עבודה זו נתמכה על ידי מספרים מענק R01AI055001 ו R01AI082127 מ NIAID כדי NRM ואת אחוות SREB בפרס על עבודת JLB.

1. והעמסת שכותרתו dextran ו-GSL אני isolectin ב 4 זריקות וריד הפנים לתייג vasculature עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן FITC-dextran (50ug/mL) ב בופר פוספט (PBS) או GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) ב-PBS בצינור Eppendorf 1.5mL וחם עד 37 ° C. הוסף 100uL מניות 1.25mM מהיר ירוק / PBS לפתרון FITC-dextran (הנפח הכולל 1mL) ו 180uL מניות 1.25mM מהיר ירוק / PBS עד 1 GSL - isolectin B 4 (200uL הנפח הכולל), ולכן הפתרון הוא כחול בעליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח E14.5-E18.5 עוברים שק החלמון יחד, עוזב את גבעול allantoic (עורק הטבור וריד) ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים לצלחת פטרי חדש (60 X 15 מ&quot;מ) לטבול אותם PBS בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העובר כדי לספק מבט sagittal הראש / פנים. שימוש במלקחיים לנתח מיקרו בעדינות לתפוס את העובר בראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 30G, להזריק 50uL FITC-dextran (50ug/mL) או GSL 1 - isolectin B 4 (ב 20ug 200uL PBS) לווריד הפנים מכוון את המחט לכיוון החלק האחורי של הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צבע גלוי בווריד הטבור, להוציא את המחט ולהפריד את העובר מן גבעול allantoic (עורק הטבור וריד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זריקות, לאפשר לעובר להישאר PBS בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות כדי לצבוע זורם לאורך העובר. </li></ol> 2. Whole-Mount ניתוח בכלי הדם בעור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המאפשר לצבוע לזרום לאורך העובר, להסיר דגימות עור מאזורים של הגפיים, הגב, הבטן וכו &#39;8,9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מדגם העור בקור PBS, ולתקן 4% PFA / PBS למשך 2 שעות 8,9. לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות כל בקבוקון ברור 4mL עם 2ml קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על עור מדגם מיקרוסקופ שקופיות ולהוסיף 100 μl של הרכבה התקשורת כל שקופית וכוס לכסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות יבש באזור אחסון כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך שלב בסעיף &quot;רכישת תמונות&quot; 2. </li></ol> 3. רב צבע תיוג של התימוס ועל vasculature לב ותאי perivascular עבור cryosections (המשך של סעיף 1, שלב 7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר כולו &quot;פלאש להקפיא&quot; בחנקן נוזלי. עוברים יכולים להיות מאוחסנים ב -80 ° C עד הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לנתח את בלוטת התימוס, לשטוף ב 4 ° C PBS, ולתקן ב Paraformaldehyde 2ml 4% (PFA) / PBS למשך 2 שעות. שטוף 3 פעמים למשך 10 דקות בקור PBS, מקום thymi ב אוקטובר, ולהקפיא ולאחסן עד השימוש ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור cryosectioning, להפיץ אוקטובר על &quot;הבלוק&quot; קטע והר את העובר או באיברים גזור / רקמות עבור חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור הרקמה הקפואה אל תוך 10 חלקים עבים מיקרומטר ולאסוף בשקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון הסעיפים אצטון למשך 5-10 דקות. לשטוף 3 פעמים TBS קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום חמור בדם 10% / כפות בתא לחות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על סעיפים 1 שעה לילה עם 100 μl של נוגדנים העיקרי בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס: בדוגמה זו, אנו משתמשים עכברוש אנטי עכבר CD31 (1:100) על האנדותל, תווית עז אנטי עכבר PDGFR-β (1:100) לתייג תאים perivascular. כדאי לכסות שקופיות עם לחתוך בנפרד רצועות Parafilm כדי להבטיח את הנוגדן היא התפשטה באופן אחיד על פני הקטע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה עם נוגדן ראשוני, לשטוף סעיפים 3 פעמים TBS קר. דגירה עם 100 μl של נוגדנים משני מתאים במשך 30 דקות מינימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים TBS קר. הוסף 100 μl של הרכבה התקשורת כל שקופית וכוס לכסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות יבש באזור אחסון כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף &quot;ייבוא ​​תמונות&quot;. </li></ol> 4. רב צבע תיוג של התימוס בכלי הדם ותאי perivascular עבור חלקים vibratome (המשך של סעיף 1, שלב 7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את אונות התימוס מעובר ולשטוף בקור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן התימוס ב 4% PFA / PBS בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ב-PBS טריטון X (0.15%) 3 פעמים, 10 דקות thymi מקום מחסנית פלסטיק לצלול קטן ב -4% נמוך להמיס agarose / PBS (~ 4 ° C). התימוס צריך להיות במגע עם החלק התחתון של המחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose לבסס על הקרח (3-5 דקות). השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך agarose עודף. הוסף דבק כדי לחסום את vibratome לדבוק מדגם לחסום את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קר PBS לאמבטיה מים vibratome עד המדגם להב שקועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת מהירות משרעת (אמפליטודה גבוהה נמוכה בינונית מהירות הוא אידיאלי עבור חלקים התימוס רך). משרעת צריך להיות מופחת אם חלקים להתפרק עקב תסיסה עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 50 מקטעים אממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מכחול, לאסוף מקטעים microplate 24 באר בקור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק הסעיפים 500 μl של נסיוב חמור של 10% טריטון X-PBS (0.15%) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים דגירה עבור 8 שעות לילה עם נוגדן ראשוני, כגון אנטי CD31 ואנטי PDGFR-β, ב microplate 24-מכוסה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) על סך של 8 שעות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק סעיפים בסרום חמור של 10% טריטון X-PBS (0.15%) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חלקים עבור 8 שעות הלילה ב 4 ° C עם נוגדנים משני המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) על סך של 8 שעות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לתקן דגימות 4% PFA / PBS במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) מעל 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים דגימות דרך מדורגת MeOH / PBS-טריטון X סדרה: 25% MeOH, MeOH 50%, MeOH 75% ו 100% MeOH ב 10 דקות לכל שלב. החלף MeOH 100% עם MeOH טרי אחרי 10 דקות לדגור במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיכל זכוכית, לערבב באב (בנזיל אלכוהול: בנזיל בנזואט) ביחס 1:02. שלב באב עם MeOH ריכוז סופי של 50% ו באב MeOH 50%. דגירה המדגם באב: MeOH במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימת למיכל זכוכית עם 100% ו באב דגירה במשך 10-15 דקות או עד פינה, בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שקופיות דיכאון (0.7mm עומק) עם באב 100% טרי מדגם להעביר לצד. מוסיפים כיסוי זכוכית (מס &#39;1.5) ואת החותם עם 2-3 שכבות של לק. אפשר לק להקשיח בחושך בטמפרטורת החדר, ואז לאחסן מדגם ב 4 ° C. הערה: שקופיות חייב להיות אטום לחלוטין לפני רכישת התמונה confocal. תמונות צריך להירכש בתוך 12-24 שעות, כמו צבעי ניאון יכול להמוג באב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף &quot;ייבוא ​​תמונות&quot;. </li></ol> 5. תמונה הרכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה 10 מיקרומטר חלקים קפואים עם מיקרוסקופ confocal באמצעות תכנית-Apochromat 20X/0.8 אובייקטיבי (512 X 512 פיקסלים) עם 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin ב &#39;4), 543 -, ו - 633 ננומטר קווי לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת confocal Z-קטעים של העור הר שלם 50 מיקרומטר agarose-משובצים קטעים באמצעות תכנית-Apochromat 10X/0.4 אובייקטיבי (512 X 512 פיקסלים) עם 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin ב &#39;4), 543 -, ו 633 ננומטר קווי לייזר. Serial-Z קטעי יש לאסוף באופן רציף עבור כל ערוץ בהתאמה ב 1 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר סדרתי Z-קטעים באמצעות Zeiss AxioVision 4.6 או תוכנות אחרות ניתוח התמונה. </li></ol> 6. נציג תוצאות: תיוג יעיל של כלי הדם העוברי היא קריטית להערכת פגמים כלי דם בעכברים עובריים. איור 1 מציג תוויות ספציפיים של כלי הדם E16.5 התימוס (1A-B) ושיתוף עם תיוג CD31 (1B), בנוסף מכתים של החדרים, ימין ושמאל (1E-F), בהתאמה. I-GSL isolectin B 4 פרוטוקול cryosections כמתואר בסעיפים 1, 3 ו 5 שימש בניסויים אלו. Whole-Mount תיוג של רשת כלי דם בעור E16.5 על עכברים, באמצעות פרוטוקולים המתוארים בסעיפים 1, 2, ו -5 מוצג באיור 1C-D. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg" /> איור 1 מקרא. FITC GSL אני - isolectin ב 4 זריקות לתוך וריד הפנים E16.5 עוברי עכברים. Cryosection א של התימוס עובריים לאחר ההזרקה. b. מיזוג של CD31 במשותף עם תיוג B isolectin 4. ג ו - ד Whole-mount של הזרקת vasculature עובריים העור הבאה. e. ו Cryosection ו עובריים של הלב ה (מימין החדר) ו (משמאל החדר) הזריקה הבאה.

<ol>
	<li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus.">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li><li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture.">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li><li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus.">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li><li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus.">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization.">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li><li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development.">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li><li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice.">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li><li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback.">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice.">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Whole-mount ו PECAM-1 (CD31) מכתים על הסעיפים הם בשיטות המקובלות על תיוג vasculature בעכברים עובריים. שיטות אלו דורשים שימוש immunofluorescence ישיר ו / או עקיף, דטרגנטים כדי permeabilize רקמות העכבר. זה מוכיח להיות תהליך עדכני למדי. הנה, יש לנו עובדים FITC-dextran או isolectin ב 4 זריקות וריד הפנים ישירות ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> FITC-dextran </td><td> סיגמא </td><td> FD150S-1G </td></tr><tr><td> והעמסת שכותרתו GSL 1 - ב 4 isolectin </td><td> וקטור מעבדות </td><td> FL-1201 </td></tr><tr><td> מהיר גרין </td><td> MP Biomedicals </td><td> 195178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76240 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> אטלנטה הביולוגיים </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> מתחם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> אצטון </td><td> JT בייקר </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> חמור סרום </td><td> ג&#39;קסון </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> עכברוש אנטי עכבר CD31, </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558736 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר עז PDGFR-β </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> חמור נגד חולדה CD31 Alexa 647 (Invitrogen) </td><td> Biolegend </td><td> 102516 </td></tr><tr><td> חמור נגד עז Alexa 594 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> טריטון X -100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td></tr><tr><td> נמוכה להמיס agarose / PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9414-25 גרם </td></tr><tr><td> מתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A413-4 </td></tr><tr><td> בנזיל אלכוהול </td><td> Acros מדעי </td><td> 148390010 </td></tr><tr><td> בנזיל בנזואט </td><td> Acros מדעי </td><td> 105860010 </td></tr><tr><td> דיכאון שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית (22X22) -1.5 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 152222 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 510 מיקרוסקופ Meta Confocal </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים לנתח Micro </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td></tr><tr><td> Parafilm מס &#39;OM992 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 ו 24 microplates היטב </td><td> אוורגרין מדעי </td><td> 222-8044-01F </td></tr><tr><td> Superfrost / פלוס מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4mL צלוחיות ברור </td><td> לאומית מדעי </td><td> B7800-2 </td></tr></tbody></table>

a method for labeling vasculature in embryonic mice

הקמתה של רשת כלי דם תפקודית הוא חלק חיוני של organogenesis, והוא נחוץ לצורך תפקוד האיבר אופטימלית. לדוגמה, במבנה vasculature התימוס נכונה דפוסים חיונית כניסה thymocyte לתוך איבר ויציאה בוגרת T-cell לפריפריה. הסידור המרחבי של כלי הדם התימוס תלוי אותות microenvironment המקומית, כלומר בתאי אפיתל הרתי (TEC). הדיווחים האחרונים מצביעים על כך מספר שיבוש תוצאות אלו אותות כלי דם התימוס 1,2 פגמים. מחקרים קודמים תיארו טכניקות המשמשים התווית התימוס ילודים ומבוגרים 1,2 vasculature. אנו מדגימים כאן טכניקה תיוג כלי הדם התימוס עובריים. שיטה זו משלבת את השימוש FITC-dextran או Griffonia (Bandeiraea) לקטינים Simplicifolia אני (GSL 1 - isolectin B 4) זריקות וריד הפנים CD31 מכתים נוגדן לזהות מבנים וסקולרית התימוס ועל PDGFR-β לתייג הרתי perivascular mesenchyme 3-5. האפשרות של שימוש cryosections או חלקים vibratome הוא גם סיפק. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות מומים בכלי הדם התימוס, שהוא קריטי עבור הגדרת התפקידים של TEC-derived מולקולות היווצרות כלי דם התימוס. כפי שיטת התוויות vasculature כולו, זה יכול לשמש גם כדי לנתח את רשתות כלי דם באיברים ורקמות רבות ברחבי העובר כולל העור לב 6-10.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice at JoVE.com

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

a-method-for-labeling-vasculature-in-embryonic-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Views.  University of Georgia. מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.

Video: A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Neuroscience

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Biology

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bioengineering

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed in mice is high. Phenotypic characterization of these mouse models also requires the examination of cardiac function and morphology. Echocardiography and magnetic resonance imaging (MRI) are commonly used approaches to characterize cardiac function and morphology in mice. Echocardiographic and MRI equipment specialized for use in small rodents is&#160;expensive and requires a dedicated space. This protocol describes cardiac measurements in mice using a clinical echocardiographic system with a 15 MHz human vascular probe. Measurements are performed on anesthetized adult mice. At least three image sequences are recorded and analyzed for each animal in M-mode in the parasternal short-axis view. Afterwards, cardiac histological examination is performed, and cardiomyocyte diameters are determined on hematoxylin-eosin- or wheat germ agglutinin (WGA)-stained paraffin sections. Vessel density is determined morphometrically after Pecam-1 immunostaining. The protocol has been applied successfully to pharmacological studies and different genetic animal models under baseline conditions, as well as after experimental myocardial infarction by the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). In our experience, echocardiographic investigation is limited to anesthetized animals and is feasible in adult mice weighing at least 25 g.

Echocardiographic examination is frequently used in mice. Expensive high-resolution ultrasound devices have been developed for this purpose. This protocol describes an affordable echocardiographic procedure combined with histological morphometric analyses to determine cardiac morphology.

בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Medicine

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video