אנו מודים ק גיל לסיוע עם גידול העכבר טיפול לניהול מעבדה. תודה גם לחברי Mukoyama מעבדה לעזרה טכנית. המימון ניתן על ידי תוכנית המחקר עירונית של מכוני Naitonal הבריאות.

1. איסוף לימב עובריים בעכבר העור (E13.5 ~ E17.5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים פקוק נוהל שאושר על ידי נשים. על פי פרוטוקול שאושר שלנו חיה, הנקבות מומתים על ידי חשיפה CO 2 והבטיחה מכן על ידי נקע בצוואר הרחם. הנח את חיה על מגבת נייר סופג שלה ולספוג אותו ביסודיות 70% EtOH / H 2 O מבקבוק לחיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח הרחם שלם ולמקם אותו תבשיל 100 x 15 מ&quot;מ פטרי המכילה תמיסת מלח מאוזן קר כקרח &quot;הנקס (HBSS) כדי לשטוף את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד לנתח את העובר. הסר את amnion דק מאוד מן העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציה) לנתח עובר יחיד 35 x 10 צלחת פטרי מ&quot;מ אם העובר כל צריך להיות genotyped. זנב גזור מועברת צינורית PCR 0.2 מ&quot;ל עבור genotyping. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את forelimbs של העובר והעברת forelimbs ידי מלקחיים הטבעת לתוך צלחת 24 היטב המכיל 2 מ&quot;ל של Paraformaldehyde קר כקרח 4% טרי (PFA) ב פוספט הצפת מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את forelimbs עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר את PFA לשטוף שלוש פעמים בתוך 5 דקות של 2 מ&quot;ל PBS עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את forelimbs ב 100% מתנול (MeOH) ולאחסן אותן במקפיא -20 ° C אנזים (במקפיא עם בקרת טמפרטורה קריטית וללא פונקציה להפשיר אוטומטית). נוגדנים ראשיים הרשומים לעבוד טבלה מס &#39;1 לאחר הטיפול MeOH 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלפים את העור מן forelimb באמצעות פינצטה בסדר. העור האיבר, כאשר מיובש, צריך להפריד בקלות בין הגפה. ראשית המקום איבר עם הצד הגחוני (צד כף) פונה כלפי מעלה. ואז בעזרת פינצטה בסדר, לחתוך את העור כפי שמוצג בסרטון. הבא לנתח סביב האיבר כולו, לקלף את העור בעדינות, ללא כל נזק. </li></ol> 2. Whole-Mount מכתים immunohistochemical של Skins לימב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם העור איבר בצינור 5 מ&quot;ל פוליפרופילן מסביב לתחתית ידי דוגרים דרך הסדרה מדורגת של MeOH / PBT דקות (PBS 0.2% + טריטון X-100) 5 (75%, 50%, 25%) עבור כל אחד. שים לב להחלפת פתרונות צריכים להיות זהירים כדי למנוע נזק עורות איבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים בתוך 5 דקות PBT עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את איבר עם עורות עיזים או 10% נסיוב / PBS 0.2% TX100 חיץ חסימת עבור נוגדנים עז משני או 10% חמור בדם / PBS 0.2% TX100 חיץ חסימת עבור נוגדנים חמור משני 2 שעות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בבית טמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ&quot;מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור microcentrifuge 2ml, עם 800μl של נוגדנים הראשי (דילול בהתאם המפורטים בטבלאות) במאגר חסימת (או 10% עיזים סרום / PBS 0.2 TX100% או 10% חמור בדם / PBS 0.2% TX100). דגירה עורות איבר עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator ב 4 ° C למשך הלילה. שים לב כי נוגדנים העיקרי מרובים שמקורם מינים שונים (למשל, נוגדן חד שבטי עכברוש + נוגדן ארנבת polyclonal) יכול לשמש בעת ובעונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, במקום עורות איבר על 35 x 10 מ&quot;מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים לתוך טבעת פוליפרופילן 5 מ&quot;ל מסביב לתחתית צינור עם 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% TX100 או 2 % דונקי סרום / PBS 0.2% TX100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חמש פעמים במשך 15 דקות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ&quot;מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור microcentrifuge 2ml, עם 800μl של נוגדנים משני למאגר החסימה (או 10% נסיוב / PBS עיזים 0.2% או 10% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100). בדרך כלל אנו משתמשים נוגדנים משני מג&#39;קסון ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 דילולים) או Invitrogen (אלקסה פלואוריד 488, 568 פלואוריד Alexa, Alexa פלואוריד 633, 1:250 דילול). סנן הפתרון נוגדנים משני באמצעות מזרק 0.22μm PVDF מסננים קרום להסיר חלקיקים מצטברים של נוגדנים משני. דגירה עורות איבר בחושך או עטוף בנייר אלומיניום למשך שעה 1 עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. שים לב שונות נוגדנים ניאון משני מצומדות נגזר מינים שונים יכול לשמש בעת ובעונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ&quot;מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור פוליפרופילן 5 מ&quot;ל עגול עם תחתית 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% או 2% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100). לשטוף חמש פעמים במשך 15 דקות בחושך או עטופים ברדיד אלומיניום עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אפשרות counterstaining נגד גרעין) דגירה עורות איבר עם 4ml של למאגר כביסה (או עיזים 2% סרום / PBS 0.2% או 2% TX100 סרום / PBS דונקי 0.2% TX100) עם To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 דילול) בחושך או עטוף בנייר אלומיניום עבור 10 דקות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בחדר temperatuמחדש. לאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% או 2% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100) בחושך או עטוף בנייר אלומיניום עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. שים לב, מכתים חזקה ספציפית עבור גרעינים הוא ציין עבור To-Pro-3 הפליטה ספציפי (עירור HeNe 633 ננומטר). </li></ol> 3. הרכבה Skins לימב על הסט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקליפות על איבר 35 x צלחת פטרי 10 מ&quot;מ. הסר dusts, קריסטלים, סיבים בשכבה הפנימית של העור בעזרת פינצטה קנס כאמור stereomicroscope עם תאורה נמוכה, כדי למנוע צילום נרחב הלבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הקליפות איבר להחליק מיקרוסקופיים דבק ידי מלקחיים טבעת. מניחים את הקליפות בשכבה הפנימית שוכב מעלה בשקופית (כלומר כלפי coverslip). שטחו את הקליפות בזהירות באמצעות פינצטה בסדר להסיר לשאת על כביסה חיץ ידי Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר אנטי לדעוך התקשורת הרכבה ללא בועות אוויר. אנו משתמשים coverslip 25 &quot;x25&quot;. Cure על משטח שטוח בחושך (למשל, באמצעות דגימות רכוב להאריך מגיב זהב ממוקמים לילה בטמפרטורת החדר בחושך לפני הצפייה). עבור אחסון לטווח ארוך, לאטום את coverslip לשקופית ולאחסן ב 4 ° C. </li></ol> 4. Confocal מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת לייזרים מתאים fluorophores. אנו משתמשים Leica SP5 TCS מיקרוסקופ confocal עם שלושה מקורות לייזר כולל ארגון 488nm (עבור Alexa פלואוריד 488 ו-GFP), DPSS 561nm (עבור Alexa פלואוריד 568 ו Cy3) ו HeNe 633nm (עבור Alexa פלואוריד 633, Cy5 ו To-Pro-3) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי סריקה רציפים כדי למנוע או להפחית את crosstalk שבו כל צבעי בדגימות להכפיל או לשלש מוכתם יהיה נרגש באותו זמן. במצב סריקה סדרתית, תמונות תירשם צו רציפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מידע כללי נוסף על צבעי ניאון ולייזרים עבור עירור ניתן נוסדה בשנת &quot;מיקרוסקופיה confocal עבור ביולוגים&quot; של היבס (2004) </li></ol> 5. נציג תוצאות Whole-Mount מיקרוסקופיה immnofluorescence תווית משולשת confocal בעור forelimb העכבר E15.5 עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (איור 1A-C, D כחול), סמן neurofilament 2H3 (איור 1A ירוק), תא השריר החלק סמן αSMA (איור 1 א &#39;, ב&#39; אדום) עולה דפוס אופייני הסתעפות של העורקים αSMA +, מיושר עם 2H3 + עצבים היקפיים בעור איבר. בנוסף כלי הדם הסתעפות העור זה איבר מודל vasculature משמש ללמוד דפוסים של כלי הלימפה הסתעפות באמצעות נוגדנים את הסמן אנדותל הלימפה תא LYVE-1 (איור 1D, E אדום) Neuropilin2 (NRP2) (1D איור, F ירוק ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. (AC) העורקים להתיישר עם העצבים ההיקפיים בעור איבר עוברי. Whole-Mount תווית משולשת מיקרוסקופיה immnofluorescence confocal עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (AC, כחול), סמן neurofilament 2H3 (A, ירוק), תא השריר החלק סמן αSMA (A ו-B, אדום ) מוצג. בשלב E15.5, 2H3 + העצבים ההיקפיים (חיצים פתוח) לקשר עם העורקים (ראשי חץ) אשר מכוסים על ידי αSMA + לתאי שריר חלק. (DF) הלימפה בכלי הדם בעור איבר עוברי. התווית Triple-מיקרוסקופיה immnofluorescence confocal עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (D, כחול), סמן תא האנדותל הלימפה LYVE-1 (D ו-E, אדום) Neuropilin2 (NRP2) (D ו-F, ירוק ) מוצג. כלי הלימפה הם דמיינו ידי שני LYVE-1 ו NRP2, ואילו LYVE-1 מתבטא גם על ידי משנה של מקרופאגים (ראשי חץ פתוח). בר סולם: 100μm.

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback.">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li><li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4.">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li><li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development.">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מערכת כלי הדם חיונית להתפתחות איבר במהלך embryogenesis כמו גם עבור פונקציות תחזוקה איבר הרבייה אצל מבוגרים, כי הוא מספק מספיק חמצן וחומרים מזינים את האיברים. רשת כלי דם תקין היא מבוססת היטב עם תהליכים מורכבים ורב צעד אנגיוגנזה שבו קיימים רשת נימי הוא מחדש עם מבנים מסועפת מא...

נוגדנים פאן תא האנדותל סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> אוגר ארמני (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> 1:100 דילול # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> דילול 1:300 </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> דילול 1:300 </td></tr><tr><td> קולגן IV </td><td> הארנב (P) </td><td> עבד Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 דילול # 2 </td></tr></tbody></table> העורקים תא האנדותל סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> הארנב (P) </td><td> Kolodkin אלכס מעבדה # 3 </td><td></td><td> 1:3000 דילול </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> עיזים (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> ורידי סמן תא האנדותל <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> עיזים (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> דילול 1:100 </td></tr></tbody></table> תא האנדותל הלימפה סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> הארנב (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> עכברוש (ז) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> הארנב (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> עיזים (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> 1:50 דילול </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> הארנב (P) </td><td> תא האיתות </td><td> 3366 </td><td> 1; 100 דילול </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> אוגר סורי (M) </td><td> Hybridoma בנק </td><td> 8.1.1 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> שריר חלק תא / pericyte סמן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> עכבר (M) # 5 </td><td> סיגמא </td><td> c-6198 </td><td> 1:500 דילול # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> הארנב (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> הארנב (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> נוגדנים עבור עיתונאי ה-GFP <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> GFP </td><td> הארנב (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> דילול 1:300 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> עכברוש (ז) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04404-84 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr><tr><td> GFP </td><td> צ&#39;יק (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> דילול 1:300 </td></tr></tbody></table> נוגדנים עבור כתב LacZ <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> הארנב (P) </td><td> MP ביו </td><td> 55976 </td><td> 1:5000 דילול </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> עיזים (P) </td><td> עבד Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> דילול 1:500 </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> צ&#39;יק (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> דילול 1:200 </td></tr></tbody></table> נוגדנים עבור האקסון הפריפריה <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן </td><td> מין </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תנאי עבודה </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> עכבר (M) # 7 </td><td> Hybridoma בנק </td><td> 2H3 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> עכבר (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> דילול 1:500 </td></tr><tr><td> Peripherin </td><td> הארנב (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr></tbody></table> נוגדנים להעברת בתאי שוואן <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> הארנב (P) </td><td> תומאס מולר המעבדה # 9 </td><td></td><td> 1:3000 דילול </td></tr></tbody></table> (P): נוגדן polyclonal, (M): נוגדנים חד שבטיים # 1: אנטי ארמני עיזים אוגר-Cy3 (ImmunoResearch ג&#39;קסון 127-165-160) נוגדן צריך לשמש נוגדן משנית. # 2: הנוגדן IV קולגן יכול לשמש כדי לזהות כלי דם לאחר הכלאה ב באתרה. # 3: הנוגדן Neuropilin1 מסופק על ידי חביב במעבדה Kolodkin של אלכס באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס. כבשה נגד נוגדן אנושי Neuropilin1 זמין במו&quot;פ (AF3870), למרות שאנו לא צריך לבדוק את זה עדיין. # 4: LYVE-1 נוגדנים גם לזהות תת קבוצה של מקרופאגים בעור עובריים. # 5: נוגדנים נגד αSMA הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים IgG2a. # 6: נוגדן Cy3-מצומדות αSMA הוא מודגרות שעה 1 בטמפרטורת החדר יחד עם שניותנוגדנים ondary עבור נוגדנים ראשוניים אחרים. # 7: 2H3 נוגדן הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים נגד IgG1 neurofilament. # 8: Tuj1 נוגדן הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים נגד IgG2a Neuron ספציפיים בכיתה ג&#39;בטא טובולין. # 9: נוגדן (מוח ספציפיים חומצת שומן חלבון מחייב) BFABP מסופק בחביבות על ידי המעבדה של תומאס מולר ב-Max-Delbrück המרכז לרפואה מולקולרית.

whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo

Whole-Mount ניתוח immunohistochemical הדמיה vasculature כולו מרכזי להבנת מנגנוני הסלולר של הסתעפות המורפוגנזה. פיתחנו את העור איבר vasculature מודל ללמוד פיתוח כלי הדם שבו קיימים מקלעת נימי פרימיטיבי הוא ארגן מחדש לתוך רשת מסועפת של כלי הדם הירארכי. Whole-Mount מיקרוסקופיה confocal עם תיוג מרובים מאפשר הדמיה החזקה של כלי הדם ללא פגע, כמו גם מרכיבים תאיים שלהם כולל תאים, pericytes אנדותל ותאי שריר חלק, באמצעות סמנים ניאון ספציפיים. ההתקדמות מודל זה עור vasculature איבר עם מחקרים גנטיים השתפרו הבנה של המנגנונים המולקולריים דפוסים התפתחות כלי הדם. העור האיבר מודל vasculature נעשה שימוש כדי ללמוד איך העצבים ההיקפיים לספק תבנית מרחבית על בידול ועל דפוסים של העורקים. מאמר זה מתאר וידאו פרוטוקול פשוט חזקים כדי כתם הדם שלם עם נוגדנים ספציפיים כלי הדם נוגדנים משני פלורסנט, אשר ישים עבור איברים עובריים vascularized שבו אנו מסוגלים לבצע את תהליך ההתפתחות של כלי הדם.

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo at JoVE.com

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

אנחנו מציגים אימונוהיסטוכימיה כל הר לייזר מיקרוסקופיית confocal עם תיוג מרובים לניתוח רשת סבוכה היווצרות כלי דם בעור איבר עכבר עובריים.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

whole-mount-immunohistochemical-analysis-for-embryonic-limb-skin

Research

JoVE Journal

Biology

17.5K Views.  National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. אנחנו מציגים אימונוהיסטוכימיה כל הר לייזר מיקרוסקופיית confocal עם תיוג מרובים לניתוח רשת סבוכה היווצרות כלי דם בעור איבר עכבר עובריים.

Video: Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

עכבר עובריים תרבות ריאות, מערכת הערכת המנגנונים המולקולריים של מסעף

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...