הייתי רוצה להכיר מחלקת מחקר ללימודים מתקדמים על מתן כספים כדי לתמוך במחקר שלי ואת המחלקה לרפואה השוואתי על ערנותם וסיוע. אני רוצה גם להכיר את המחלקה לפיזיולוגיה על תמיכתם הדרכה כמו גם סטודנטים וטכנאים במעבדה שלי עזרתם. לבסוף, אני רוצה להודות הרוחני הפוסט דוקטורט שלי, ד&quot;ר צ&#39;רלס א &#39;מורי, על ההזדמנות הכשרה במהלכן למדתי את microsurgery העכבר.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירי ניתוח סטרילי (טבלה 1) ו - 3 &quot;applicators כותנה היטה ממוקמות על underpad סטרילית. מעקר חרוז (Germinator 500) מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים (גיל:&gt; 6 שבועות; wt:&gt; 18g) מורדמים עם זריקה ip של 20μl / g BW של tribromoethanol (250mg/kg, משך כ - 40 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העכברים אינם מגיבים לצבוט-הבוהן, חומר סיכה סטרילי (דמעות מחודשת) על העיניים כדי להגן עליהם מפני יובש וגם את הצד השמאלי של החזה מצופה מקריח (למשל Nair) כדי להסיר את הפרווה מן העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקריח הוא נשטף עם מים זורמים חמים בבטאדין / אלכוהול בניקוי משמש כדי לחטא את אזור הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר מונח על משטח חם מקורר באופן איזוטרמי deltaphase אשר קבוע לטבלה פרספקס. כל איבר משותק באמצעות קלטת חוט עבה ממוקם בצורה אופקית מתחת לשיניים העליונות להחזיק את הלסת העליונה במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטבלה במאונך אור סיב אופטי הוא זרח ישירות על גבי באזור הצוואר לתאורה הושט. זה דורש המיקום המדויק כזה הפתיחה של הגרון נתפסת פתח מואר היטב, ובכך לאפשר קנה הנשימה כדי להיות דמיינו כדי להקל על החדרת צינורות PE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות מחוברת למכונת הנשמה לאחר מכן (מחוברת של 95% O 2 / 5% CO 2) לנהל את לחץ מתמיד אוורור חיובי (Topo ההנשמה; שיעור 125 נשימות / דקה; שיא inspiratory 10-12 לחץ CMH 2 O; לב * : הגדרות להשתנות עם זן ומין 1-3). לאחר אוורור הוא אושר על ידי תנועות החזה סינכרוני, החיבור הוא קבוע כרית עם קלטת כדי למנוע האקסטובציה במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים שיניים למשוך העור למעלה מן החזה, להב אזמל סטרילי # 10 מחוברת ידית # 3 האזמל משמש לביצוע חתך 1.5cm במקביל את העור עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Curved microscissors Vanna משמשים לחתוך את השרירים הפקטוראלי ולעשות חור קטן בשריר צלעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרייט, microscissors בוטה משמשים לחתוך 3 צלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספקולום 9mm עיניים ילדים משמש לחזור בו כלוב הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים מעוקל, למשוך את קרום הלב מן הלב להשתמש במלקחיים שיניים בעדינות כדי לקרוע אותו פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בעל מחט Castroviejo, נקודת קוני 6 מ&quot;מ 3 / 8 האשכולות המחט תפר 8-0 פוליאתילן מתחת הקדמי השמאלי היורד לב כלילית (לאורך ציר זמן של הלב) בניצב אליו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ליגטורה זמני כי ניתן להסיר את reperfusion מתוזמן, פיסת סטרילי 0.5-1cm של PE90 מושם על הלב במקביל העורק הכלילי. תפר, שבה יש היכרות קודמת כרך תחת העורק הכלילי, קשורה מכן בצינור. באותו זמן היא להשתחרר, ליגטורה הוא רופף. זה יכול להיות חזר כרצונכם ואת הזמן של חסימה / reocclusion יכול להיות שונה 4. בהתאם לאורך הפרוטוקול ואת סוג של הרדמה המשמשים, תוספי עשוי להיות נחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגבי חסימה קבועה, המיתר שילב תחת העורק הכלילי הוא קשור פשוט. לחלוט dyskinesia ניכרים ואת הקצה הארוך של תפר הוא חתך 5-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקה intramyocardial (ים), מזרק סטרילי המילטון עם מחט סטרילית 30 מד משופעים מוחדר בבסיס הלב מעל אזור הפגיעה בצד ימין של המיתר. המחט היא מתקדמת אז לאזור הפציעה ומסוגר מעט כך שפוע ניתן לראות כ בבית באזור הגבול. חלק מהפתרון של המזרק (2-3μl) מוזרק לתוך הלב מחט מוחזק במקום. מזרק היא נסוגה עוד 1-3mm ושאר הפתרון הוא מוזרק. מזרק נערכת במקום עד בועה כי הוא נוצר על ידי הפתרון מתפוגג. המחט מוסרת אז. אם יש דימום כלשהו, ​​המוליך כותנה שקצהו נלחץ בעדינות על גבי אתר הכניסה מחט עד שהדימום ייפסק 5-7. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מניפולציות שריר הלב הושלמו, retractors הצלעות יוסרו את חלל בית החזה סגור עם 2-3 תפרים מזרן באמצעות 6-0 תפר surgipro. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתיים ושלוש התפרים המזרן עשויים אז כדי לסגור את השרירים הפקטוראלי, 1-3 טיפות של 1:10 marcaine 0.25% בשנת מלוחים סטרילית (עכבר 0.1ml/25g) על השריר ואז 2-3 תפרים מזרן נעשים לסגור את העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר הוא להסיר את מכונת ההנשמה. הנשימות הקצובות פעם, מהירה, רדודה מאומת, העכבר יכול להיות extubated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5ml מלוחים חמים סטרילי מוזרק אל תוך החלל התת עורית הגב ואת העכבר מונח על כרית חימום בכלוב עד שהוא חוזר הניידות (1 מינימום שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הניסויים הישרדות, עכברים ממוקמים בחזרה לתוך כלובים וחזרו ביבר עד הזמן של הקרבה. 2 במהלך הימים הראשונים, לחלח המזוןשהונחו על רצפת הכלוב, כדי להקל על האכלה (ולכן הם לא חייבים להגיע עד אשר עלולים לגרום כאב) ואת עצירות צריכה להינתן כל 6-12hr. הטיפול שלאחר הניתוח כולל גם ניטור יומיומי בשבוע הראשון כדי לוודא ניידות נאותה, טיפוח, והרגלי אכילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכשירים הם כירורגית נמחק עם אתנול ונוסף מעקר את החרוז לפני הניתוח הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמנו של הקרבה, עכברים מורדמים עם נתרן pentobarbital (65mg/ml: 55-65 מ&quot;ג / ק&quot;ג). כאשר מטוס נאותה הרדמה מושגת, חלל בית החזה נפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הלב עדיין פועם, מזרק עם מחט 23 מד המכיל אשלגן כלורי קר (KCl, 30mm) או 2,3-butanedione monoxime (^ נם; 10mm) משמש כדי לנקב את אזור הבסיס האחורי של החדר ואת הפתרון מוזרק באיטיות אל תוך החדר עד הלב הוא נעצר תרויח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לב מוסר, מזרק המכיל PBS משמש retrogradely perfuse לשטוף את הלב כדי להסיר כל הדם שנשאר. עבור מחקרים חריפה, בסוף התקופה reperfusion, הנער מחדש ligated בנקודה המקורית של חסימה. פתרון המכיל כחול 1% של אוון מוזרק לתוך האאורטה. לאחר לב מופק, הוא חתך רוחבי לתוך 3 חלקים של עובי שווה, מודגרות ב -1% 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד, הדמיה עבור ניתוחים morphometric 11. עבור מחקרים כרונית, הלב הוא שקוע אז מקבע, מעובד אז מוטבע על פי נהלים שגרתיים. שקופיות אז יכול להיות מוכתם בהיסטולוגיה הדמיה עבור ניתוחים morphometric (באמצעות Scion, NIH תמונה J, או Image Pro Plus) 9,10,12. </li></ol> נציג תוצאות: כאשר נעשה בצורה נכונה, שיעורי ההישרדות של עכברים (זכרים: גיל 8-10 שבועות, 22-28g, נקבה: גיל 10-12 שבועות, 20-26g) הם: מעל 90% ב איסכמיה חריפה / reperfusion וניסויים נפשית מראש איסכמי, על 85% במחקרים קשירת עורק קבוע, וכ -80% עבור זריקות intramyocardial. מאז הפציעה מוקדם יותר בקלות גלוי על ידי שינויים מטבוליים מאשר קביעה המבנית, גודל האוטם ב איסכמיה / reperfusion וניסויים נפשית מראש איסכמי מבוצע על ידי החדרת צבע 1% של אוון כחול אל אבי העורקים אשר perfuse הלב שאינו מסופק על ידי הנער ( איור 1 א). פעם מסירים את הלב וחותכים רוחבי במחצית, הרקמה מודגרות בתמיסה של 1% כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium למדידת גודל האוטם (איור 1B). האזורים נמדדים באמצעות Scion או NIH תוכנת הדמיה אשר יכולים להיות מכויל באמצעות מיקרומטר הדמיה בהגדלה זהה. מספרים אלה משמשים לחישוב שטח בסיכון / האוטם החדר השמאלי גודל / שטח בסיכון 11. ההבדלים מסננים יכול לגרום לשינויים במשקל הגוף ואת גודל הלב ולכן יש להיזהר לנרמל אמצעים אלה משקל לב, משקל גוף, או אורך השוקה לצורך השוואתי. קבע קשירת העורק גורמת לשינויים מבניים ברוטו כגון נמק, קיר דליל, והתרחבות קאמרית. השוואה של השפעות של טיפול ו / או זמן על גודל האוטם ו נמק יחסית החדר השמאלי, באזור תא, קיר במחיצה בין החדר השמאלי ואת חינם עובי דופן במודל חסימה קבועה (איור 2 א) ניתן גם למדוד באמצעות Scion או NIH הדמיה התוכנה. מכתים קולגן עם ירוק picrosirius אדום / מהיר (תרשים 2B) ניתן להשתמש כדי למדוד סיסטיק insterstitial אשר וקושרת את המדדים תפקודית של 8-10 קיר התקשות. התמונה באיור 3 מייצג את ההפצה של פתרון 6ul (כחול של אוון) המוזרק לאזור הגבול של הלב בעקבות קשירת עורק קבע. שימו לב כי זה ממשיך בכיוון של הפגיעה, כמו גם לעבר בסיס וגם transmurally. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. א &#39;אוון&#39; s כחול מוזרק האאורטה לפני כריתה. תמונה זו מראה את האזורים perfused של הלב (מוכתמים) ואזור occluded (בלא כתם). אוון ב &#39;s כחול מכתים TTC בעקבות פציעה איסכמיה / reperfusion חריפה. זוהי תמונה מייצגת (20x) מראה את התפלגות צבע כחול אשר מוכתם האזורים unoccluded וכן מכתים TTC של רקמת קיימא מבחינה מטבולית (אדום). אזורים נקרוטי לא ללכלך ולכן הם נשארים חיוורים (המפורטים). <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. א Hematoxylin ו eosin הכתם. זוהי תמונה מייצגת (20x) של H &amp; E מכתים לב העכבר לחתוך רוחבי ב 4 ימים דרך באזור האוטם לאחר MI (20x). * מציין נמק רקמות, החצים מצביעים על רקמת פרור, RV = זכות החדר ואת LV = החדר השמאלי. B. Picrosirius אדום וירוק מהיר הכתם. זהונציג תמונה (20x) של picrosirius אדום / ירוק מכתים מהיר של חתך של הלב העכבר 4 שבועות לאחר אוטם לבבי. הכתמים הציטופלסמה ירוק סיבי קולגן אדומות. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. ההפצה כתם כחול אוואן לצבוע הבאים הזרקה intramyocardial 6ul. זוהי תמונת מראה נציג ההפצה הגלובלית transmural של צבע כחול של אוון בכל לב את הדברים הבאים הזרקה intramyocardial 6ul על אזור הגבול מיד לאחר קשירת עורקים כליליים (12x).

פרוטוקול זה אושר על ידי בעלי חיים והיא בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש ב מזרח קרוליינה האוניברסיטה.

מחלת לב כלילית ממשיך להיות בריאות epidemiologically ו כספית משמעותית בעיה ציבורית. מחקר בסיסי ניכרת עדיין יש צורך להבין את המנגנונים שבאמצעותם פציעה שיפוץ להתקדם ואיך הרפוי פוטנציאליים עשויה לווסת את התהליכים האלה, אם הם להיות מפותחים לשימוש קליני. המכרסמים הנפוץ ביותר ואת מגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטית זמין עושה את זה מין מודל אטרקטיבי יותר. אמנם יש הבדלים בין עכברים מינים אחרים, יש יתרונות רבים למודל Murine. שימוש בהיקף לנתח פשוט או זכוכית מגדלת ותנאי מואר היטב כדי לאפשר את vasculature בקלות לראות (ברוטו עבור האנטומיה מפורט של כלי הדם, ראה Salto-Tellez et al. 2004, 13). כדי להפחית את הסיכון לתמותה לאחר הניתוח, חשוב מאוד כדי למנוע ניתוק כלי גדול מאז נפח הדם הכולל של עכבר 25 גרם פחות מ 2ml 14. במקרה של דימום יתר מתרחשת, יישום עדין של לחץ או צריבה לאתר ניתן להשתמש כדי לעצור את הדימום. הליך זה יכול להיות גם שינוי במגוון של דרכים. למשל, בעכברים ניתן בהרדמה באמצעות isoflurane, קטמין / xylazine, או נתרן pentobarbital ובחירת המתאימה נקבעת על פי משך הזמן של פרוטוקול 15-18. רפלקס הבוהן קמצוץ הוא המדד הנפוץ ביותר של עומק ההרדמה. יתר על כן, כדי לשפר את הסיכוי להישרדות ארוכת טווח, חוקרים אחדים להשתמש בסמים antiarrhythmic כגון לידוקאין כדי להפחית את השכיחות של הפרעות קצב קטלניות 19,20 עם זאת, יש לקחת בחשבון כי זה לאחרונה הראו תכונות antiapoptotic ב חריפה מודל 21. כמו כן, כדי להפחית את הכאב שלאחר הניתוח, משככי כאבים כגון עצירות יכולה להינתן במשך 48 השעות הראשונות לאחר הניתוח 3,16,17,22,23. כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בזמן ניתוח (בעיקר בפרוטוקולים יותר), בדיקה רקטלית בסדרה עם כרית חימום משמש לעתים קרובות במקום כרית מקורר באופן איזוטרמי. עבור איסכמיה / reperfusion ו / או איסכמי מראש או postconditioning: את משך הזמן של חסימה (ים) ו reperfusion (ים) ניתן לשנות, כי חסימה קבועה, בגודל של האוטם עשוי להיות שונה על ידי התאמת המיקום של המיתר; עבור זריקות intramyocardial (תאים למשל, חלבונים), לא יכולה להיות במקומות 1-3 הזרקת ונפח לכל זריקה יכול להיות עד 15 24 μl. אם התאים להיות מוזרק, מד המחט בשימוש (בדרך כלל 26-30) 5,25,26 יש לבחור בהתבסס על גודל התאים כך את הקוטר הפנימי של המחט הוא גדול מספיק כדי למנוע את הסתייגותו. כדי למנוע בלבול עקב תהליכים דלקתיים מופעלות על ידי הניתוח, חוקרים אחדים דיווחו על שימוש מוקש כי היא מניפולציה vivo לשעבר כדי לחסום את ליבם ואת reperfuse בעכבר החזה סגור בשלב כלשהו לאחר הניתוח 27-29. לאחרונה, גאו et al. 30 הראו כי חסימה זמניים וקבועים יכול להתבצע ללא צורך אוורור במעבדות ספורות החלו להשתמש אולטרסאונד כדי לבצע סגור החזה intramyocardial זריקות 25,31. מאז המחקר הראשון הוכחת ההיתכנות של ligating לב כלילית אצל עכברים פורסם על ידי ג &#39;ונס ו אולסון בשנת 1954 32, ורבים אחרים אימצו את מודל שונה הוא ללמוד היבטים שונים של פגיעה בשריר הלב שיפוץ 3,33-45. טבעו של עכברים מבחינת גודל, יכולת הרבייה, והוצאות יחסית פחות לרכישה ותחזוקה להפוך את זה למין כלי מושך עבור מגוון רחב של מחקרים פיזיולוגי pathophysiologic. ככל המזעור של הטכנולוגיה עבור הדמיה ההתקדמות vivo 46-49, כמו גם האמצעים לבצע ולנתח הגנומיקה בקנה מידה גדול proteomics, הקרנת סמים, היעילות של טיפולים מבוססי תאים ו / או חלבון, כמו גם biomaterials 50-64, בשילוב עם מגוון רחב יותר ויותר של מניפולציות גנטיות המוענקת על ידי רקמה או בכל מקום העכברים הטרנסגניים או מוטציה / בנוקאאוט ספציפי, המודל Murine של אוטם שריר הלב ללא ספק להמשיך להיות כלי רב ערך בהערכת פגיעה לבבית חריפה שיפוץ לטווח ארוך. לכן, יש ערך מוטלת בספק להיות מסוגל לבצע ניסויים אלו אמין reproducibly.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Long Vanna Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-159</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-161</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps &#x2013; straight, 1x2 teeth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scalpel handle #3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-64</td>
<td>#10 sterile blade</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps &#x2013; half curved serrated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Castroviejo Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>18-1828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cook Eye Speculum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>18-63</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgipro II 8-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Suture Express</td>
<td>VP-900-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Prolene 6-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Suture Express</td>
<td>8776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Germinator 500 Bead Sterilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellpoint Scientific</td>
<td>65369-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deltaphase isothermal pad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Braintree Scientific</td>
<td>39DP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton syringe - 25&mu;l</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>80430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge beveled needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7803-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ventilator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>TOPO</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Watch this Scientific Journal Video about Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction at JoVE.com

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

מניפולציות גנטיות רבות ו / או זריקות intramyocardial של גנים, חלבונים, תאים, ו / או biomaterials באים על גבי מימד הזמן במחקרים של פגיעה איסכמיה / reperfusion חריפה שיפוץ כרונית בעכברים. וידאו זה ממחיש את הליכי microsurgical עבור איסכמיה / reperfusion, קשירת עורק כלילי קבע, ומחקרים הזרקת intramyocardial.

קשירת עורקים כלילית לבין הזרקת Intramyocardial ב מודל Murine של אוטם

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

coronary-artery-ligation-intramyocardial-injection-murine-model

Research

JoVE Journal

Medicine

51.7K Views.  East Carolina University. מניפולציות גנטיות רבות ו / או זריקות intramyocardial של גנים, חלבונים, תאים, ו / או biomaterials באים על גבי מימד הזמן במחקרים של פגיעה איסכמיה / reperfusion חריפה שיפוץ כרונית בעכברים. וידאו זה ממחיש את הליכי microsurgical עבור איסכמיה / reperfusion, קשירת עורק כלילי קבע, ומחקרים הזרקת intramyocardial.

Video: Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

טכניקה שונה לקשירת עורקים הכליליים בעכברים

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

דגם של שריר הלב איסכמיה reperfusion הפגיעה Murine באמצעות קשירת של העורק השמאלי קדמי יורד

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure.
Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload. Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion. In contrast, the infarct area at 24 hr after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.
Besides the model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery, the technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented in detail.

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

קשירת קבע של העורק השמאלי קדמי יורד כלילית בעכברים: דגם של Remodelling אוטם שריר לב ופוסט-אי ספיקת לב

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

הערכת אולטראסאונד מבוססת של עורקים הכליליים זרימה והזרימה כלילית ריזרב שימוש בדגם עומס יתר הלחץ בעכברים

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by reduced blood supply to the heart, resulting in the loss of oxygen to and the ensuing necrosis of the heart muscle. The MI model has gained popularity for its use as a short-term ischemia-reperfusion model and a long-term permanent ligation model. Below, we describe a reliable method for the permanent ligation of the LAD. With mouse genetic engineering technology becoming more advanced, and with an increasing availability of quality murine surgical instruments, the mouse has become a popular model for MI surgeries. Our surgical model incorporates the use of an easily reversible anesthetic for the rapid recovery of the mouse; a minimally invasive endotracheal intubation without involving a tracheotomy; and a thoracentesis through the original thoracotomy site without creating an additional incision in the chest, as is done in some other methods, to effectively remove excess blood and air from the chest cavity. This method is comparatively less invasive than other methods, which dramatically reduces surgical and post-surgical complications and mortality and improves reproducibility.

Murine Left Anterior Descending LAD Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

Murine שמאל Anterior יורד (LAD) קשירת עורקים הכליליים: דגם משופר או פשוט עבור אוטם שריר לב

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

הזרקת Intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית ואספקה תא בדגם פרה גדולה

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

אספקה תוך-תוך-קרדיאלית מושהית של תאי גזע לאחר פציעת איסכמיה רפרציה במודל מורין

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of transplanted cells within the injured myocardium, limiting their therapeutic efficacy. Recently, the use of scaffolding biomaterials has gained attention for improving and maximizing stem cell therapy. The objective of this protocol is to introduce a simple and straightforward technique to transplant bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using injectable hydroxyphenyl propionic acid (GH) hydrogels; the hydrogels are favorable as a cell delivery platform for cardiac tissue engineering applications due to their ability to be cross-linked in situ and high biocompatibility. We present a simple method to fabricate MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) and evaluate their survival and proliferation in three-dimensional (3D) in vitro culture. In addition, we demonstrate a technique for intramyocardial transplantation of MSC/hydrogels in mice, describing a surgical procedure to induce myocardial infarction (MI) via left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and subsequent MSC/hydrogels transplantation.

Stem cell-based therapy has emerged as an efficient strategy to repair injured cardiac tissues after myocardial infarction. We provide an optimal in vivo application for stem cell transplantation using gelatin hydrogels that are able to be enzymatically cross-linked.

השתלה תוך-שרירית של הידרוג'ל להזרקה בטעינת MSC לאחר אוטם שריר הלב במודל מורין

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...