מעבדה זה כבר נתמך על ידי מכוני המחקר הקנדי הבריאות, מדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה, האגודה לטרשת נפוצה בקנדה (MSSC). GSTS היה מקבל תעודת סטודנט לדוקטורט מ MSSC. אנו מודים ד&quot;ר ג&#39;ואן בוגס (בית החולים לילדים חולים, טורונטו) לדיונים מועילים הערות רבות על כתב היד הזה. אנו אסירי תודה על המתנה הנדיבה Biotium שלהם NucView נוסף 488 caspase-3.

1. מפשיר תאים culturing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג מלאי קפוא N19-oligodendroglial תאים הנציח מן ארוך טווח חנויות חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון המכיל תאים לטבול ב 37 ° C אמבט מים עד ההשעיה התא מופשר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 מ&quot;ל של DMEM (שינוי של Dulbecco בינוני Eagle), עם גלוקוז גבוהה בתוספת 10% FBS (בסרום שור עוברית) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין על צלחת 10 ס&quot;מ תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את התא ההשעיה ירידה מבחינת הצלחת, בעדינות להתסיס הסלע צלחת פטרי לפזר את התאים באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים ב 34 ° C / 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, מדיה לשאוב מתוך צלחות להסיר כל DMSO הנותרים (sulphoxide דימתיל) כי שימש cryoprotectant, ולהחליף עם התקשורת טרי (7 מ&quot;ל DMEM גלוקוז גבוהה מדיה בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין) . </li></ol> 2. Passaging תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 70-80%מפגש (4-7 צמיחה ימים), לשאוב מדיה מן התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין לצלחת. פיפטה טריפסין לנתק את התאים (בערך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את דילולים מתאים תנאי הניסוי ומעבר צלחת תוספת של 10 ס&quot;מ עבור ניסויים בעתיד על צפיפות התאים לא פחות 0.1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li></ol> הערה: אתה צריך מעבר התאים שלך לפחות פעמיים לאחר ההפשרה לפני השימוש בהם ניסויים. 3. ספירת תאים ו ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי תאים צלחת הדמיה לחיות תאים, trypsinize כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של כ -30 μL של תאים לספור באמצעות haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב coverslip זכוכית ללא ציפוי בצלחת 6 היטב. הוסף התאים לבאר בצפיפות של 0.1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל 2 מ&quot;ל פנול ללא DMEM גלוקוז גבוהה בתקשורת, בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין, בשעה 34 ° C / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתירהתאים לגדול בין לילה (16-20 שעות) בשעה 34 ° C / 5% CO 2 לפני transfection. </li></ol> 4. Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 100 μL בסרום ללא מדיה, 0.5-4 מיקרוגרם מטוהרים DNA פלסמיד, ו 4 μL FuGENE HD (Roche). וורטקס בעדינות לתערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס שוב בקצרה לאפשר את הדנ&quot;א מורכב 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף את תערובת FuGENE HD ישירות אל ה-DNA בתאים בתרבית. הטה את הצלחת בעדינות לתערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים עבור 48 שעות נוספות על 34 ° C / 5% CO 2 לפני הטיפול או ניסויים. </li></ol> 5. תאים הכנה הדמיה Live-Cell (LCI) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תיבת Chamlide LCI לחיות תאים בקרת מכשיר לפחות 1 שעה לפני שאתה רוצה להתחיל את הניסוי שלך. קופסת הבקרה גם מסדיר את הטמפרטורה והלחות בתוך Chamlide LCI, מווסת את זרימת 5% מעורבבים מראש CO 2. </li></ol> הערה: רצוילהפעיל את קופסת השליטה עד 3 שעות לפני תחילת הניסויים כדי להבטיח את הבמה כולה מגיע 34 ° C. צעד זה יקטין להיסחף מוקד, אשר נגרמת על ידי fluxulation ואת התפשטות תרמית של השלב מתכת כפי שהיא מחממת, במהלך ההדמיה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במנדף זרימה, לרסס את החדר Chamlide מגנטי מסוג התרבות, פינצטה, עם אתנול 70% ולאפשר להם להתייבש במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים החממה לאשר כי הם בריאים. הם צריכים להופיע חסיד היטב להתפשט על coverslip הזכוכית עם תהליכים ממברנה רבים. תאים לחוצים מן transfection אינם מתאימים לניסויים, ויהיה מספר מופחת של תהליך שלוחות, ולעיתים קרובות יש גרעין סדיר בצורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את צלחת 6-היטב ולהסיר את coverslip עם פינצטה. במהירות למקום בצד התא coverslip לתוך צלחת התחתון של החדר תרבות. אל תאפשר coverslip להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף הראשי מגנטיהגוף של חדר התרבות להוסיף 500 μL של התקשורת מהצלחת 6-היטב המקורי על החלק העליון של coverslip. מחדש באמצעות מדיה זו תקטין את כמות הלחץ המוטל על התאים הנגרם על ידי שינויים סביבתיים, יכולה להיות שימושית גם להערכת גורמים המופרשים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכיסוי על זכוכית חדר תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש KimWipe ריססו עם אתנול 70% כדי להסיר כל חומר שיורית מתחתית coverslip, אשר יפריע במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חדר התרבות של 34 ° C / 5% CO 2 באינקובטור למשך 30 דקות. צעד זה יבטיח כי החדר עצמו מחמם עד 34 מעלות צלזיוס כדי להפחית הסטה של ​​coverslip כמו מתכת מתחמם. </li></ol> 6. מיקרוסקופ הגדרות תמונות נרכשו כאן באמצעות מיקרוסקופ DMIRE2 לייקה הפוכה עם עדשה ממסר מותאם אישית פליטת לסנן גלגל דיור עבור טעינת מחסנית של גלגלים מרובים (Quorum טכנולוגיות בע&quot;מ, Guelph, ב). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Brightfield - מנורה מוגדר V 2.5 וחשיפה זמן עד 240 ms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון האדום פלורסנט (RFP) - רווח נקבע על 140 עבור 200 ms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון הפלואורסצנט הירוק (GFP) - רווח נקבע על 140 עבור 500 ms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ שלנו יש מנורה dimmable ולא דיסק מסתובב כדי לשלוט על כמות האור זמין לתאים. אנחנו רצים בניסויים שלנו עם האור ב 90% של עוצמת מנורה מקסימלית. </li></ol> 7. טיפול של תאים עם מעוררים אפופטוזיס ו NucView 488 caspase-3 המצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב להכין מלאי גדול של אפופטוזיס מעוררים מראש ולהקפיא אותם aliquots, כך ריכוזי יהיה עקבי בין הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצע 488 NucView רגיש לאור. הכן aliquots של 15 μL להפחית צינורות הקפאה / הפשרה, ולאחסן ב -20 מעלות מכוסה בנייר אלומיניום. עבודה עם תאורה בחדר הסביבה נמוך ככל האפשר כדי להקטין את החשיפה של NucV488 המצע iew לאור, לפני השימוש בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את החדר במהירות תרבות האינקובטור כך התאים אינם חשופים לירידה בטמפרטורה. מניחים את חדר תרבות על החדר הסביבה של המיקרוסקופ, ולהשתמש מהדק כדי לשמור על תא התרבות לנוע. בנקודה זו כדאי גם לעמעם את האורות בחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הטנק 5% CO 2 מעורבבים מראש עם הרגולטור כפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש המטרה 10x, המיקוד למצוא תאים על צג המחשב באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. הערה: אתה רוצה להשתמש את הצמצם המספרי הגדול ביותר על המטרה עם ההגדלה הרצוי כדי לצמצם את זמן החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעוררים ספק של אפופטוזיס של תאים (במקרה שלנו אשלגן 80 מ&quot;מ, או 100 גלוטמט מ&quot;מ), באחת השיטות הבאות ניתן להשתמש. נשתמש משלוח של אשלגן 80 מ&quot;מ כדוגמה, באמצעות KCl מומס כמו להתרכז 10x בתקשורת אופייני לתרבות שלנו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה חילופי בy איטי המקומית זלוף: - השתמש משאבה peristaltic התקשורת חילופי בתא תרבות עם מדיה חדשה המכילה 80 mM אשלגן. - קצה אחד של הצינור יעביר 10 מ&quot;ל מלאי של 80 mM אשלגן מומס פנול ללא DMEM, ואת הקצה השני של צינור יסיר התקשורת מהאולם. - אתה רוצה להחליף לפחות 10x של התקשורת על מנת להבטיח כי התקשורת שמאל בחדר יש את הריכוז הנכון של אשלגן. - אחרי התקשורת הוא החליף, להוסיף 3 μL של המצע 488 NucView לתקשורת בחדר. פיפטה לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף ישיר של 80 mM K + ו - 488 NucView המצע התקשורת בחדר תרבות: - הכן פתרון מניות 10x של אשלגן 80 מ&quot;מ מומס פנול ללא DMEM. - להוסיף 3 μL של המצע 488 NucView כדי μL 50 של אשלגן 80 10x מ&quot;מ. פיפטה לערבב. הוסף 500 μL פנול ללא DMEM בחדר התרבות. הערה: שיטה זו הואהעדיפו אם אתה מעוניין בשמירה או הערכת גדילה או גורמים המופרשים אחרים שעשויים להיות נוכחים בתקשורת המקורי. מצאנו כי המצע 488 NucView יציב בתרבות תא ניסויים קיימא כל עוד 36 ח </li></ol></li></ol> 8. Live-תא הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על ערוץ אדום כדי להציג תאים transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולשמור סביב מסגרות עשרות שבו יש מספר תאים transfected, ולשמור אותם &quot;נקודות XY הבמה&quot;. בהתאם לכמות של זיכרון המחשב, אתה עלול להיות מוגבל במספר נקודות בשלב הזה תוכל לרכוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם את לכידת תמונות מיקרוסקופ (בערוץ, בהיר שדה אדום, ערוץ ירוק) בשלב אלה הציל נקודות כל 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מכתים ירוק כי הוא גלוי בשלבים הראשונים של הניסויים סביר מצביע על תאים העוברים אפופטוזיס כבר, בדרך כלל עקב transfection ו / או סטרס סביבתי. Apoptosis בשל טיפולים ניסיוניים יזוהו על timepoint מאוחר יותר בניסוי. </li></ol> 9. ניתוח סטטיסטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי זה, אנו התוכנית מיקרוסקופ כדי לרכוש נקודות XY רבים לאסוף נתונים גדול להגדיר ביעילות. כל ניסוי מתבצע לשכפל או בשלושה עותקים, ונתונים שנאספו מתוך ניסויים נפרדים שבוצעו בימים שונים. מתוך כל ערכת נתונים, אנו מנתחים עד 15 בתחומי להציג ולהשוות את היחס של caspase-שלילי התאים caspase-חיובי תאים (המספר הכולל של תאים בתוך שדה הראיה / המספר הכולל של caspase-חיובי תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדידות מוקלט מתוך ערכת נתונים בכל מקובצים לקבוע מדגם גדול יותר, והם השוו אחד לשני באמצעות שולחן ANOVA (p = 0.05). אנחנו מראים את שגיאות תקן של הממוצע (SEM) של כל ניסוי, ולאחר מכן להשוות את ההבדל אמצעי ידי ביצוע השוואה אמצעי טיוקי בדיקה (p = 0.05) כדי לקבוע WHich טיפולים שונים מהותית אחד מהשני. </li></ol> 10. נציג תוצאות תיארנו ניסוי כדי להמחיש כיצד את המצע 488 NucView יכול להצביע על שיעור מוגבר של אפופטוזיס של N19-OLG בתרביות תאים בעקבות הטיפול עם ריכוז אשלגן גבוה תאית. N19-תאים היו transfected עם RFP, וטופלו גם עם 3 המצע μL 488 NucView (שליטה), או 3 μL NucView 488 המצע 80 מ&quot;מ [K +] (טיפול). תאים נוטרו ותמונות נרכשו במהלך 12 שעות זמן, וזה מתאים מחקרים שכללו עלבונות נוירולוגיות (איור 1A). בתנאים שליטה, אנחנו לא רואים כמויות משמעותיות של אפופטוזיס לעומת 80 מ&quot;מ [K +] תרבויות מטופלים (תיבת מרוסקים), שהראה כ 45% התא למוות לאחר 12 שעות (איור 1B). אות ירוק רקע לצפותד בתנאים בקרה מציין את התאים עוברים אפופטוזיס ללא תוספת של אשלגן תאיים. כמעט אף אחד התאים של אפופטוזיס הניסוי התערוכה שליטה על ידי נקודת זמן 12 שעות, אם כי במצבים אחרים הניסויים עשויים להידרש לרוץ יותר. תמונות שנרכשו באמצעות אובייקטיבי 10x. בר = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="איור 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> באיור 1. (א) 12 שעות כמובן זמן הניסוי של N19 תרבויות OLG 48 שעות שלאחר transfection להביע RFP-MBP (ערוץ אדום) יחד עם μL 3 של המצע 488 NucView (ערוץ ירוק). תרבויות טופלו או עם ריכוז סופי של 80 מ&quot;מ [K +] (פאנלים משמאל), או ללא טיפול כביקורת (לוחות מימין). תמונות שנרכשו ב 6 דקות במרווחים, והפעלה משמעותית של ביקע caspase-3 (סימן ירוק) ניתן לצפותד בתרבויות שטופלו 80 מ&quot;מ [K +] בתוך גרעין התא (תיבת מרוסקים) לעומת הניסוי שליטה. (B) אחוז caspase-3 תאים ביקע (מחושב על ידי חלוקת המספר הכולל של תאים בתחום התצוגה על ידי המספר הכולל של caspase-חיובי תאים). לשם השוואה לשלוט בתנאים, צפינו סביב מוות של תאים 45% בעקבות K + טיפול על ידי 12 ח sVideo 1. קורס 12 שעות זמן הניסוי של N19-OLG תרבויות 48 שעות שלאחר transfection להביע RFP-MBP (אדום ערוץ) עם μL 3 של המצע 488 NucView (ערוץ ירוק), יחד עם זוהר שדה הדימויים דרך שלושה התמונה הממוזגת, לאחר הטיפול עם 80 מ&quot;מ [K +]. sVideo 2. קורס 12 שעות זמן הניסוי של N19-OLG תרבויות 48 שעות שלאחר transfection להביע RFP-MBP (אדום ערוץ) עם μL 3 של המצע 488 NucView (ערוץ ירוק), יחד עם מתאר לעצמי בהירה שדהes ותמונה משולשת הממוזג. אין טיפול יושמה על תרבויות N19-OLGs ניתן לראות נודדות דרך שדה מיקרוסקופ לעומת בתרביות תאים שטופלו 80 מ&quot;מ [K +] (השוו עם sVideo 1).

<ol>
	<li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening.">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li><li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEVD-NucView488:+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells.">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li><li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles.">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li><li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+pathways,+neuronal+apoptosis,+and+CNS+injury.">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li><li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation.">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li><li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+L-type+Ca(++)+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins.">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li><li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination.">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li><li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptors,+neurotoxicity+and+neurodegeneration.">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li><li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo.">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li><li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells.">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li><li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+Huntington's+disease.">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li><li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes.">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , (2011).</li><li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells,+in+contrast+to+golli+isoforms.">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li><li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li><li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus.">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li><li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis.">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li></ol>

המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

אמנם זה לא המוצר היחיד fluorogenic זמין לגילוי אפופטוזיס, ישנם מספר יתרונות משמעותיים באמצעות המצע 488 NucView. אחד היתרונות העיקריים הוא היכולת לעקוב אחר אפופטוזיס בתאים חיים בזמן אמת, ואילו מוצרים חלופיים ביותר או לדרוש תמוגה התא או חדירות התא עניים. יתרונות נוספים כוללים רגישות גבוהה להכרה caspase-3, חדירות התא גבוהה, cytotoxicity נמוך, ואין הפרעה להתקדמות של אפופטוזיס. המצע כולל גם הקרינה רקע נמוכה עד שהוא ביקע ונכנס לגרעין, אשר מבטלת הקרינה רקע. רצף caspase-3 הכרה מכיל 3 המטענים השליליים ואת צבען-DNA מחייב אחד יש מטען חיובי 2. DEVD-NucView 488 המולקולה ולכן יש מטען שלילי נטו, אשר מונע את הפעלת ומחייבת של צבע כדי DNA בתאים שבהם caspase אינו פעיל. אמאעקביות intaining בין הניסויים נדרש כדי להיות מסוגל לערוך השוואה משמעותית בין משכפל. אחד הפרמטרים העיקריים כדי לשמור על עקביות היא צפיפות התאים, כפי שהוא משפיע על שיעור transfection. השגת שיעורי transfection גבוה הנציח N19-OLG בתרביות תאים קשה יותר מאשר עם שורות תאים אחרים נפוצים כגון הלה או HEK293, והיא תלויה מאוד בצפיפות, בתוך הניסיון שלנו 12, 13. היעילות הטובה ביותר שלנו transfection עבור תאים אלה הושגו עם Fugene HD (Roche) והם בדרך כלל על 15%, אך יכול להגיע מעל 30%, בהתאם לבנות את. ספירת תאים זהירות תסייע בהשגת שיעורי transfection עקבי. חשוב גם לחשוף תאים טיפולים שונים באותה מידה של לחץ סביבתי, במיוחד כאשר מדידת שיעורי אפופטוזיס. באופן ספציפי, משך הזמן שבו על התאים נחשפים ריאגנטים transfection, או את כמות החשיפה לאור, יש חשיבות סביבתית Variables לשקול, והוא צריך להישאר קבוע על פני ניסויים. עבור היישומים שלנו, מצאנו כי איסוף מספר גדול של שדות של נוף מספק גודל המדגם גדול מספיק כדי לערוך השוואות משמעותי מבחינה סטטיסטית, [שם].

טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> NucView 488 ערכת caspase-3 Assay עבור תאים חיים </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE HD מגיב transfection </td><td> רוש </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco של הנשר השתנה בינוני </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1.5-25 מ&quot;מ זכוכית coverslip </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide קרינת הרקע הקוסמית מגנטי תרבות קאמרית 25 מ&quot;מ coverslip </td&gt; <td> Quorum טכנולוגיות </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart בתרבית רקמה 10 מנות ס&quot;מ </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> פלקון 6-BD גם בתרבית רקמה מנות </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

מערכת העצבים המרכזית יכולים לחוות מספר מדגיש ועלבונות נוירולוגית, אשר יכולות להיות תופעות לוואי רבות, כי בסופו של דבר להוביל לצמצום האוכלוסייה ואת תפקוד עצבי. אקסונים פגומים יכולים לשחרר מולקולות מעוררות כולל אשלגן או גלוטמט לתוך המטריצה ​​תאיים, אשר בתורו, יכול לייצר פגיעה נוספת לפגיעה בתאי גלייה תמיכה כולל האסטרוציטים ו oligodendrocytes 8, 16. אם עלבון נמשכת, התאים יעברו מות תאים מתוכנת (אפופטוזיס), אשר מוסדר והופעל על ידי מספר ומבוססת התמרה מפלי אות 14. אפופטוזיס ונמק ברקמות יכולה להתרחש לאחר פגיעה מוחית טראומטית, איסכמיה מוחית, והתקפים. דוגמה קלאסית של רגולציה אפופטוטיים היא משפחה של ציסטאין תלויי aspartate מכוונת פרוטאזות, או caspases. פרוטאזות הופעל כולל caspases יש גם היה מעורב מוות של תאים בתגובה נוירו כרוניתמחלות ניווניות, כולל אלצהיימר, הנטינגטון, טרשת נפוצה ו - 4, 14, 3, 11, 7. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של המצע 488 caspase-3 NucView למדוד את קצב של אפופטוזיס caspase-3 מתווך הנציח N19-oligodendrocyte (OLG) בתרביות תאים 15, 5, בעקבות החשיפה מדגיש תאיים שונים כגון ריכוזים גבוהים של אשלגן או גלוטמט. תנאי הנציח-N19-OLG קו תאים (המייצג את אבי O2A) התקבל ד&quot;ר אנתוני Campagnoni (UCLA סמל המכון למדעי המוח) 15, 5, כבר השתמשו בעבר כדי ללמוד המנגנונים המולקולריים של ביטוי גנים המיאלין ואת הולכת אותות המובילים כדי OLG בידול (למשל 6, 10). מצאנו את שורות התאים להיות חזקים ביחס transfection עם חלבון המיאלין הבסיסי אקסוגניים (MBP) בונה התמזגו או RFP או GFP (אדום או חלבון הפלואורסצנט הירוק) 13,12. הנה, תרבויות התא N19-OLG טופלו או אשלגן כלוריד 80 מ&quot;מ או 100 סודיום גלוטמט mM לחקות דליפה axonal לתוך המטריצה ​​תאיים כדי לגרום לאפופטוזיס 9. השתמשנו דו פונקציונלי caspase-3 מצע המכיל (ASP-Glu-Val-ASP) DEVD caspase-3 למקטע הכרה ה-DNA מחייבת לצבוע 2. המצע במהירות נכנס הציטופלסמה שם הוא ביקע ידי תאיים caspase-3. לצבוע, NucView 488 הוא שוחרר ונכנס לגרעין התא שבו הוא נקשר דנ&quot;א מאיר ירוק 488 ננומטר, איתות אפופטוזיס. השימוש המצע 488 NucView caspase-3 מאפשר הדמיה לחיות תאים בזמן אמת 1, 10. בסרטון הזה, אנו גם מתארים את culturing ו transfection של תאים N19-OLG הנציח, כמו גם לחיות תאים שיטות הדמיה.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates F

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-תא הדמיה של אפופטוזיס caspase-3 בתיווך ב-N19 oligodendrocyte תרבויות הנציח התא באמצעות<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspase-3 המצע. טכניקה זו חלה על מבחני מוות מתוכנת של תאים בזמן אמת במגוון רחב של סוגי תאים ורקמות.

ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

15.9K Views.  University of Guelph. Live-תא הדמיה של אפופטוזיס caspase-3 בתיווך ב-N19 oligodendrocyte תרבויות הנציח התא באמצעות NucView 488 caspase-3 המצע. טכניקה זו חלה על מבחני מוות מתוכנת של תאים בזמן אמת במגוון רחב של סוגי תאים ורקמות.

Video: Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still unclear. Our laboratory has developed a rat model of post-MI syndrome that displays impaired cardiac functions, neuronal loss in the limbic system, cognitive deficits and behavioral signs of depression. At the neuronal level, caspase-3 activation mediates post-MI apoptosis in different limbic regions, such as the amygdala &#8211; peaking at 3 days post-MI. Cognitive and behavioral impairments appear 2-3 weeks post-MI and these correlate statistically with measures of caspase-3 activity. The protocol described here is used to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity using spectrofluorometry. To induce MI, the descending coronary artery is occluded for 40 min. The protocol for evaluation of caspase-3 activation starts 3 days after MI: the rats are sacrificed and the amygdala isolated rapidly from the brain. Samples are quickly frozen in liquid nitrogen and kept at -80 &#176;C until actual analysis. The technique performed to assess caspase-3 activation is based on cleavage of a substrate (DEVD-AMC) by caspase-3, which releases a fluorogenic compound that can be measured by spectrofluorometry. The methodology is quantitative and reproducible but the equipment required is expensive and the procedure for quantifying the samples is time-consuming. This technique can be applied to other tissues, such as the heart and kidneys. DEVD-AMC can be replaced by other substrates to measure the activity of other caspases.

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

ניתוח פעילות עצבית וקישוריות באמצעות נתוני EEG תוך-גולגולתי בתוכנה SPM

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

חשיפת מבנה העל המיטוכונדריאלי בתאי עצב באמצעות מיקרוסקופ STED

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

מחבר זרקור: פענוח הזדקנות מיטוכונדריאלית 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...