אנו מודים ק גיל לסיוע עם גידול העכבר טיפול לניהול מעבדה. תודה גם לחברי Mukoyama מעבדה לעזרה טכנית. המימון ניתן על ידי תוכנית המחקר עירונית של מכוני Naitonal הבריאות.

1. איסוף לימב עובריים בעכבר העור (E13.5 ~ E17.5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים פקוק נוהל שאושר על ידי נשים. על פי פרוטוקול שאושר שלנו חיה, הנקבות מומתים על ידי חשיפה CO 2 והבטיחה מכן על ידי נקע בצוואר הרחם. הנח את חיה על מגבת נייר סופג שלה ולספוג אותו ביסודיות 70% EtOH / H 2 O מבקבוק לחיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח הרחם שלם ולמקם אותו תבשיל 100 x 15 מ&quot;מ פטרי המכילה תמיסת מלח מאוזן קר כקרח &quot;הנקס (HBSS) כדי לשטוף את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד לנתח את העובר. הסר את amnion דק מאוד מן העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציה) לנתח עובר יחיד 35 x 10 צלחת פטרי מ&quot;מ אם העובר כל צריך להיות genotyped. זנב גזור מועברת צינורית PCR 0.2 מ&quot;ל עבור genotyping. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את forelimbs של העובר והעברת forelimbs ידי מלקחיים הטבעת לתוך צלחת 24 היטב המכיל 2 מ&quot;ל של Paraformaldehyde קר כקרח 4% טרי (PFA) ב פוספט הצפת מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את forelimbs עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר את PFA לשטוף שלוש פעמים בתוך 5 דקות של 2 מ&quot;ל PBS עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את forelimbs ב 100% מתנול (MeOH) ולאחסן אותן במקפיא -20 ° C אנזים (במקפיא עם בקרת טמפרטורה קריטית וללא פונקציה להפשיר אוטומטית). נוגדנים ראשיים הרשומים לעבוד טבלה מס &#39;1 לאחר הטיפול MeOH 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלפים את העור מן forelimb באמצעות פינצטה בסדר. העור האיבר, כאשר מיובש, צריך להפריד בקלות בין הגפה. ראשית המקום איבר עם הצד הגחוני (צד כף) פונה כלפי מעלה. ואז בעזרת פינצטה בסדר, לחתוך את העור כפי שמוצג בסרטון. הבא לנתח סביב האיבר כולו, לקלף את העור בעדינות, ללא כל נזק. </li></ol> 2. Whole-Mount מכתים immunohistochemical של Skins לימב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם העור איבר בצינור 5 מ&quot;ל פוליפרופילן מסביב לתחתית ידי דוגרים דרך הסדרה מדורגת של MeOH / PBT דקות (PBS 0.2% + טריטון X-100) 5 (75%, 50%, 25%) עבור כל אחד. שים לב להחלפת פתרונות צריכים להיות זהירים כדי למנוע נזק עורות איבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים בתוך 5 דקות PBT עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את איבר עם עורות עיזים או 10% נסיוב / PBS 0.2% TX100 חיץ חסימת עבור נוגדנים עז משני או 10% חמור בדם / PBS 0.2% TX100 חיץ חסימת עבור נוגדנים חמור משני 2 שעות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בבית טמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ&quot;מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור microcentrifuge 2ml, עם 800μl של נוגדנים הראשי (דילול בהתאם המפורטים בטבלאות) במאגר חסימת (או 10% עיזים סרום / PBS 0.2 TX100% או 10% חמור בדם / PBS 0.2% TX100). דגירה עורות איבר עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator ב 4 ° C למשך הלילה. שים לב כי נוגדנים העיקרי מרובים שמקורם מינים שונים (למשל, נוגדן חד שבטי עכברוש + נוגדן ארנבת polyclonal) יכול לשמש בעת ובעונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, במקום עורות איבר על 35 x 10 מ&quot;מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים לתוך טבעת פוליפרופילן 5 מ&quot;ל מסביב לתחתית צינור עם 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% TX100 או 2 % דונקי סרום / PBS 0.2% TX100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חמש פעמים במשך 15 דקות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ&quot;מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור microcentrifuge 2ml, עם 800μl של נוגדנים משני למאגר החסימה (או 10% נסיוב / PBS עיזים 0.2% או 10% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100). בדרך כלל אנו משתמשים נוגדנים משני מג&#39;קסון ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 דילולים) או Invitrogen (אלקסה פלואוריד 488, 568 פלואוריד Alexa, Alexa פלואוריד 633, 1:250 דילול). סנן הפתרון נוגדנים משני באמצעות מזרק 0.22μm PVDF מסננים קרום להסיר חלקיקים מצטברים של נוגדנים משני. דגירה עורות איבר בחושך או עטוף בנייר אלומיניום למשך שעה 1 עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. שים לב שונות נוגדנים ניאון משני מצומדות נגזר מינים שונים יכול לשמש בעת ובעונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ&quot;מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור פוליפרופילן 5 מ&quot;ל עגול עם תחתית 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% או 2% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100). לשטוף חמש פעמים במשך 15 דקות בחושך או עטופים ברדיד אלומיניום עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אפשרות counterstaining נגד גרעין) דגירה עורות איבר עם 4ml של למאגר כביסה (או עיזים 2% סרום / PBS 0.2% או 2% TX100 סרום / PBS דונקי 0.2% TX100) עם To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 דילול) בחושך או עטוף בנייר אלומיניום עבור 10 דקות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בחדר temperatuמחדש. לאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% או 2% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100) בחושך או עטוף בנייר אלומיניום עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. שים לב, מכתים חזקה ספציפית עבור גרעינים הוא ציין עבור To-Pro-3 הפליטה ספציפי (עירור HeNe 633 ננומטר). </li></ol> 3. הרכבה Skins לימב על הסט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x צלחת פטרי 10 מ&quot;מ. הסר dusts, קריסטלים, סיבים בשכבה הפנימית של העור בעזרת פינצטה קנס כאמור stereomicroscope עם תאורה נמוכה, כדי למנוע צילום נרחב הלבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הקליפות איבר להחליק מיקרוסקופיים דבק ידי מלקחיים טבעת. מניחים את הקליפות בשכבה הפנימית שוכב מעלה בשקופית (כלומר כלפי coverslip). שטחו את הקליפות בזהירות באמצעות פינצטה בסדר להסיר לשאת על כביסה חיץ ידי Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר אנטי לדעוך התקשורת הרכבה ללא בועות אוויר. אנו משתמשים coverslip 25 &quot;x25&quot;. Cure על משטח שטוח בחושך (למשל, באמצעות דגימות רכוב להאריך מגיב זהב ממוקמים לילה בטמפרטורת החדר בחושך לפני הצפייה). עבור אחסון לטווח ארוך, לאטום את coverslip לשקופית ולאחסן ב 4 ° C. </li></ol> 4. Confocal מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת לייזרים מתאים fluorophores. אנו משתמשים Leica SP5 TCS מיקרוסקופ confocal עם שלושה מקורות לייזר כולל ארגון 488nm (עבור Alexa פלואוריד 488 ו-GFP), DPSS 561nm (עבור Alexa פלואוריד 568 ו Cy3) ו HeNe 633nm (עבור Alexa פלואוריד 633, Cy5 ו To-Pro-3) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי סריקה רציפים כדי למנוע או להפחית את crosstalk שבו כל צבעי בדגימות להכפיל או לשלש מוכתם יהיה נרגש באותו זמן. במצב סריקה סדרתית, תמונות תירשם צו רציפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מידע כללי נוסף על צבעי ניאון ולייזרים עבור עירור ניתן נוסדה בשנת &quot;מיקרוסקופיה confocal עבור ביולוגים&quot; של היבס (2004) </li></ol> 5. נציג תוצאות Whole-Mount מיקרוסקופיה immnofluorescence תווית משולשת confocal בעור forelimb העכבר E15.5 עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (איור 1A-C, D כחול), סמן neurofilament 2H3 (איור 1A ירוק), תא השריר החלק סמן αSMA (איור 1 א &#39;, ב&#39; אדום) עולה דפוס אופייני הסתעפות של העורקים αSMA +, מיושר עם 2H3 + עצבים היקפיים בעור איבר. בנוסף כלי הדם הסתעפות העור זה איבר מודל vasculature משמש ללמוד דפוסים של כלי הלימפה הסתעפות באמצעות נוגדנים את הסמן אנדותל הלימפה תא LYVE-1 (איור 1D, E אדום) Neuropilin2 (NRP2) (1D איור, F ירוק ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. (AC) העורקים להתיישר עם העצבים ההיקפיים בעור איבר עוברי. Whole-Mount תווית משולשת מיקרוסקופיה immnofluorescence confocal עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (AC, כחול), סמן neurofilament 2H3 (A, ירוק), תא השריר החלק סמן αSMA (A ו-B, אדום ) מוצג. בשלב E15.5, 2H3 + העצבים ההיקפיים (חיצים פתוח) לקשר עם העורקים (ראשי חץ) אשר מכוסים על ידי αSMA + לתאי שריר חלק. (DF) הלימפה בכלי הדם בעור איבר עוברי. התווית Triple-מיקרוסקופיה immnofluorescence confocal עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (D, כחול), סמן תא האנדותל הלימפה LYVE-1 (D ו-E, אדום) Neuropilin2 (NRP2) (D ו-F, ירוק ) מוצג. כלי הלימפה הם דמיינו ידי שני LYVE-1 ו NRP2, ואילו LYVE-1 מתבטא גם על ידי משנה של מקרופאגים (ראשי חץ פתוח). בר סולם: 100μm.

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback.">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li><li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4.">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li><li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development.">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מערכת כלי הדם חיונית להתפתחות איבר במהלך embryogenesis כמו גם עבור פונקציות תחזוקה איבר הרבייה אצל מבוגרים, כי הוא מספק מספיק חמצן וחומרים מזינים את האיברים. רשת כלי דם תקין היא מבוססת היטב עם תהליכים מורכבים ורב צעד אנגיוגנזה שבו קיימים רשת נימי הוא מחדש עם מבנים מסועפת מא...

נוגדנים פאן תא האנדותל סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> אוגר ארמני (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> 1:100 דילול # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> דילול 1:300 </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> דילול 1:300 </td></tr><tr><td> קולגן IV </td><td> הארנב (P) </td><td> עבד Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 דילול # 2 </td></tr></tbody></table> העורקים תא האנדותל סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> הארנב (P) </td><td> Kolodkin אלכס מעבדה # 3 </td><td></td><td> 1:3000 דילול </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> עיזים (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> ורידי סמן תא האנדותל <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> עיזים (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> דילול 1:100 </td></tr></tbody></table> תא האנדותל הלימפה סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> הארנב (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> הארנב (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> עיזים (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> 1:50 דילול </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> הארנב (P) </td><td> תא האיתות </td><td> 3366 </td><td> 1; 100 דילול </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> אוגר סורי (M) </td><td> Hybridoma בנק </td><td> 8.1.1 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> שריר חלק תא / pericyte סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> עכבר (M) # 5 </td><td> סיגמא </td><td> c-6198 </td><td> 1:500 דילול # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> הארנב (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> הארנב (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> נוגדנים עבור עיתונאי ה-GFP <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> GFP </td><td> הארנב (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> דילול 1:300 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> עכברוש (ז) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04404-84 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr><tr><td> GFP </td><td> צ&#39;יק (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> דילול 1:300 </td></tr></tbody></table> נוגדנים עבור כתב LacZ <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> הארנב (P) </td><td> MP ביו </td><td> 55976 </td><td> 1:5000 דילול </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> עיזים (P) </td><td> עבד Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> דילול 1:500 </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> צ&#39;יק (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> נוגדנים עבור האקסון הפריפריה <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> עכבר (M) # 7 </td><td> Hybridoma בנק </td><td> 2H3 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> עכבר (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> דילול 1:500 </td></tr><tr><td> Peripherin </td><td> הארנב (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr></tbody></table> נוגדנים להעברת בתאי שוואן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> הארנב (P) </td><td> תומאס מולר המעבדה # 9 </td><td></td><td> 1:3000 דילול </td></tr></tbody></table> (P): נוגדן polyclonal, (M): נוגדנים חד שבטיים # 1: אנטי ארמני עיזים אוגר-Cy3 (ImmunoResearch ג&#39;קסון 127-165-160) נוגדן צריך לשמש נוגדן משנית. # 2: הנוגדן IV קולגן יכול לשמש כדי לזהות כלי דם לאחר הכלאה ב באתרה. # 3: הנוגדן Neuropilin1 מסופק על ידי חביב במעבדה Kolodkin של אלכס באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס. כבשה נגד נוגדן אנושי Neuropilin1 זמין במו&quot;פ (AF3870), למרות שאנו לא צריך לבדוק את זה עדיין. # 4: LYVE-1 נוגדנים גם לזהות תת קבוצה של מקרופאגים בעור עובריים. # 5: נוגדנים נגד αSMA הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים IgG2a. # 6: נוגדן Cy3-מצומדות αSMA הוא מודגרות שעה 1 בטמפרטורת החדר יחד עם שניותנוגדנים ondary עבור נוגדנים ראשוניים אחרים. # 7: 2H3 נוגדן הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים נגד IgG1 neurofilament. # 8: Tuj1 נוגדן הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים נגד IgG2a Neuron ספציפיים בכיתה ג&#39;בטא טובולין. # 9: נוגדן (מוח ספציפיים חומצת שומן חלבון מחייב) BFABP מסופק בחביבות על ידי המעבדה של תומאס מולר ב-Max-Delbrück המרכז לרפואה מולקולרית.

whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo

Whole-Mount ניתוח immunohistochemical הדמיה vasculature כולו מרכזי להבנת מנגנוני הסלולר של הסתעפות המורפוגנזה. פיתחנו את העור איבר vasculature מודל ללמוד פיתוח כלי הדם שבו קיימים מקלעת נימי פרימיטיבי הוא ארגן מחדש לתוך רשת מסועפת של כלי הדם הירארכי. Whole-Mount מיקרוסקופיה confocal עם תיוג מרובים מאפשר הדמיה החזקה של כלי הדם ללא פגע, כמו גם מרכיבים תאיים שלהם כולל תאים, pericytes אנדותל ותאי שריר חלק, באמצעות סמנים ניאון ספציפיים. ההתקדמות מודל זה עור vasculature איבר עם מחקרים גנטיים השתפרו הבנה של המנגנונים המולקולריים דפוסים התפתחות כלי הדם. העור האיבר מודל vasculature נעשה שימוש כדי ללמוד איך העצבים ההיקפיים לספק תבנית מרחבית על בידול ועל דפוסים של העורקים. מאמר זה מתאר וידאו פרוטוקול פשוט חזקים כדי כתם הדם שלם עם נוגדנים ספציפיים כלי הדם נוגדנים משני פלורסנט, אשר ישים עבור איברים עובריים vascularized שבו אנו מסוגלים לבצע את תהליך ההתפתחות של כלי הדם.

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo at JoVE.com

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

אנחנו מציגים אימונוהיסטוכימיה כל הר לייזר מיקרוסקופיית confocal עם תיוג מרובים לניתוח רשת סבוכה היווצרות כלי דם בעור איבר עכבר עובריים.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

whole-mount-immunohistochemical-analysis-for-embryonic-limb-skin

Research

JoVE Journal

Biology

17.5K Views.  National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. אנחנו מציגים אימונוהיסטוכימיה כל הר לייזר מיקרוסקופיית confocal עם תיוג מרובים לניתוח רשת סבוכה היווצרות כלי דם בעור איבר עכבר עובריים.

Video: Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Immunology and Infection

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Bioengineering

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of vasculogenesis has become a central readout of endothelial progenitor cell functionality, and therefore, several attempts have been made to improve both in vitro and in vivo vasculogenesis models. However, standard methods are limited in scope, with static measurements failing to capture many aspects of this highly dynamic process. Therefore, the goal of developing this novel protocol was to assess the kinetics of in vitro vasculogenesis in order to quantitate rates of network formation and stabilization, as well as provide insight into potential mechanisms underlying vascular dysfunction. Application of this protocol is demonstrated using fetal endothelial colony forming cells (ECFCs) exposed to maternal diabetes mellitus. Fetal ECFCs were derived from umbilical cord blood following birth, cultured, and plated in slides containing basement membrane matrix, where they underwent vasculogenesis. Images of the entire slide wells were acquired using time-lapse phase contrast microscopy over 15 hours. Images were analyzed for derivation of quantitative data using an analysis software called Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV). KAV uses image segmentation followed by skeletonization to analyze network components from stacks of multi-time point phase contrast images to derive ten parameters (9 measured, 1 calculated) of network structure including: closed networks, network areas, nodes, branches, total branch length, average branch length, triple-branched nodes, quad-branched nodes, network structures, and the branch to node ratio. Application of this protocol identified altered rates of vasculogenesis in ECFCs obtained from pregnancies complicated by diabetes mellitus. However, this technique has broad implications beyond the scope reported here. Implementation of this approach will enhance mechanistic assessment and improve functional readouts of vasculogenesis and other biologically important branching processes in numerous cell types or disease states.

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Here, we present a protocol for time-lapse imaging and analysis of vasculogenesis in vitro using phase contrast microscopy coupled with the open source software, Kinetic Analysis of Vasculogenesis. This protocol can be applied to quantitatively assess the vasculogenic potential of numerous cell types or experimental conditions that model vascular disease.

ניתוח קינטי של Vasculogenesis מכמתת את הדינמיקה של Vasculogenesis ואנגיוגנזה במבחנה

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching morphogenesis and patterning, as well as immune cell distribution at a cellular level. The analysis of peripheral nerve and blood vessel anatomical structures in adult tissues provides some insights into the understanding of functional neuro-vascular wiring and neuro-vascular degeneration in pathological conditions such as wound healing. As a highly informative model system, we have focused our studies on adult ear skin, which is readily accessible for dissection. Our simple and reproducible protocol provides an accurate depiction of the cellular components in the entire skin, such as peripheral nerves (sensory axons, sympathetic axons, and Schwann cells), blood vessels (endothelial cells and vascular smooth muscle cells), and inflammatory cells. We believe this protocol will pave the way to investigate morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels as well as the inflammation in the adult ear skin under different pathological conditions.

Here, we describe a high resolution whole-mount imaging method in the entire adult mouse ear skin, which enables us to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution.

כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Neuroscience

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional veins. The purpose of this article is to carefully describe the establishment of a murine xenograft model that mimics human VM and is able to reflect patient heterogeneity. Hyper-activating non-inherited (somatic) TEK (TIE2) and PIK3CA mutations in endothelial cells (EC) have been identified as the main drivers of pathological vessel enlargement in VM. The following protocol describes the isolation, purification and expansion of patient-derived EC expressing mutant TIE2 and/or PIK3CA. These EC are injected subcutaneously into the back of immunodeficient athymic mice to generate ectatic vascular channels. Lesions generated with TIE2 or PIK3CA-mutant EC are visibly vascularized within 7&#8210;9 days of injection and recapitulate histopathological features of VM patient tissue. This VM xenograft model provides a reliable platform to investigate the cellular and molecular mechanisms driving VM formation and expansion. In addition, this model will be instrumental for translational studies testing the efficacy of novel drug candidates in preventing the abnormal vessel enlargement seen in human VM.

We present a detailed protocol to generate a murine xenograft model of venous malformation. This model is based on the subcutaneous injection of patient-derived endothelial cells containing hyper-activating TIE2 and/or PIK3CA gene mutations. Xenograft lesions closely recapitulate the histopathological features of VM patient tissue.

מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed in mice is high. Phenotypic characterization of these mouse models also requires the examination of cardiac function and morphology. Echocardiography and magnetic resonance imaging (MRI) are commonly used approaches to characterize cardiac function and morphology in mice. Echocardiographic and MRI equipment specialized for use in small rodents is&#160;expensive and requires a dedicated space. This protocol describes cardiac measurements in mice using a clinical echocardiographic system with a 15 MHz human vascular probe. Measurements are performed on anesthetized adult mice. At least three image sequences are recorded and analyzed for each animal in M-mode in the parasternal short-axis view. Afterwards, cardiac histological examination is performed, and cardiomyocyte diameters are determined on hematoxylin-eosin- or wheat germ agglutinin (WGA)-stained paraffin sections. Vessel density is determined morphometrically after Pecam-1 immunostaining. The protocol has been applied successfully to pharmacological studies and different genetic animal models under baseline conditions, as well as after experimental myocardial infarction by the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). In our experience, echocardiographic investigation is limited to anesthetized animals and is feasible in adult mice weighing at least 25 g.

Echocardiographic examination is frequently used in mice. Expensive high-resolution ultrasound devices have been developed for this purpose. This protocol describes an affordable echocardiographic procedure combined with histological morphometric analyses to determine cardiac morphology.

בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video