이 작품은 NSF 상을 DB​​I 0,852,891에 의해 투자되었다. 이 작품의 일부는 공동 계약 번호 PHY0120999 아래 캘리포니아 데이비스 대학에 의해 운영 Biophotonics 과학 기술, 지정된 NSF 과학 기술 센터 센터 투자했다.

1. 일부 보험이 시스템 내의 래맨 샘플을 준비하고 배치에서 찍은해야합니다. <ol><li> 시스템이 일반적으로 매우 짧은 작업 거리와 함께 매우 높은 수치 조리개 목표를 이용하게하기 때문에 샘플은 coverslip에 표시됩니다. 생물 학적 시료는 일반적으로 Attofluor 셀 챔버 (Invitrogen, 칼스 배드, CA)에 탑재된 제 1 두께 coverslip에 표시됩니다. </li><li> 특히 액체 샘플, 인간에게 유독 사람은 실리콘 에폭시를 통해 개방에 초경 coverslip있는 작은 유리병에 배치됩니다. 병 그 다음 측정을 위해 거꾸로 수 있습니다. </li><li> Google 시스템은 펌프 및 신호 펄스의 정확한 타이밍에 의존하기 때문에, 우리는 목표를 위아래로 번역 우리 현미경의 종래의 초점 조정을 사용하지 않기로 제약합니다. 이것은 추가 및 시스템에서 광 경로를 차감됩니다. 대신, 우리는 자체의 독립적인 포커스를 제어 현미경 스테이지 위에 장착 보조 무대에서 우리의 샘플을 넣으십시오. </li></ol> 2. 시간 문이 래맨 스펙트럼을 이용하려면, 여기 빔 제대로 준비를해야합니다. <ol><li> Sapph 레이저 (카멜레온, 일관된 시스템, 산타 클라라, CA) : 우리는 빛이 2.4 W 조정할 펄스 티의 새로운 시작. 80 MHz의 펄스 열차의 각 펄스 에너지의 30 NJ가 140 FS의 시간적 너비를 가지고 있으며, ~ 6 NM의 스펙트럼 대역폭과 808 nm의 중심 스펙트럼 있습니다. </li><li> 레이저 캐비티를 다시 입력으로부터 - 반사를 방지하기 위해 조명은 패러데이 아이 솔 레이터를 통해 전달됩니다. 패러데이 아이 솔 레이터 앞에 배치 반 파장 판은 시스템에 보낸 총 전력의 지속적인 튜닝을 수 있습니다. </li><li> 6 NM 가장 래맨 모드를 해결하기 위해 너무 광범위 대역폭이기 때문에, 빔은 808 nm의 중심은 매우 좁은 (0.8 nm의 FWHM, 앤도버 공사, 살렘, NH) 대역 통과 필터를 통해 전송됩니다. </li><li> 빛이 후 결정이 (CASIX, 복주, 복건, PR 중국) 808의 nm의 404 nm의로의 파장을 절반으로 5mm β - 바리움 Borate (BBO)에 비염 색 성의 이중어 (F = 100mm)에 의해 초점을 맞추고 있습니다. BBO 크리스탈은 팁 및 틸트 컨트롤 마운트에 배치하고, 또한 번역 무대에서 마운트됩니다. 파장 변환의 효율성을 최대화하기 위해, 결정은 이중어의 초점에 대해 정확하게 대칭 배치하고, 그 결정 축은 들어오는 광선의 편광에 정렬과 함께해야합니다. </li><li> 파장 변환 효율은 편광에 의존하기 때문에, 샘플로 보내 빛의 양을 제어할는 패러데이 아이 솔 레이터 후 하반기 - 웨이브 플레이트를 삽입하여 얻을 수 있습니다. 이 waveplate 회전하여 샘플로 보내 빛의 강도는 독립적으로 펌프 빔 (아래에 설명되어 수)에 보낸 강도 조정할 수 있습니다. </li><li> 파장 - 변환 빛이 종료 광선이 현미경의 목표의 뒤에 조리개를 채울 정도로 크고, 그리고 거꾸로 현미경 (IX - 71, 올림푸스로 이동합니다 그러한 선택한 두 번째 비염 색 성의 이중어 (F = 500mm)에 의해 recollimated입니다 이 스티어링 거울을 통해 센터 밸리, PA). </li><li> 시스템의 가장 단일 구성 요소 내에 위치해 광학 요소되고있는 현미경의 목표는, 광학 축을 정의합니다. 이 축에 여기 빔을 정렬하려면 미러는 현미경의 샘플 비행기에 배치됩니다. CCD 카메라 시대 (μEye, IDS, Obersulm, 독일) 현미경의 영상 포트에 연결된에서 백 반영 레이저 광선을 관찰하면서 두 조향 미러는 다음 반복 조정됩니다. 카메라에있는 이미지가 현미경의 필드의 전망을 중심으로 중이라고 가정할 때, 광선의 초점 자리가 Z - 축을 따라 목표의 현미경 칩 및 번역 중심에서 축 중심 지점을 변경하지 않는 것입니다 defocused 빔니다. </li><li> 샘플은 샘플 비행기에 배치하고 함께 조사하면 레이저 광 래맨 산란이 발생합니다. 현미경 목표 아래 배치 이색성 필터는 현미경의 측면 포트에 래맨 흩어져 빛을 연출, 여기 빔의 파장 - 이동 래맨 흩어져 빛을 (및 형광) 분리. 현미경은 신호 빛이 collimated 현미경에서 나온다 그러한이 경로 내의 모든 렌즈를 제거 바뀌었습니다. </li><li> 현미경에서 새로운 신호 빔은 글랜 - 톰슨 polarizers의 명확한 구경보다 큰이기 때문에, 0.47x 망원경은 광선을 축소하는 데 사용되는 두 비염 색 성의 doublets (F1 = 75mm, F2 = 35mm)의 건설. </li><li> 신호 표시등은 다음 실험실 프레임에 수직과 관련하여 0 °에서 지향 글랜 - 톰슨 편광으로 편광, 그리고 그것이 펌프 빔과 recombined하는 이색성 거울로 이동합니다. </li></ol> 3. 피크 효율에서 작동하는 광 게이트 위해서,주의뿐만 아니라 펌프 빔 (커 빔)의 준비에 촬영해야합니다. <ol&gt; <li> 펌프 펄스 먼저 신호 빔의 최종 크기를 일치 두 비염 색 성의 doublets (F1 = 35mm, F2 = 100 ㎜)과 건설 망원경으로 0.35x로 확대됩니다. </li><li> 펌프 빔은 다음 펌프 및 신호 펄스 (아래에 설명되어 수 조정)의 시간적 중복을 보장하기 위해 조정할 수 있습니다 선형 변환 스테이지에 배치 직각 프리즘으로 구성된 지연 라인으로 전송됩니다. </li><li> 지연 선 후, 빔은 실험실 프레임에 수직에 대하여 45 °의 지향 반 파장 판과 편광을 통해 전송됩니다. 그것은 비선형 매체에 도달하면 이것은 펌프 빔의 적절한 편광 상태를 보장합니다. </li><li> 빛이 후 잘게 펌프 빔의 위치를​​ 조정하는 데 사용되는 두 스티어링 거울, 압전 컨트롤과 함께 하나의에서 반영 같은 신호 빔과 공간이 중복되는. 중복은 두 위치 한 닫고 ​​대들보가 결합되어 이색성 거울에서 멀리 떨어진 하나 펌프 및 신호 광선을 관찰함으로써 얻어진다. 가까운 지점과 멀리 지점에서 빔을 오버랩하는 압전 미러에 두 개의 대들보를 중복을 가장 먼저 조향 미러를 사용하여 펌프 빔은 신호 빔을 정확히 collinear을 만들 수 있습니다. </li><li> 두 대들보가 결합으로 커 게이트 및 수집 시스템은 수집된 시간 문이 신호를 최대화하기 위해 설정됩니다. </li></ol> 4. 두 대들보가 결합으로 커 게이트 및 수집 시스템은 수집된 시간 문이 신호를 최대화하기 위해 설정됩니다. <ol><li> 펌프 및 신호 빔을 먼저 비선형 매체 내의 흥미로운 래맨 산란에서 잔여 여기 조명을 방지하기 위해 404 nm의 6의 OD를 가진 이색성 필터를 통해 전달됩니다. </li><li> 펌프 및 신호 들보는 모두 비선형 물질을 포함하는 1cm의 pathlength 석영 쿠베트에 비염 색 성의 이중어 (F = 35mm)의 초점을 다음 있습니다. 적당히 높은 비선형 인덱스 (CS 2보다 높은), 그리고 적당히 짧은 시간적 응답 (&lt;2 PS)하는 데 모든 비선형 자료는 여기를 이용하실 수 있습니다. 이 실험을 위해, 우리는 비선형 인덱스 N 2 = 3.1 × 10 -18 m 2 / W.을 가지고 이황화 탄소, CS 2 사용 빛이 그런 다음 첫 번째와 동일 초점 거리와 두 번째 쌍으로 된 것으로 recollimated 있습니다. </li><li> 광선은 다음 808 nm의 10의 OD를 결합하여 그 흡수와 간섭 필터의 집합을 통해 다음 통과 및 회전 마운트에 글랜 - 톰슨 분석기, 그리고 수 있습니다. </li><li> 마지막으로, 신호 조명은 섬유가 X, Y, 그리고 Z &#39;의 번역을 허용하는 단계에 마운트되어 50 μm의 다중 모드 광섬유로 비염 색 성의 이중어 (F = 35mm)의 초점을 맞추고 있습니다 섬유는 다음 첨부 CCD 카메라 (SP2300i 각각 Pixis 100B, 프린스턴 인 스트 루먼트, 트렌 튼에서 제조한 모두, NJ)과 상업 영상 분광기로 결합됩니다. </li><li> 수집된 신호를 최대화하기 위해 수집 시스템을 정렬하려면 분석기은 0으로 설정됩니다 °과 톨루엔의 테스트 샘플은 샘플 비행기에 배치됩니다. X, Y, 그리고 섬유 마운트의 Z 컨트롤을 조정하여, 수집된 래맨 신호가 최적화되어 있습니다. </li><li> 펌프 및 신호 빔의 적절한 공간과 시간적 중복을 보장하기 위해, 거울은 현미경의 샘플 비행기에 배치됩니다. 404 NM 필터는 시스템에서 제거됩니다. 분석기는 90 ° 회전 retroreflected 404 NM 빔 그것은 카메라를 포​​화하지 않는 등 조정 강도와 분광기로 전송됩니다. 에서 펌프 빔과 함께, 분석기는 전송된 404 nm의 신호를 최소화하기 위해 회전합니다. 펌프 빔 다시 켜져있는 404 나노미터 빛의 전송이 증가하기 시작 때까지 지연 단계는 천천히 조정합니다. 그런 다음, 반복하여 지연 무대, 압전 미러를 조정하고, X, Y, 그리고 Z 섬유의 컨트롤은, 하나는 신호를 극대화할 수 있습니다. </li><li> 404 NM 빔과 래맨 흩어져 빛을 시스템을 통해 약간 다른 경로를 걸릴 수 있습니다 역전사이 반영되기 때문에 최종 조정은을 변경하여 샘플 단계와 약간 조정 정렬에 강한 래맨 scatterer (예 : 톨루엔 등) 배치에 의해 만들어진 지연 무대, piezeo - 전기 거울, 그리고 섬유의 X, Y, 그리고 Z 컨트롤은 래맨 신호를 최적화할 수 있습니다. </li></ol> 5. 한 시간 문이 래맨 스펙트럼의 컬렉션은 몇 가지 스펙트럼의 취득 시스템 아티팩트에 대한 해결하기 위해 필요합니다. <ol><li> 분석기가 0 °에 여기 빔과 해제 펌프 빔 설정을 통해 &quot;ungated&quot;스펙트럼은 시간 게이팅 시스템의 혜택없이 취득 될 스펙트럼을 나타내는, 촬영입니다. </li><li> 분석기는 90 °, 여기 빔과 펌프 빔 아직 해제로 설정으로 다시 지상 스펙트럼은 시스템에서 polarizers 및 기타 요소를 통해 유출 길잃은 빛의 양을 나타내는, 촬영입니다. </li><li> 와 함께 90에서 남은 분석기 °그리고 모든 광선, &quot;문이&quot;스펙트럼이 펌프 빔의 존재에 의해 넘어 polarizers을 통해 허용 래맨 흩어져 빛을 대표, 촬영입니다. </li><li> 마지막으로, 아직 90 °에서 분석기로, 여기 빔 해제 및 펌프 빔은 두 번째 백그라운드 스펙트럼은 분광기를 입력 808의 NM 라이트의 잔여 금액의 &quot;문이&quot;스펙트럼에 기여 대표, 촬영입니다. </li><li> 또한, 스펙트럼은 카메라와 전자 제품의 기준 &quot;어둠&quot;의 신호 레벨을 특성화,에서 모든 레이저와 함께 이루어집니다. </li><li> 일반적인 문제를 몇 분 걸쳐 통해 데이터를 수집하면 - 스펙트럼 종종 긴 통합 시간을 필요로하기 때문에, 그것은 우주 광선의 적절한 교정 수 있도록 여러 조각 (프레임)에 해당 통합 시간을 깰 필수적입니다. </li></ol> 6. 일단 인수, 여러 처리 단계는 데이터의 품질과 외관을 개선하기 위해 도움이됩니다. <ol><li> 첫째, 모든 스펙트럼은 어둡 &quot;어둠&quot;의 스펙트럼을 빼서에 의해 수정됩니다. </li><li> 우주 광선에 대한 해결하려면 하나의 인수를 구성 여러 개의 프레임은 픽셀별로 픽셀 단위로 서로 비교됩니다. 모든 프레임에 걸쳐 해당 픽셀에 대한 평균 값에서 2 중간 편차 이외의 떨어지는 모든 프레임의 모든 픽셀에 대한, 그 픽셀의 가치는 모든 프레임에 걸쳐 평균 값으로 대체됩니다. </li><li> 우주 레이 수정된 프레임은 다음 평균 및 Savitzky - 골레이 필터 1 smoothed 있습니다. </li><li> &quot;진정한&quot;문이 스펙트럼을 추출하려면, 우리는 측정 문이 스펙트럼에서 &quot;펌프 전용&quot;스펙트럼 &quot;여기 전용&quot;을 빼야합니다. </li><li> 마지막으로, 문이 및 ungated 스펙트럼 다음 리버와 Mahadevan - 얀센 2의 방법을 사용하여 결정 5 일 주문 다항식을 빼서하여 정정 배경입니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 커 게이팅 시스템의 개략도 다이어그램. SHG 경로가 파란색으로 표시되는 동안 펌프 빔 경로가 빨간색으로 표시됩니다. 형광이 temporally 필터링되었습니다 경로가 노란색으로 표시되는 동안 래맨와 형광이 overlapped되는 경로는 녹색으로 표시됩니다. 다음과 같은 약어 : BPF, 밴드 패스 필터, CCD, 전하 결합 소자, DCM, 이색성 거울, FI, 패러데이 아이 솔 레이터, λ / 2, 반 파 판, LPF, 긴 패스 필터, NLM, 비선형 매체, P, 편광 ; SHG 두번째 고조파 세대 크리스탈. <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2 위로 :. 침지 기름에 용해 coumarin의 원시 스펙트럼. 빨간색 곡선 (분석기는 최대 전송 설정) 오픈 개최되는 게이트와 함께 찍은 스펙트럼을 보여줍니다. 블랙 곡선 최소 전송 및 펌프 빔 적용 (문이 스펙트럼)에 대한 정렬 분석기와 함께 찍은 스펙트럼을 보여줍니다. 블루 곡선 최소 전송없이 펌프 빔 적용에 대한 정렬 분석기와 함께 찍은 spectum (게이트 폐쇄 개최)를 보여줍니다. 그린 곡선은 펌프 빔이 적용된 취한 스펙트럼을 보여줍니다. 점선 마젠타 라인은 아래 패널에 표시되는 스펙트럼 영역을 나타냅니다. 모든 검사 결과는 11 점, 3 순서대로 Savitzky - 골레이 필터 smoothed되었습니다. 하단 : 형광 배경 제거 후 침지 기름에 용해 coumarin의 스펙트럼. 레드 곡선은 게이트와 스펙트럼이 열려 개최하고, 파란색 곡선은 문이 스펙트럼이다. 문이 스펙트럼은 명확 오일의 뒤얽힌 높은 wavenumber 피크 특성을 보여줍니다.

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	<li>Savitzky, A., Golay, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothing+and+differentiation+of+data+by+simplified+least+squares+procedures.">Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures.</a> Analytical Chemistry. 36, 1627-1639 (1964).</li><li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra.">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li><li>Gniadecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+diagnosis+by+Raman+spectroscopy+and+neural+networks:+Structure+alterations+in+proteins+and+lipids+in+intact+cancer+tissue.">Melanoma diagnosis by Raman spectroscopy and neural networks: Structure alterations in proteins and lipids in intact cancer tissue.</a> Journal of Investiga-tive Dermatology. 122, 443-449 (2004).</li><li>Lieber, C. A., Majumder, S. K., Billheimer, D., Ellis, D. L., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+microspectroscopy+for+skin+cancer+detection+in+vitro.">Raman microspectroscopy for skin cancer detection in vitro.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 024013-024013 (2008).</li><li>Chen, K., Qin, Y., Zheng, F., Sun, M., Shi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+colorectal+cancer+using+Raman+spectroscopy+of+laser-trapped+single+living+epithelial+cells.">Diagnosis of colorectal cancer using Raman spectroscopy of laser-trapped single living epithelial cells.</a> Optics Letters. 31, 2015-2017 (2006).</li><li>Chan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+identification+of+individual+leukemia+cells+by+laser+trapping+Raman+spectroscopy.">Nondestructive identification of individual leukemia cells by laser trapping Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 80, 2180-2187 (2008).</li><li>Zhu, Q. Y., Quivey, R. G., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+bacterial+concentration+fractions+in+polymicrobial+mixtures+by+Raman+microspectroscopy.">Measurement of bacterial concentration fractions in polymicrobial mixtures by Raman microspectroscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 9, 1182-1186 (2004).</li><li>R&#246;sch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxonomic+identification+of+single+bacteria+by+micro-Raman+spectroscopy:+Application+to+clean-room-relevant+biological+contaminations.">Chemotaxonomic identification of single bacteria by micro-Raman spectroscopy: Application to clean-room-relevant biological contaminations.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 1626-1637 (2005).</li><li>Moritz, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopic+signatures+of+the+metabolic+states+of+escherichia+coli+cells+and+their+dependence+on+antibiotics+treatment.">Raman spectroscopic signatures of the metabolic states of escherichia coli cells and their dependence on antibiotics treatment.</a> Biophysical Journal. 98, 742a-742a (2010).</li><li>Dehring, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+chemical+changes+in+subchondral+bone+taken+from+murine+knee+joints+using+Raman+spectroscopy.">Identifying chemical changes in subchondral bone taken from murine knee joints using Raman spectroscopy.</a> Applied Spectroscopy. 60, 1134-1141 (2006).</li><li>Berger, A. J., Koo, T. W., Itzkan, I., Horowitz, G., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+blood+analysis+by+near-infrared+Raman+spectroscopy.">Multicomponent blood analysis by near-infrared Raman spectroscopy.</a> Applied Optics. 38, 2916-2926 (1999).</li><li>Qi, D., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+concentration+measurement+in+blood+serum+and+urine+samples+using+liquid-core+optical+fiber+Raman+spectroscopy.">Chemical concentration measurement in blood serum and urine samples using liquid-core optical fiber Raman spectroscopy.</a> Applied Spectroscopy. 46, 1726-1734 (2007).</li><li>Beier, B. D., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+automated+background+subtraction+from+Raman+spectra+containing+known+contaminants.">Method for automated background subtraction from Raman spectra containing known contaminants.</a> The Analyst. 134, 1198-1202 (2009).</li><li>De Luca, A. C., Mazilu, M., Riches, A., Herrington, C. S., Dholakia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy.">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 738-745 (2010).</li><li>Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+imaging+of+tissue+in+vivo+with+video-rate+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 16807-16812 (2005).</li><li>Jones, W. J., Stoiche, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+raman+spectra:+Induced+absorption+at+optical+frequencies.">Inverse raman spectra: Induced absorption at optical frequencies.</a> Physical Review Letters. 13, 657-659 (1964).</li><li>Freudiger, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+et+Imaging+with+High+Sensitivity+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Label-Free et Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Cui, M., Bachler, B. R., Ogilvie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+coherent+and+spontaneous+Raman+scattering+under+biological+imaging+conditions.">Comparing coherent and spontaneous Raman scattering under biological imaging conditions.</a> Optics Letters. 34, 773-775 (2009).</li><li>Matousek, P., Towrie, M., Stanley, A., Parker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rejection+of+fluorescence+from+Raman+spectra+using+picosecond+Kerr+gating.">Efficient rejection of fluorescence from Raman spectra using picosecond Kerr gating.</a> Applied Spectroscopy. 53, 1485-1489 (1999).</li><li>Matousek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+suppression+in+resonance+Raman+spectroscopy+using+a+high-performance+picosecond+Kerr+gate.">Fluorescence suppression in resonance Raman spectroscopy using a high-performance picosecond Kerr gate.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 32, 983-988 (2001).</li><li>Knorr, F., Smith, Z. J., Wachsmann-Hogiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+time-gated+system+for+Raman+spectroscopy+of+biological+samples.">Development of a time-gated system for Raman spectroscopy of biological samples.</a> Optics Express. 18, 20049-20058 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

의생명 래맨 ​​분광법의 분야는 생물 학적 진단에 몇 가지 어려운 문제를 해결에 대한 입증 가능성의 결과로 지난 몇 년간 증가하고 관심을 보여줬습니다. 예를 들어, 래맨 스펙트럼은 암 탐지 3, 4, 5, 6에서 진단 가치를 가지고 표시되었습니다. 래맨 분광법은 세균 quantitation 7, 8 및 세균성 약물 반응 9도 사용되고 있습니다. 그것은 또한 뼈 건강에서 10 biofluid 분석 11, 12에 이르기까지 다른 생명 의학 어플 리케이션의 광범위한 응용 프로그램을 발견했습니다. 는 매우 약한 단면 같은 잠재력에도 불구하고, 그러나, 래맨 분광법은 대부분의 생물 학적 시스템에서여 - 이리에 큰 장벽을하고 있습니다. 따라서, 래맨 신호를 쉽게도 매우 겸손한 형광 배경에 압도 수 있습니다. 많은 기술은 형광 lineshape 2, 13, 14 제거 존재합니다. 그러나 이러한 기술 중 누구도 진정으로 강한 형광 배경과 주요 문제를 해결 없으며 주사 노이즈는 래맨 신호 형광 배경 자멸의 존재에 의해 스펙트럼에 기여하고 멀리 빼서 수 없습니다. 이러한 일관된 방지 스톡 래맨 분광 (자동차)과 자극 래맨 비산 (또는 반대 래맨 산란)과 같은 몇몇 기술은, 래맨 신호 15, 16, 17의 강도를 증폭을 시도하기 위해 개발되었습니다. 그러나 이러한 기술 모두가 투명 표본에 주로 적용되는 자신의 배경과 화학 민감도 18 문제가 있습니다. 형광 신호의 검출기를 차폐하는 것은 진정으로 자연 래맨 산란에 형광 배경과 관련된 기회가 소음을 거부할 수있는 유일한 방법입니다. 10 년 전 동안 Matousek 외. temporally 래맨 및 형광 신호를 19, 20 분리 ultrafast 커 셔터를 사용하여 형광 거부를 보여주었다. 그러나, 현재까지이 시스템은 지나치게 높은 펄스 에너지의 필요성에 의한 생물 학적 분야에서 널리 사용 발견되지 않았습니다. 이 통신에 표시되는 시스템은, 대조적으로, 일부 이전 리포트에 비해 1000 배 약한 펄스 에너지를 이용하여 생물 학적 시스템과 호환됩니다. 그림 1에 표시된 우리의 시스템은 전력을 절약하고 가능한 비선형 매체 내의 펌프 및 신호 들보 사이에 많은 중복을 제공하기 위해 collinear 커 게이트 기하학을 사용합니다. 또한, 우리는 우리 커 셔터를 작동하는 최대 사용 가능한 전력을 수 있도록 최대한 광학 손실을 줄이기 위해 처리. 우리가 어떤 photodamage 21 관찰하지 않고, 높은 즉 생물 학적 샘플, 야스 공장 줄기를 fluorescing의 래맨 스펙트럼을 얻은이 시스템을 사용합니다. 이 보고서에서 우리는 현미경의 침지 기름에 녹아있는 식물 기반 형광단의 모델 시스템에서 몇 가지 대표적인 데이터를 (coumarin, τF ≈ 5 NS)를 보여줍니다. 이것은 그림 2에 표시됩니다. 상단 패널에서, 우리는 시각화의 목적에 대한 최대 가치의 0.04 %로 축소, 빨간색으로 강한 &quot;ungated&quot;스펙트럼 (0 ° ~ 분석기 설정)을 참조하십시오. 눈에 보이는 뚜렷한 래맨 봉우리가 없다는 것을 유의하십시오. 아래 검은, 원시 문이 스펙트럼이 (에 펌프 및 여기 레이저 모두 스펙트럼 즉)입니다. 그 아래 파란색으로, 넘어 polarizers 통해 누설 잔류 형광을 나타내는에 그냥 여기 레이저와 스펙트럼이다. 마지막으로, 녹색으로, 우리는 시스템에 배치 흡수와 간섭 필터의 조합을 통해 누출 펌프 레이저로 인해 배경을 참조하십시오. 그림의 하단 패널 2 우리는 다섯째 주문 다항식의 뺄셈 후 ungated와 문이 스펙트럼 (지역 상단 패널에 점선 마젠타 라인으로 표시)의 subregion을 참조하십시오. ungated 스펙트럼이 더 명확 래맨 기능이없는 동안 문이 스펙트럼은 분명히, 지질과 관련된 높은 wavenumber 피크를 보여줍니다. Google 시스템은 현재 큰 effciency로 작동하지는 않지만 (측정 maxiumum 전송 5 % 정도로되어있다), 절대 신호 강도는 일반적으로 신호 대 잡음보다 중요합니다. 종래의 래맨 스펙트럼을 측정하는 중 어렵거나 모르시는 압도적인 형광 배경에 의한하는 생물 학적 샘플을 몇 가지 광범위한 클래스가 있습니다. 이 샘플의 경우, Google 시스템은 그림 2에서 분명하게 볼 수로, 확실한 신호 대 잡음 향상을 제공할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 렌즈 </td><td> ThorLabs </td><td> 여러 </td><td> 1퍼센트 각각의 최대 전송 손실을 가지고 올 코팅 렌즈 </td></tr><tr><td> 조정할 수있는 티 : Sapph 레이저 </td><td> 응집 성의 </td><td> 카멜레온 </td><td> 30 NJ, 200 FS, 80 MHz의 </td></tr><tr><td> 40X 기름 침지 목표 </td><td> 올림푸스 </td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1.35 </td></tr><tr><td> 거꾸로 현미경 </td><td> 올림푸스 </td><td> IX - 71 </td><td> 측면 포트의 모든 렌즈를 제거하기 위해 수정 </td></tr><tr><td> 하프 웨이브 플레이트 </td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M - 600 </td><td></td></tr><tr><td> 글랜 - 톰슨 편광자 </td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> ~ 10 %의 전송 손실 </td></tr><tr><td> 분광계 </td><td> PI 액튼 </td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PI 액튼 </td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td> Mathmatical 소프트웨어 </td><td> MathWorks </td><td> MATLAB </td><td> 버전 2008a </td></tr><tr><td> 패러데이 아이 솔 레이터 </td><td> EOT </td><td> BB8 - 5I </td><td></td></tr><tr><td> 압전 거울 </td><td> 뉴 포트 </td><td> AG - M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO 결정 </td><td> CASIX </td><td> 사용자 정의 </td><td> 1mm 두께 </td></tr><tr><td> 대역 통과 필터 1 </td><td> 앤도버 </td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0.4 nm의 </td></tr><tr><td> 이색성 거울 </td><td> Semrock </td><td> FF662 - FDI01 </td><td> 662 NM에서 대역 에지 </td></tr><tr><td> 롱 - 패스 필터 </td><td> Semrock </td><td> BLP01 - 405R </td><td> 417 NM에서 대역 에지 </td></tr><tr><td> 대역 통과 필터 2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417-447 NM </td></tr><tr><td> CS 2 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 335266 </td><td> 99 % 순도 </td></tr><tr><td> Coumarin 30 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 546127 </td><td> 99 % 순도 </td></tr><tr><td> 집중 오일 </td><td> Cargille </td><td> 16,242 </td><td> 유형 DF </td></tr></tbody></table>

rejection of fluorescence background in resonance and spontaneous raman microspectroscopy

래맨 분광법은 종종 특히 생물 학적 샘플, 강한 형광 배경에 의해 퍼진. 샘플이 ultrafast 펄스, temporally timescale은 분리 수 picosecond에 신호를 중복 spectrally 분리 수있는 시스템의 기차와 흥분되면 즉시 늦게 도착 형광 빛으로부터 래맨 흩어져 빛을 도착. 여기 래맨과 형광 신호를 분리하기 위해 저전력 광 커 게이트의 형태로 모든 광학 스위​​칭을 사용하는 복잡한 비선형 광학 시스템의 건설과 운영을 논의. 평균 전력 80 MHz의 반복 속도의 2.4 W와 함께 하나의 808 nm의 레이저는 래맨 비산들을 흥분시키기 위해 샘플로 전송 404 nm의 라이트의 &lt;5 MW로 변환되는 808의 NM 라이트의 약 200 MW로, 분할이다. 나머지 변하지 않은 80​​8의 NM 라이트는 다음의 모든 광학 셔터를위한 펌프 역할을 비선형 매체로 전송됩니다. 셔터가 약 5 %의 피크 효율 800 FS의를 열고 닫습니다. 이 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 펄스 에너지와 생물학적으로 안전하게 유지 평균 파워를 사용하여 80 MHz의 반복 속도 래맨 및 형광 신호를 분리 수 있습니다. 시스템이 광학 전력 측면에 여분의 용량이 없기 때문에, 우리는 몇 가지 세부 설계 및 정렬 고려하는 시스템의 처리량을 극대화에 도움. 우리는 또한 커 매체 내의 신호 및 펌프 빔의 공간적 시간적 및 중복뿐만 아니라 스펙트럼 획득을위한 상세한 프로토콜을 얻기위한 프로토콜을 논의합니다. 마지막으로, 우리는 시간 게이팅 시스템을 사용 강한 형광의 존재에서 얻은 래맨 스펙트럼의 몇 가지 대표적인 결과를보고합니다.

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Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

우리는 형광 신호에서 래맨 격리 ultrafast 모든 광학 스위​​칭을 사용하는 복잡한 비선형 광학 시스템의 건설과 운영을 논의. 이 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 펄스 에너지와 생물학적으로 안전 유지에 관한 능력을 활용 래맨 및 형광 신호를 분리 수 있습니다.

공명과 자연 래맨 Microspectroscopy에 형광 배경 거부

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

rejection-fluorescence-background-resonance-spontaneous-raman

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K 조회수.  University of California, Davis. 우리는 형광 신호에서 래맨 격리 ultrafast 모든 광학 스위​​칭을 사용하는 복잡한 비선형 광학 시스템의 건설과 운영을 논의. 이 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 펄스 에너지와 생물학적으로 안전 유지에 관한 능력을 활용 래맨 및 형광 신호를 분리 수 있습니다.

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

생활 세포의 분자 Rotors의 형광 수명 이미징

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

연구

생체공학

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

발광 공명 에너지는 포유 동물 세포에 표현 막 단백질의 구조 변화를 연구에 전송

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...