסימלית. </li></ol> עיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את קובץ הגיליון האלקטרוני של נתוני מדידת העוצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הנתונים עבור כל תא על עוצמת הבסיס (F / F 0 ). מגרש את הנתונים המנורמלים לעומת הזמן בכל תוכנית גרפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את השינוי%, לחסר את שיא השיא מנורמלUe מ 1 ו להכפיל ידי 100. לחשב את סטיית הממוצע ו סטנדרטי אם תאים מרובים היו צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את יחס אות לרעש, SNR, לפתוח את קובץ התמונה שנשמר בניסוי בתוכנת עיבוד תמונה, כגון ImageJ, ולאחר מכן למדוד את האות, תאים transfected, רעש, רקע. חישוב SNR באמצעות המשוואה SNR = אות / רעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את K באתרו D מן הנתונים שנאספו הדמיה פלואורסצנטי, הממוצע נתוני עוצמת, המרכיבים את המישורים, לאחר תוספת של כל Ca 2 + ריכוז EGTA (0 mM Ca 2 + ). לחשב את הרוויה החלקית (בעוצמה יחסית) באמצעות θ = (F - F דקות ) / (F מקס - F דקות ), כאשר θ היא עוצמת יחסית, F הוא הקרינה בכל נקודה, F דקות היא עוצמת הקרינה המינימלית, ו F מקסימום הוא עוצמת הקרינה המרבי, כדי לראות את השינוי בעוצמת tהוא לחקור עם תוספת של Ca 2 + לעומת עוצמת המינימום. מגרש את נתוני האינטנסיביות היחסית כנגד [Ca 2+ ] בכל תוכנית התאמה של גרפים ועקומות. השתמש במשוואת הכריכה 1: 1 θ = [M T ] / (K d + [M T ]) המתורגם לכל תוכנית התאמה של גרפים ועקומות כדי לחשב את K d . M T הוא ריכוז המתכת הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את הסידן הבסיסי מהכיול המתואר ב -6.13, ממוצע נתוני האינטנסיביות, המהווים את המישורים, לאחר תוספת של 1 מ&quot;מ EGTA (F דקות ) ו -100 מ&quot;מ Ca 2 + (F מקסימום ). השתמש במשוואה כיול [Ca 2 + ] = K ד ([F - F דקות ) / (F מקס - F)] כדי לחשב את הסידן הבסיסי. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).</li><li>Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+signaling+and+sensor.">Fast kinetics of calcium signaling and sensor.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).</li><li>Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+of+intracellular+Ca2+:+Molecular+determinants+and+functional+consequences.">Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences.</a> Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum:+a+multifunctional+signaling+organelle.">The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.</a> Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-chloro-m-cresol,+a+potent+and+specific+activator+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).</li><li>Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+receptor:+phosphorylation+by+protein+kinase+C+and+calcium+calmodulin-dependent+protein+kinases+in+reconstituted+lipid+vesicles.">Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).</li><li>Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+via+P2-purinergic+receptors+for+extracellular+ATP+and+other+nucleotides.">Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).</li><li>Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+increases+intracellular+calcium+in+supraoptic+neurons+by+activation+of+both+P2X+and+P2Y+purinergic+receptors.">ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Pumps+in+Health+and+Disease.">Calcium Pumps in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).</li><li>Michelangeli, F., East, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diversity+of+SERCA+Ca2++pump+inhibitors.">A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors.</a> Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).</li><li>Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dynamics+measured+in+agonist-sensitive+stores+of+single+living+intact+cells:+a+new+look+at+the+refilling+process.">Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process.</a> Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+For+InSitu+Measurement+of+Calcium+in+Intracellular+Inositol+1,4,5-Trisphosphate-Sensitive+Stores+Using+The+Fluorescent+Indicator+Mag-Fura-2.">Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).</li><li>Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+indicator+for+measuring+cytosolic+free+magnesium.">A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium.</a> Am J Physiol. 256, (1989).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li><li>Heim, N., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Indicators+of+Cellular+Calcium+Dynamics+Based+on+Troponin+C+and+Green+Fluorescent+Protein.">Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein.</a> J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+C-based+biosensors:+A+new+family+of+genetically+encoded+indicators+for+in+vivo+calcium+imaging+in+the+nervous+system.">Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system.</a> Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).</li><li>Carlson, H. J., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+a+Red+Fluorescent+Protein-Based+Calcium+Ion+Indicator.">Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator.</a> Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).</li><li>Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+Calcium+Sensing+by+GCaMP2.">Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2.</a> Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).</li><li>Koldenkova, V. P., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2++dynamics+in+high+Ca2++concentration+cellular+compartments.">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+sensors+for+real-time+measurement+of+high+Ca2++concentrations.">Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations.</a> Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).</li><li>Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++concentration+after+Ca2++release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice.">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+endoplasmic+reticulum+stored+calcium+regulation+by+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+ryanodine+receptors.">Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).</li><li>Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium signaling protocols. , (1999).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

חי בודד תא הדמיה של בדיקות ניאון, כגון Catcher + , היא טכניקה יעילה לנתח מסובך ER / SR Ca 2 + תהליכי איתות בכל תא בתגובה אגוניסטים קולטן או אנטגוניסטים. טכניקה זו שימושית גם עבור הדמיה תוך שימוש באורכי גל מרובים בו זמנית, כגון הצורך Fura-2 או תמונה Catcher + ו Rhod-2 יחד כ?...

התכונות הספציו-טמפורליות של סידן תאיים (Ca 2 + ) חולפות פונקציות ביולוגיות שונות 1 . אלה Ca 2 + אירועים איתות מופעלות מחוץ לתאי באמצעות גירויים שונים נשלט intracellularly על ידי Ca 2 + האחסון הגדולות אחסון על ידי רבים Ca 2 + משאבות, ערוצים, Ca 2 + חלבונים מחייב. Ca 2 + transients יכול להיות שונה באופן משמעותי כתוצאה של פגמים עם אפנון האות, המוביל למחלות שונות 2 . בגלל המהירות ואת המורכבות של Ca 2 + מערכת איתות, עם endo- (ER) ו sarcoplasmic reticulum (SR) במרכז, גנטית מקודדים Ca 2 + בדיקות כי כבר אופטימיזציה עבור ביטוי יונקים עם קינטיקה מהירה יש צורך כדי לעקוב אחר Ca 2 + המקומי המקומי שינויים בתאים שונים 3 . ER ו SR, עמיתו בתאי השריר, הם תאיים מרכזי תא Ca 2 + אחסון ולפעול כמו Ca 2 + כיורים המסייעים להגביר את Ca 2 + אות 4 . ER / SR הוא חלק בלתי נפרד Ca 2 + איתות עם תפקידים כפולים כמו משדר מקלט של אותות 5 . הקולטן ryanodine (RyR) ו inositol קולטן 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) הם Ca 2 + קולטנים שחרור ממוקם על הקרומים של ER / SR כי מוסדרים על ידי Ca 2 + 6 . סוכנים אחרים במישרין או בעקיפין לעורר את הפונקציה של קולטנים אלה. 4-chloro-m-cresol (4-cmc) הוא אגוניסט חזק של ריר, בעל 10 רגישות גבוהה יותר מאשר קפאין להפקת SR Ca 2 + שחרור שבו שניהם מועסקים באופן קבוע ללמוד RI בתיווך Ca 2 + שחרור ב תאים בריאים וחולים. ATP מגדיל IP 3- מתווכת Ca 2 + מחדשחכירה באמצעות IP 3 R 8 . ATP נקשר לקולטן הפורינרגי P2YR, קולטן G יחד עם ה- GPR, המפעיל את ייצור ה- IP 3 המחובר ל- IP 3 R כדי לשחרר Ca 2 + ממכשיר ה- ER 9 , 10 . המשאבה הסרקו-endoplasmic reticulum סידן ATPase (SERCA) היא משאבת ATPase מסוג P, הממוקמת גם על קרום ER / SR המפחית cytosolic Ca 2 + וממלא את ER / SR על ידי פעיל לשאוב את יון לתוך לומן ER / SR 11 . מעכבים ספציפיים של המשאבה SERCA כוללים thapsigargin, מ Thapsia garganica , וחומצה cyclopiazonic (CPA), מ Aspergillus ו פניציליום . מחיר לרכישה יש זיקה נמוכה עבור המשאבה וחוסמת באופן הפוך את נקודת הגישה 2 + Ca 12 . Thapsigargin, לעומת זאת, באופן בלתי הפיך נקשר המשאבה Ca 2 + חינם ב שאריות F256 ב הסליל M3 עם nanomolז. ניתוח וכימות השינויים הכרוכים Ca 2 + אירועים מגורה כבר ונשאר אתגר. מאז ER / SR הוא תת subcellular מרכזי Ca 2 + המכיל תא עם פונקציה מרכזית בהפצה של האות Ca 2 + , הרבה עבודה כבר התמקדו בהבנה ER / SR Ca 2 + איתות 5 . יצירת סינתטי Ca 2 + צבעים עזר לקדם את השדה והנוהג של Ca 2 + הדמיה. למרות צבעים, כגון מג-פורה -2, נעשה שימוש נרחב למדידת Ca 2 + תאים בתאים שונים, 13 , 14 , 15 יש להם מגבלות כגון עומס צבע אחיד, photobleaching, ואת חוסר היכולת להיות ממוקד לארגנים ספציפיים . גילוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וקידום של חלבון פלואורסצנטי,מבוסס Ca 2 + בדיקות יש דחף את שדה Ca 2 + הדמיה קדימה 16 . חלק GECIs הקיימים הם Förster תהודה העברת אנרגיה (סריג) זוגות מעורבים חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP), רמודודולין ואת פפטיד M13 מחייב 17 , 18 . Troponin C מבוססי GECIs זמינים גם כמו זוגות סריג של CFP ו Citrine וכן בדיקות fluorophore יחיד 19 , 20 , 21 . אחרים, כגון GCaMP2 ו- R-GECO הם חיישנים fluorophore יחיד המעורבים רגוע 22 , 23 . כדי להתגבר על המגבלות של כוונון צר של K ד &#39;ו שיתופית קשורה הקשורים מספר Ca 2 + אתרים מחייב למצוא Ca 2 שלהם + תחומים מחייב 24 , מחלקה חדשנית של סידן סןסורס נוצר על ידי עיצוב Ca 2 + אתר מחייב על פני השטח של חבית ביתא במיקום רגיש chromophore של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) 25 , 26 . זה חיישן touted, קרא Catcher, יש K d של ~ 0.18 מ&quot;מ, ak על גבול דיפוזיה, ו ak של 700 s -1 . Catcher שימש כדי לפקח על קולטן בתיווך ER / SR סידן לשחרר שורות תאים יונקים שונים כגון HeLa, HEK293, ו C2C12 25 . בגלל הקינטיקה המהירה שלה, Catcher היה בשימוש סיבי שריר מכופף digitorum brevis (FDB) של צעירים וידידים חבר &#39;ה ב NIH ג&#39; קסון (FVB) עכברים לחשוף כי יותר Ca 2 + נשאר SR לאחר 2 של פוליאוריזציה של FDB סיבי עכברים ישנים בהשוואה לזו של עכברים צעירים 27 . כדי להתגבר על הקרינה נמוכה ב 37 מעלות צלזיוס, אשר מעכב את היישומים שלה הדמיה סידן של יונקיםתאים, פיתחנו גרסה משופרת של Catcher שנקרא Catcher + . Catcher + תערוכות משופרת הקרינה על 37 מעלות צלזיוס ליישום טוב יותר בתאי יונקים. מוטציות נוספות שולבו Catcher כדי לשפר את thermostability ו פלואורסצנטי ב 37 ° C 28 , 29 , כדי ליצור Catcher + . Catcher + מציג עלייה פי שישה ביחס האות לרעש (SNR) מעל Catcher 30 . כאן, הפרוטוקולים של התרבות transfection של HEK293 ו C2C12 תאים עם Catcher + ויישומו לניטור ER / SR קולטן בתיווך סידן חולפים מוצגים. תוצאות נציג מוצגים עבור Catcher + לידי ביטוי HEK293 תאים שטופלו 4-cmc, CPA ו- ATP. כמו כן, אנו מספקים פרוטוקול לקביעת באתרו K של Catcher + ב C2C12 תאים myoblast ו quaNtification של הבסיס [Ca 2 + ].

<table><tbody><tr><td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C55402</td><td></td></tr><tr><td>515DCXR dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>NC338059</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>EMD Millipore</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td><td>EMD Millipore</td><td>239805</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>ACROS Organics</td><td>41095-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &amp;amp; Sealant</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0275</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)&lt;br/&gt; tetraacetic Acid (EGTA)</td><td>ACROS Organics</td><td>409911000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;12-544B</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salts (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td><td>EMD Millipore</td><td>391340</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil without autofluorescence</td><td>Leica</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin, Free Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-230-5804</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>51985034</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1570</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Monobasic</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>SimplePCI Image Analysis Software</td><td>Hamamatsu</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterivex-GV 0.22 &amp;micro;m filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGVB1010</td><td></td></tr><tr><td>Till Polychrome V Xenon lamp</td><td>Till Photonics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

סידן תאיים (Ca 2 + ) transients עורר על ידי גירויים תאיים ליזום מספר רב של תהליכים ביולוגיים אורגניזמים חיים. במרכזו של שחרור סידן תאיים הם האורגנים הגדולים אחסון סידן תאיים, reticulum endoplasmic (ER) ואת reticulum sarcoplasmic מיוחדים (SR) בתאי שריר. שחרור דינמי של סידן מן האברונים האלה מתווכת על ידי קולטן ryanodine (RyR) ו inositol קולטן 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) עם מילוי המתרחשים באמצעות משאבת הסרקו / endoplasmic סידן ATPase (SERCA). חיישן סידן מקודד גנטית (GECI) בשם Catcher נוצר כדי לפקח על שחרור סידן מהיר ER / SR. הנה, פרוטוקולים מפורטים עבור transfection וביטוי של שיפור, ER / SR- ממוקד GECI Catcher + ב HEK293 ו C2C12 תאים ויישומה ניטור IP 3 R, ריר, SERCA משאבת בתיווך סידן חולףS בתאים HEK293 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתואר. קולטן אגוניסט או מעכב של בחירה הוא התפזר פתרון קאמרי ואת השינויים בעוצמה נרשמות בזמן אמת. עם שיטה זו, ירידה סידן ER נראה עם הפעלת ריר עם 4-chloro-m-cresol (4-cmc), ההפעלה העקיפה של IP 3 R עם אדנוזין טריפוספט (ATP), וכן עיכוב של משאבת SERCA עם cyclopiazonic חומצה (CPA). כמו כן, אנו דנים בפרוטוקולים לקביעת באתרו K ב ו לכמת הבסיס [Ca 2 + ] בתאי C2C12. לסיכום, פרוטוקולים אלה, המשמשים יחד עם Catcher + , יכולים לעורר קולטן בתיווך סידן בתיווך עם יישום עתידי בחקר ER / SR סידן פתולוגיות הקשורות.

סעיף זה ימחיש את התוצאות שהושגו בשיטות שתוארו קודם לכן באמצעות ה- GECI Catcher המיועד ל- ER / SR המיועד לזיהוי שינויים ב- ER / SR Ca 2 + באמצעות מסלולים שונים בתיווך קולטן. איור 1 ממחיש ER ?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול נדון גם.

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup&gt; 2+</sup&gt; חיישן Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

monitoring-ersr-calcium-release-with-the-targeted-ca2-sensor-catcher

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

14.8K Views.  Georgia State University.  אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול ?...

Video: Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Neuroscience

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Medicine

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

דיסקציה של Ca מקומי2 + אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca2 + אינדיקטורים

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; Gaussia</em&gt; לוציפראז SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג'ין מזהה Ca^{2 +} ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

דיסקציה של Ca מקומי^{2 +} אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca^{2 +} אינדיקטורים

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

ההדמיה המקומית Ca

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש