Ce travail a été financé par la NSF prix DBI 0852891. Une partie de ce travail a également été financée par le Centre pour la science et la technologie biophotonique, un désigné NSF Science et Technology Center géré par l&#39;Université de Californie, Davis, sous l&#39;accord de coopération n ° PHY0120999.

1. Certaines précautions doivent être prises dans la préparation et à placer un échantillon Raman dans ce système. <ol><li> Parce que le système permet généralement l&#39;utilisation d&#39;objectifs très élevés ouverture numérique avec de très courtes distances de travail, les échantillons sont placés sur une lamelle. Les échantillons biologiques sont généralement placés sur une lamelle d&#39;épaisseur n ° 1 monté dans une chambre de la cellule Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA). </li><li> Les échantillons liquides, en particulier ceux toxique pour les humains, sont placés dans une petite bouteille de verre avec une lamelle collée à l&#39;ouverture au moyen d&#39;une résine époxy de silicone. La bouteille est ensuite inversé pour la mesure. </li><li> Parce que notre système repose sur le calendrier précis de la pompe et impulsions du signal, nous sommes contraints de ne pas utiliser le réglage du tirage optique conventionnelle de notre microscope, ce qui traduit l&#39;objectif de haut en bas. Cela ajoute et soustrait du chemin optique de notre système. Au lieu de cela, nous mettons nos échantillons sur une scène secondaire, monté sur le dessus de la platine du microscope qui a son propre contrôle de discussion indépendant. </li></ol> 2. Afin de prendre le temps-dépendants spectres Raman, le faisceau d&#39;excitation doivent être correctement préparés. <ol><li> Nous commençons avec la lumière émergeant d&#39;un 2,4 W accordable Ti pulsée: Sapph laser (Chameleon, des systèmes cohérents, Santa Clara, CA). Chaque impulsion dans le train d&#39;impulsions de 80 MHz a 30 nJ d&#39;énergie, a une largeur temporelle de 140 fs, et a un spectre centré à 808 nm avec une bande passante spectrale de ~ 6 nm. </li><li> Pour éviter de back-reflets de revenir dans la cavité du laser, la lumière est passée à travers un isolateur de Faraday. Une lame demi-onde placée avant l&#39;isolateur de Faraday permet de régler en continu de la puissance totale envoyée dans le système. </li><li> Parce que 6 nm est trop large bande passante pour résoudre la plupart des modes Raman, le faisceau est envoyé à travers un filtre passe-bande (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH), très étroite centrée à 808 nm. </li><li> La lumière est ensuite focalisée par un doublet achromatique (f = 100 mm) sur une 5 mm β-borate de baryum (BBO) cristal (CASIX, Fuzhou, Fujian, Chine) pour réduire de moitié la longueur d&#39;onde de 808 à 404 nm nm. Le cristal de BBO est placé dans une monture avec des contrôles pointe et d&#39;inclinaison, et également montés sur une platine de translation. Pour maximiser l&#39;efficacité de la conversion de longueur d&#39;onde, le cristal doit être placé exactement symétrique par rapport à l&#39;objectif du pourpoint, et avec son axe de cristal aligné à la polarisation du faisceau entrant. </li><li> Parce que l&#39;efficacité de la conversion de longueur d&#39;onde est dépendant de la polarisation, le contrôle sur la quantité de lumière envoyée sur l&#39;échantillon peut être obtenue en plaçant une seconde lame demi-onde, après l&#39;isolateur de Faraday. En tournant ce waveplate, l&#39;intensité de la lumière envoyée sur l&#39;échantillon peut être ajusté indépendamment de l&#39;intensité envoyée dans le faisceau de pompe (à discuter ci-dessous). </li><li> La longueur d&#39;onde de lumière est convertie recollimated par un doublet achromatique seconde (f = 500 mm) choisi de telle sorte que le faisceau sortant est assez grand pour remplir l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif du microscope, et dirigé dans un microscope inversé (IX-71, Olympus, Center Valley, Pennsylvanie) au moyen de deux miroirs de pilotage. </li><li> L&#39;objectif de microscope, étant l&#39;élément optique logé dans la composante la plus monolithique du système, définit l&#39;axe optique. Pour aligner le faisceau d&#39;excitation à cet axe, un miroir est placé dans le plan de l&#39;échantillon du microscope. Les deux miroirs de pilotage sont ensuite itérativement à l&#39;écoute tout en observant l&#39;arrière-reflété faisceau laser sur une caméra CCD de l&#39;époque (μEye, IDS, Obersulm, Allemagne) connecté au port d&#39;imagerie du microscope. En supposant que l&#39;image de la caméra est centrée sur le microscope champ de vue, la poutre est dans l&#39;axe lorsque la tache focale est centrée sur la puce de microscope et de traduction de l&#39;objectif le long de l&#39;axe z ne change pas le point central du faisceau défocalisé. </li><li> Quand un échantillon est placé dans le plan de l&#39;échantillon et irradiée avec une lumière laser Raman se produit. Un filtre dichroïque placé sous l&#39;objectif du microscope sépare la longueur d&#39;onde de lumière décalée Raman diffusée (et fluorescence) à partir du faisceau d&#39;excitation, de diriger la lumière Raman éparpillés sur le port côté du microscope. Le microscope a été modifié pour enlever les lentilles dans cette voie, tels que le signal lumineux émerge du microscope collimaté. </li><li> Parce que le faisceau signal sortant de la loupe est plus grand que l&#39;ouverture claire des polariseurs Glan-Thompson, un télescope 0.47x construit de deux doublets achromatiques (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) est utilisé pour réduire la poutre. </li><li> Le signal lumineux est alors polarisée par un polariseur de Glan-Thompson orientés à 0 ° par rapport à la verticale dans le cadre du laboratoire, et dirigé vers un miroir dichroïque où il est recombiné avec le faisceau de pompe. </li></ol> 3. Pour que la porte optique pour fonctionner à plein rendement, il faut prendre soin dans la préparation du faisceau de pompe (Kerr faisceau) aussi bien. <ol&gt; <li> L&#39;impulsion de la pompe est d&#39;abord amplifié par 0.35x avec un télescope construit avec deux doublets achromatiques (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm) pour correspondre à la taille finale du faisceau signal. </li><li> Le faisceau pompe est ensuite envoyé dans une ligne à retard composée d&#39;un prisme à angle droit placé sur une platine de translation linéaire qui peut être réglé pour assurer chevauchement temporel de la pompe et les impulsions du signal (réglage d&#39;être discutés ci-dessous). </li><li> Après la ligne de retard, le faisceau est envoyé à travers une lame demi-onde et le polariseur orienté à 45 ° par rapport à la verticale dans le cadre du laboratoire. Cela garantit l&#39;état de polarisation correcte du faisceau de pompe quand elle atteint le milieu non linéaire. </li><li> La lumière est ensuite réfléchie sur deux miroirs de pilotage, l&#39;un avec piézo-électriques de contrôle, qui sont utilisés pour ajuster finement la position du faisceau de pompe de telle sorte qu&#39;il recouvre spatialement avec le faisceau de signal. Le chevauchement est obtenue en observant la pompe et des poutres de signal à deux endroits, un proche et un loin d&#39;un miroir dichroïque où les poutres sont combinés. En utilisant le miroir de pilotage premier à chevaucher les deux faisceaux au point près, et le miroir piézoélectrique à se chevaucher les poutres au point jusqu&#39;à présent, le faisceau de pompe peut être fait exactement colinéaire avec le faisceau signal. </li><li> Avec les deux faisceaux combinés, la porte de Kerr et le système de collecte sont mis en place pour maximiser le temps-dépendants recueillies signal. </li></ol> 4. Avec les deux faisceaux combinés, la porte de Kerr et le système de collecte sont mis en place pour maximiser le temps-dépendants recueillies signal. <ol><li> Les poutres de la pompe et le signal sont d&#39;abord passés par un filtre dichroïque qui a un diamètre extérieur de 6 à 404 nm pour empêcher toute lumière d&#39;excitation résiduelle de diffusion Raman passionnante au sein du milieu non linéaire. </li><li> La pompe et le signal de poutres sont ensuite focalisés par deux un doublet achromatique (f = 35 mm) dans une cuvette de 1 cm de trajet optique de quartz contenant le matériau non linéaire. Tout matériel non linéaires ayant une convenablement haut indice non linéaire (plus élevé que CS 2), et convenablement courte réponse temporelle (&lt;2 PS), peut être utilisé ici. Pour ces expériences, nous utilisons le disulfure de carbone, CS 2, qui a un indice non linéaire n 2 = 3,1 x 10 -18 m 2 / W. La lumière est ensuite recollimated par un second doublet avec une longueur focale identique à la première. </li><li> Les poutres sont ensuite passé à travers et de Glan-Thompson analyseur sur une monture tournante, et ensuite à travers un ensemble de filtres d&#39;absorption et les interférences qui ont combiné une DO de 10 à 808 nm. </li><li> Enfin, le signal lumineux est focalisée par un doublet achromatique (f = 35 mm) dans une fibre de 50 um optique multimode, où la fibre est montée dans un stade qui permet la traduction en x, y et z. La fibre est ensuite couplé à un spectrographe d&#39;imagerie commerciale avec joint caméra CCD (SP2300i et Pixis 100B, respectivement, tous deux fabriqués par Princeton Instruments, Trenton, NJ). </li><li> Pour aligner le système de collecte afin de maximiser le signal recueilli, l&#39;analyseur est réglé à 0 ° et un échantillon test de toluène est placée dans le plan de l&#39;échantillon. En ajustant les x, y, z et les commandes de la monture en fibre, le signal recueilli Raman est optimisé. </li><li> Pour assurer le bon chevauchement spatial et temporel de la pompe et les poutres du signal, un miroir est placé dans le plan de l&#39;échantillon du microscope. Le filtre 404 nm, est retiré du système. Avec l&#39;analyseur de rotation à 90 ° le faisceau 404 nm rétroréfléchie est envoyé dans le spectrographe avec l&#39;intensité ajustée de telle sorte qu&#39;il ne sature pas la caméra. Avec le faisceau pompe, l&#39;analyseur est tourné pour minimiser le signal transmis 404 nm. Avec le faisceau pompe rallumé, le stade de retard est réglé lentement jusqu&#39;à ce que la transmission de la lumière 404 nm commence à augmenter. Puis, par itération tuning au stade de retard, le miroir piézo-électriques, et les x, y, z et les commandes de la fibre, on maximise le signal. </li><li> Parce que la rétro-réfléchie du faisceau 404 nm et la lumière Raman dispersés peuvent prendre des chemins légèrement différents à travers le système, les derniers ajustements sont réalisés en plaçant une forte Raman diffuseur (comme le toluène) sur la scène de l&#39;échantillon et le tordant légèrement l&#39;alignement en modifiant les étage de retard, piezeo-électrique miroir, et les commandes x, y et z de la fibre pour optimiser le signal Raman. </li></ol> 5. Collection d&#39;un seul temps-dépendants spectre Raman nécessite l&#39;acquisition de plusieurs spectres pour corriger les artefacts du système. <ol><li> Avec l&#39;analyseur à 0 °, le faisceau d&#39;excitation et de la poutre sur la pompe, un «non synchronisées&quot; spectre est prise, ce qui représente le spectre qui seraient acquis sans l&#39;avantage du système de temps de déclenchement. </li><li> Avec l&#39;analyseur réglé à 90 °, le faisceau d&#39;excitation et le faisceau de pompe toujours éteint, un large arrière-plan est prise, ce qui représente la quantité de lumière parasite qui fuit à travers les polariseurs et d&#39;autres éléments dans le système. </li><li> Avec l&#39;analyseur reste à 90 °et toutes les poutres sur les &quot;gated&quot; spectre est prise, ce qui représente la lumière Raman dispersés autorisé par la polariseurs croisés par la présence du faisceau de pompe. </li><li> Enfin, avec l&#39;analyseur reste à 90 °, le faisceau d&#39;excitation hors tension et le faisceau pompe sur un spectre de fond seconde est prise, ce qui représente la contribution à la &quot;gated&quot; spectre des quantités résiduelles de la lumière 808 nm pénétrant dans le spectrographe. </li><li> De plus, un spectre est pris avec tous les lasers off, caractérisant le niveau de référence au niveau &quot;sombre&quot; du signal de la caméra et l&#39;électronique. </li><li> Parce que les spectres ont souvent besoin de temps d&#39;intégration longs, il est impératif de briser ce temps d&#39;intégration en plusieurs morceaux (frames) pour permettre la correction appropriée des rayons cosmiques - un problème commun lors de l&#39;acquisition de données sur des portées de plusieurs minutes. </li></ol> 6. Une fois acquis, plusieurs étapes de traitement sont utiles pour améliorer la qualité et l&#39;apparence des données. <ol><li> Premièrement, tous les spectres sont sombres corrigée en soustrayant au large de la &quot;sombre&quot; du spectre. </li><li> Pour corriger les rayons cosmiques, les cadres de plusieurs constituant une acquisition sont comparées les unes aux autres sur une base pixel par pixel. Pour chaque pixel d&#39;une trame qui tombe en dehors de 2 écarts médians de la valeur médiane pour ce pixel dans tous les cadres, la valeur de ce pixel est remplacé par la valeur médiane pour tous les cadres. </li><li> Les cadres de rayons cosmiques corrigées sont ensuite moyennées et lissée par un filtre Savitzky-Golay 1. </li><li> Pour extraire le &quot;vrai&quot; spectre fermée, on soustrait le «excitation-only&quot; et &quot;pompe seule&quot; spectres du spectre mesuré fermée. </li><li> Enfin, les spectres fermé et non synchronisées sont ensuite fond corrigée en soustrayant une 5 ème ordre polynomial, déterminée selon la méthode de Lieber et Mahadevan-Jansen 2. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Schéma du système de déclenchement Kerr. La trajectoire du faisceau pompe est représentée en rouge, tandis que le chemin SHG est représentée en bleu. Le chemin où Raman et de fluorescence sont superposées est représenté en vert, tandis que le chemin où la fluorescence a été temporellement filtré est représenté en jaune. Abréviations comme suit: BPF, filtre passe-bande; CCD, charge-coupled device; DCM, miroir dichroïque; FI, Faraday isolateur; λ / 2, la plaque demi-onde; LPF, filtre passe-temps; NLM, milieu non linéaire; P, polariseur ; SHG, cristal génération de second harmonique. <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2 Haut:. Spectres bruts de coumarine dissous dans l&#39;huile d&#39;immersion. La courbe rouge représente le spectre d&#39;prises avec le portail ouvert (analyseur fixé pour une transmission maximale). Courbe noire montre le spectre pris avec l&#39;analyseur aligné pour la transmission minimum et un faisceau de pompe appliquée (le spectre gated). Courbe bleue montre les spectum prises avec l&#39;analyseur aligné pour la transmission minimum et aucun faisceau de pompe appliquée (portail maintenu fermé). Courbe verte montre le spectre pris avec seulement le faisceau de pompe appliquée. Lignes magenta pointillés indiquent la région spectrale représentée dans le panneau ci-dessous. Tous les spectres ont été lissés avec un point 11, 3ème ordre Savitzky-Golay filtre. En bas: spectres de coumarine dissous dans de l&#39;huile d&#39;immersion après la fluorescence soustraction du fond. La courbe rouge est le spectre avec la porte maintenue ouverte, et la courbe bleue est le spectre fermée. Le spectre montre clairement les gated pic caractéristique alambiqué haute onde d&#39;huiles.

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	<li>Savitzky, A., Golay, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothing+and+differentiation+of+data+by+simplified+least+squares+procedures.">Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures.</a> Analytical Chemistry. 36, 1627-1639 (1964).</li><li>Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+subtraction+of+fluorescence+from+biological+Raman+spectra.">Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra.</a> Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).</li><li>Gniadecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+diagnosis+by+Raman+spectroscopy+and+neural+networks:+Structure+alterations+in+proteins+and+lipids+in+intact+cancer+tissue.">Melanoma diagnosis by Raman spectroscopy and neural networks: Structure alterations in proteins and lipids in intact cancer tissue.</a> Journal of Investiga-tive Dermatology. 122, 443-449 (2004).</li><li>Lieber, C. A., Majumder, S. K., Billheimer, D., Ellis, D. L., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+microspectroscopy+for+skin+cancer+detection+in+vitro.">Raman microspectroscopy for skin cancer detection in vitro.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 024013-024013 (2008).</li><li>Chen, K., Qin, Y., Zheng, F., Sun, M., Shi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+colorectal+cancer+using+Raman+spectroscopy+of+laser-trapped+single+living+epithelial+cells.">Diagnosis of colorectal cancer using Raman spectroscopy of laser-trapped single living epithelial cells.</a> Optics Letters. 31, 2015-2017 (2006).</li><li>Chan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondestructive+identification+of+individual+leukemia+cells+by+laser+trapping+Raman+spectroscopy.">Nondestructive identification of individual leukemia cells by laser trapping Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 80, 2180-2187 (2008).</li><li>Zhu, Q. Y., Quivey, R. G., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+bacterial+concentration+fractions+in+polymicrobial+mixtures+by+Raman+microspectroscopy.">Measurement of bacterial concentration fractions in polymicrobial mixtures by Raman microspectroscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 9, 1182-1186 (2004).</li><li>R&#246;sch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxonomic+identification+of+single+bacteria+by+micro-Raman+spectroscopy:+Application+to+clean-room-relevant+biological+contaminations.">Chemotaxonomic identification of single bacteria by micro-Raman spectroscopy: Application to clean-room-relevant biological contaminations.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 1626-1637 (2005).</li><li>Moritz, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopic+signatures+of+the+metabolic+states+of+escherichia+coli+cells+and+their+dependence+on+antibiotics+treatment.">Raman spectroscopic signatures of the metabolic states of escherichia coli cells and their dependence on antibiotics treatment.</a> Biophysical Journal. 98, 742a-742a (2010).</li><li>Dehring, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+chemical+changes+in+subchondral+bone+taken+from+murine+knee+joints+using+Raman+spectroscopy.">Identifying chemical changes in subchondral bone taken from murine knee joints using Raman spectroscopy.</a> Applied Spectroscopy. 60, 1134-1141 (2006).</li><li>Berger, A. J., Koo, T. W., Itzkan, I., Horowitz, G., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+blood+analysis+by+near-infrared+Raman+spectroscopy.">Multicomponent blood analysis by near-infrared Raman spectroscopy.</a> Applied Optics. 38, 2916-2926 (1999).</li><li>Qi, D., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+concentration+measurement+in+blood+serum+and+urine+samples+using+liquid-core+optical+fiber+Raman+spectroscopy.">Chemical concentration measurement in blood serum and urine samples using liquid-core optical fiber Raman spectroscopy.</a> Applied Spectroscopy. 46, 1726-1734 (2007).</li><li>Beier, B. D., Berger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+automated+background+subtraction+from+Raman+spectra+containing+known+contaminants.">Method for automated background subtraction from Raman spectra containing known contaminants.</a> The Analyst. 134, 1198-1202 (2009).</li><li>De Luca, A. C., Mazilu, M., Riches, A., Herrington, C. S., Dholakia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy.">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 738-745 (2010).</li><li>Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+imaging+of+tissue+in+vivo+with+video-rate+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 16807-16812 (2005).</li><li>Jones, W. J., Stoiche, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+raman+spectra:+Induced+absorption+at+optical+frequencies.">Inverse raman spectra: Induced absorption at optical frequencies.</a> Physical Review Letters. 13, 657-659 (1964).</li><li>Freudiger, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+et+Imaging+with+High+Sensitivity+by+Stimulated+Raman+Scattering+Microscopy.">Label-Free et Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Cui, M., Bachler, B. R., Ogilvie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+coherent+and+spontaneous+Raman+scattering+under+biological+imaging+conditions.">Comparing coherent and spontaneous Raman scattering under biological imaging conditions.</a> Optics Letters. 34, 773-775 (2009).</li><li>Matousek, P., Towrie, M., Stanley, A., Parker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rejection+of+fluorescence+from+Raman+spectra+using+picosecond+Kerr+gating.">Efficient rejection of fluorescence from Raman spectra using picosecond Kerr gating.</a> Applied Spectroscopy. 53, 1485-1489 (1999).</li><li>Matousek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+suppression+in+resonance+Raman+spectroscopy+using+a+high-performance+picosecond+Kerr+gate.">Fluorescence suppression in resonance Raman spectroscopy using a high-performance picosecond Kerr gate.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 32, 983-988 (2001).</li><li>Knorr, F., Smith, Z. J., Wachsmann-Hogiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+time-gated+system+for+Raman+spectroscopy+of+biological+samples.">Development of a time-gated system for Raman spectroscopy of biological samples.</a> Optics Express. 18, 20049-20058 (2010).</li></ol>

Le domaine de la spectroscopie Raman biomédicale a constaté un intérêt croissant au cours des dernières années en raison de son potentiel démontré pour résoudre plusieurs défis difficiles dans le diagnostic biologique. Par exemple, les spectres Raman ont été montré pour avoir une valeur diagnostique dans le cancer de détection 3, 4, 5, 6. La spectroscopie Raman a également été utilisée dans la quantification bactérienne 7, 8 et 9 réponse aux médicaments bactérienne....

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Société </th><th> Nombre de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Lentilles </td><td> Thorlabs </td><td> Divers </td><td> Tous les verres traités à avoir des pertes de transmission maximale de 1% chaque </td></tr><tr><td> Accordable Ti: Sapph au laser </td><td> Cohérente </td><td> Caméléon </td><td> 30 nJ, 200 fs, 80 MHz </td></tr><tr><td> 40X objectif à immersion </td><td> Olympus </td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1,35 </td></tr><tr><td> Microscope inversé </td><td> Olympus </td><td> IX-71 </td><td> Mise à jour pour enlever toutes les lentilles dans le port côté </td></tr><tr><td> La moitié lame d&#39;onde </td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> Polariseur Glan-Thompson </td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> ~ Perte de transmission de 10% </td></tr><tr><td> Spectromètre </td><td> PI Acton </td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PI Acton </td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td> Logiciels mathmatical </td><td> The MathWorks </td><td> MATLAB </td><td> Version 2008a </td></tr><tr><td> Faraday isolateur </td><td> EOT </td><td> BB8-5I </td><td></td></tr><tr><td> Piézo-électrique miroir </td><td> Newport </td><td> AG-M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO de cristal </td><td> CASIX </td><td> personnalisée </td><td> 1 mm d&#39;épaisseur </td></tr><tr><td> Filtre passe-bande 1 </td><td> Andover </td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0,4 nm </td></tr><tr><td> Miroir dichroïque </td><td> Semrock </td><td> FF662-FDI01 </td><td> bord de bande à 662 nm </td></tr><tr><td> Longue filtre passe- </td><td> Semrock </td><td> BLP01-405R </td><td> bord de bande à 417 nm </td></tr><tr><td> Filtre passe-bande 2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417-447 nm </td></tr><tr><td> CS 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 335266 </td><td> 99% de pureté </td></tr><tr><td> Coumarine 30 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 546127 </td><td> 99% de pureté </td></tr><tr><td> Huile à immersion </td><td> Cargille </td><td> 16242 </td><td> Type de DF </td></tr></tbody></table>

rejection of fluorescence background in resonance and spontaneous raman microspectroscopy

Spectroscopie Raman est souvent en proie à un fond fluorescent intense, surtout pour les échantillons biologiques. Si un échantillon est excité par un train d&#39;impulsions ultra-rapides, un système qui peut séparer temporairement spectralement chevauchement des signaux sur une échelle de temps picoseconde permet d&#39;isoler rapidement arriver Raman de la lumière diffusée à partir de fin-lumière de fluorescence qui arrivent. Ici, nous discutons de la construction et l&#39;exploitation d&#39;un système optique complexe non linéaire qui utilise tout-optiques de commutation sous la forme d&#39;un portail de faible puissance Kerr optique d&#39;isoler les signaux Raman et de fluorescence. Une seule 808 nm laser avec 2,4 W de puissance moyenne et de 80 MHz taux de répétition est divisée, avec environ 200 mW de lumière 808 nm étant converti en &lt;5 mW de 404 nm de lumière envoyée sur l&#39;échantillon pour exciter la diffusion Raman. Le reste de lumière inconvertis 808 nm est ensuite envoyé à un milieu non linéaire où il agit comme la pompe pour l&#39;obturateur tout-optique. L&#39;obturateur s&#39;ouvre et se ferme en 800 fs avec une efficacité maximale d&#39;environ 5%. Grâce à ce système, nous sommes en mesure de séparer les signaux succès Raman et de fluorescence à un taux de répétition de 80 MHz en utilisant des énergies d&#39;impulsion et de puissances moyennes qui restent biologiquement sûrs. Parce que le système n&#39;a pas de capacité de réserve en termes de puissance optique, nous détaillons quelques considérations de conception et de l&#39;alignement que l&#39;aide à maximiser le débit du système. Nous discutons également de notre protocole pour l&#39;obtention du chevauchement spatial et temporel du signal et des poutres de pompe dans le milieu Kerr, ainsi que d&#39;un protocole détaillé pour l&#39;acquisition spectrale. Enfin, nous rapportons un des résultats représentatifs de quelques spectres Raman, obtenu en présence d&#39;une forte fluorescence à l&#39;aide de notre temps de déclenchement du système.

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Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Nous discutons de la construction et l&#39;exploitation d&#39;un système optique complexe non linéaire qui utilise ultrarapide tout-optiques de commutation pour isoler Raman de signaux de fluorescence. Grâce à ce système, nous sommes en mesure de séparer les signaux succès Raman et de fluorescence en utilisant des énergies d&#39;impulsion et de puissances moyennes qui restent biologiquement sûrs.

Rejet de fond de fluorescence de résonance et spontanée microspectroscopie Raman

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K vues.  University of California, Davis. Nous discutons de la construction et l'exploitation d'un système optique complexe non linéaire qui utilise ultrarapide tout-optiques de commutation pour isoler Raman de signaux de fluorescence. Grâce à ce système, nous sommes en mesure de séparer les signaux succès Raman et de fluorescence en utilisant des énergies d'impulsion et de puissances moyennes qui restent biologiquement sûrs.

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Imagerie de vie de fluorescence des rotors moléculaires dans les cellules vivantes

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Recherche

Bio-ingénierie

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Luminescence Resonance Energy Transfer pour étudier les changements conformationnels dans des protéines membranaires exprimés dans les cellules de mammifères

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour capturer des Images 4-dimensionnelle des effets de modulation de la contrainte de cisaillement sur le coeur de poisson-zèbre en développement

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Formation spontanée et le réarrangement des réseaux de Nanotube lipidique artificielle comme un modèle de bas en haut pour le réticulum endoplasmique

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imagerie de tissus biologiques avec fluorescence combinée à deux photons et microscopie à diffusion Raman stimulée

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Imagerie par diffusion Raman stimulée en deux couleurs en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...