עבודה זו נתמכה על ידי מספרים מענק R01AI055001 ו R01AI082127 מ NIAID כדי NRM ואת אחוות SREB בפרס על עבודת JLB.

1. והעמסת שכותרתו dextran ו-GSL אני isolectin ב 4 זריקות וריד הפנים לתייג vasculature עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן FITC-dextran (50ug/mL) ב בופר פוספט (PBS) או GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) ב-PBS בצינור Eppendorf 1.5mL וחם עד 37 ° C. הוסף 100uL מניות 1.25mM מהיר ירוק / PBS לפתרון FITC-dextran (הנפח הכולל 1mL) ו 180uL מניות 1.25mM מהיר ירוק / PBS עד 1 GSL - isolectin B 4 (200uL הנפח הכולל), ולכן הפתרון הוא כחול בעליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח E14.5-E18.5 עוברים שק החלמון יחד, עוזב את גבעול allantoic (עורק הטבור וריד) ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים לצלחת פטרי חדש (60 X 15 מ&quot;מ) לטבול אותם PBS בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העובר כדי לספק מבט sagittal הראש / פנים. שימוש במלקחיים לנתח מיקרו בעדינות לתפוס את העובר בראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 30G, להזריק 50uL FITC-dextran (50ug/mL) או GSL 1 - isolectin B 4 (ב 20ug 200uL PBS) לווריד הפנים מכוון את המחט לכיוון החלק האחורי של הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צבע גלוי בווריד הטבור, להוציא את המחט ולהפריד את העובר מן גבעול allantoic (עורק הטבור וריד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זריקות, לאפשר לעובר להישאר PBS בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות כדי לצבוע זורם לאורך העובר. </li></ol> 2. Whole-Mount ניתוח בכלי הדם בעור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המאפשר לצבוע לזרום לאורך העובר, להסיר דגימות עור מאזורים של הגפיים, הגב, הבטן וכו &#39;8,9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מדגם העור בקור PBS, ולתקן 4% PFA / PBS למשך 2 שעות 8,9. לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות כל בקבוקון ברור 4mL עם 2ml קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על עור מדגם מיקרוסקופ שקופיות ולהוסיף 100 μl של הרכבה התקשורת כל שקופית וכוס לכסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות יבש באזור אחסון כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך שלב בסעיף &quot;רכישת תמונות&quot; 2. </li></ol> 3. רב צבע תיוג של התימוס ועל vasculature לב ותאי perivascular עבור cryosections (המשך של סעיף 1, שלב 7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר כולו &quot;פלאש להקפיא&quot; בחנקן נוזלי. עוברים יכולים להיות מאוחסנים ב -80 ° C עד הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לנתח את בלוטת התימוס, לשטוף ב 4 ° C PBS, ולתקן ב Paraformaldehyde 2ml 4% (PFA) / PBS למשך 2 שעות. שטוף 3 פעמים למשך 10 דקות בקור PBS, מקום thymi ב אוקטובר, ולהקפיא ולאחסן עד השימוש ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור cryosectioning, להפיץ אוקטובר על &quot;הבלוק&quot; קטע והר את העובר או באיברים גזור / רקמות עבור חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור הרקמה הקפואה אל תוך 10 חלקים עבים מיקרומטר ולאסוף בשקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון הסעיפים אצטון למשך 5-10 דקות. לשטוף 3 פעמים TBS קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום חמור בדם 10% / כפות בתא לחות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על סעיפים 1 שעה לילה עם 100 μl של נוגדנים העיקרי בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס: בדוגמה זו, אנו משתמשים עכברוש אנטי עכבר CD31 (1:100) על האנדותל, תווית עז אנטי עכבר PDGFR-β (1:100) לתייג תאים perivascular. כדאי לכסות שקופיות עם לחתוך בנפרד רצועות Parafilm כדי להבטיח את הנוגדן היא התפשטה באופן אחיד על פני הקטע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה עם נוגדן ראשוני, לשטוף סעיפים 3 פעמים TBS קר. דגירה עם 100 μl של נוגדנים משני מתאים במשך 30 דקות מינימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים TBS קר. הוסף 100 μl של הרכבה התקשורת כל שקופית וכוס לכסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות יבש באזור אחסון כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף &quot;ייבוא ​​תמונות&quot;. </li></ol> 4. רב צבע תיוג של התימוס בכלי הדם ותאי perivascular עבור חלקים vibratome (המשך של סעיף 1, שלב 7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את אונות התימוס מעובר ולשטוף בקור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן התימוס ב 4% PFA / PBS בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ב-PBS טריטון X (0.15%) 3 פעמים, 10 דקות thymi מקום מחסנית פלסטיק לצלול קטן ב -4% נמוך להמיס agarose / PBS (~ 4 ° C). התימוס צריך להיות במגע עם החלק התחתון של המחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose לבסס על הקרח (3-5 דקות). השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך agarose עודף. הוסף דבק כדי לחסום את vibratome לדבוק מדגם לחסום את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קר PBS לאמבטיה מים vibratome עד המדגם להב שקועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת מהירות משרעת (אמפליטודה גבוהה נמוכה בינונית מהירות הוא אידיאלי עבור חלקים התימוס רך). משרעת צריך להיות מופחת אם חלקים להתפרק עקב תסיסה עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 50 מקטעים אממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מכחול, לאסוף מקטעים microplate 24 באר בקור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק הסעיפים 500 μl של נסיוב חמור של 10% טריטון X-PBS (0.15%) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים דגירה עבור 8 שעות לילה עם נוגדן ראשוני, כגון אנטי CD31 ואנטי PDGFR-β, ב microplate 24-מכוסה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) על סך של 8 שעות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק סעיפים בסרום חמור של 10% טריטון X-PBS (0.15%) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חלקים עבור 8 שעות הלילה ב 4 ° C עם נוגדנים משני המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) על סך של 8 שעות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לתקן דגימות 4% PFA / PBS במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) מעל 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים דגימות דרך מדורגת MeOH / PBS-טריטון X סדרה: 25% MeOH, MeOH 50%, MeOH 75% ו 100% MeOH ב 10 דקות לכל שלב. החלף MeOH 100% עם MeOH טרי אחרי 10 דקות לדגור במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיכל זכוכית, לערבב באב (בנזיל אלכוהול: בנזיל בנזואט) ביחס 1:02. שלב באב עם MeOH ריכוז סופי של 50% ו באב MeOH 50%. דגירה המדגם באב: MeOH במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימת למיכל זכוכית עם 100% ו באב דגירה במשך 10-15 דקות או עד פינה, בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שקופיות דיכאון (0.7mm עומק) עם באב 100% טרי מדגם להעביר לצד. מוסיפים כיסוי זכוכית (מס &#39;1.5) ואת החותם עם 2-3 שכבות של לק. אפשר לק להקשיח בחושך בטמפרטורת החדר, ואז לאחסן מדגם ב 4 ° C. הערה: שקופיות חייב להיות אטום לחלוטין לפני רכישת התמונה confocal. תמונות צריך להירכש בתוך 12-24 שעות, כמו צבעי ניאון יכול להמוג באב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף &quot;ייבוא ​​תמונות&quot;. </li></ol> 5. תמונה הרכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה 10 מיקרומטר חלקים קפואים עם מיקרוסקופ confocal באמצעות תכנית-Apochromat 20X/0.8 אובייקטיבי (512 X 512 פיקסלים) עם 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin ב &#39;4), 543 -, ו - 633 ננומטר קווי לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת confocal Z-קטעים של העור הר שלם 50 מיקרומטר agarose-משובצים קטעים באמצעות תכנית-Apochromat 10X/0.4 אובייקטיבי (512 X 512 פיקסלים) עם 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin ב &#39;4), 543 -, ו 633 ננומטר קווי לייזר. Serial-Z קטעי יש לאסוף באופן רציף עבור כל ערוץ בהתאמה ב 1 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר סדרתי Z-קטעים באמצעות Zeiss AxioVision 4.6 או תוכנות אחרות ניתוח התמונה. </li></ol> 6. נציג תוצאות: תיוג יעיל של כלי הדם העוברי היא קריטית להערכת פגמים כלי דם בעכברים עובריים. איור 1 מציג תוויות ספציפיים של כלי הדם E16.5 התימוס (1A-B) ושיתוף עם תיוג CD31 (1B), בנוסף מכתים של החדרים, ימין ושמאל (1E-F), בהתאמה. I-GSL isolectin B 4 פרוטוקול cryosections כמתואר בסעיפים 1, 3 ו 5 שימש בניסויים אלו. Whole-Mount תיוג של רשת כלי דם בעור E16.5 על עכברים, באמצעות פרוטוקולים המתוארים בסעיפים 1, 2, ו -5 מוצג באיור 1C-D. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg" /> איור 1 מקרא. FITC GSL אני - isolectin ב 4 זריקות לתוך וריד הפנים E16.5 עוברי עכברים. Cryosection א של התימוס עובריים לאחר ההזרקה. b. מיזוג של CD31 במשותף עם תיוג B isolectin 4. ג ו - ד Whole-mount של הזרקת vasculature עובריים העור הבאה. e. ו Cryosection ו עובריים של הלב ה (מימין החדר) ו (משמאל החדר) הזריקה הבאה.

<ol>
	<li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus.">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li><li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture.">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li><li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus.">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li><li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus.">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization.">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li><li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development.">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li><li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice.">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li><li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback.">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice.">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Whole-mount ו PECAM-1 (CD31) מכתים על הסעיפים הם בשיטות המקובלות על תיוג vasculature בעכברים עובריים. שיטות אלו דורשים שימוש immunofluorescence ישיר ו / או עקיף, דטרגנטים כדי permeabilize רקמות העכבר. זה מוכיח להיות תהליך עדכני למדי. הנה, יש לנו עובדים FITC-dextran או isolectin ב 4 זריקות וריד הפנים ישירות ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> FITC-dextran </td><td> סיגמא </td><td> FD150S-1G </td></tr><tr><td> והעמסת שכותרתו GSL 1 - ב 4 isolectin </td><td> וקטור מעבדות </td><td> FL-1201 </td></tr><tr><td> מהיר גרין </td><td> MP Biomedicals </td><td> 195178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76240 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> אטלנטה הביולוגיים </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> מתחם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> אצטון </td><td> JT בייקר </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> חמור סרום </td><td> ג&#39;קסון </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> עכברוש אנטי עכבר CD31, </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558736 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר עז PDGFR-β </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> חמור נגד חולדה CD31 Alexa 647 (Invitrogen) </td><td> Biolegend </td><td> 102516 </td></tr><tr><td> חמור נגד עז Alexa 594 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> טריטון X -100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td></tr><tr><td> נמוכה להמיס agarose / PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9414-25 גרם </td></tr><tr><td> מתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A413-4 </td></tr><tr><td> בנזיל אלכוהול </td><td> Acros מדעי </td><td> 148390010 </td></tr><tr><td> בנזיל בנזואט </td><td> Acros מדעי </td><td> 105860010 </td></tr><tr><td> דיכאון שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית (22X22) -1.5 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 152222 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 510 מיקרוסקופ Meta Confocal </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים לנתח Micro </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td></tr><tr><td> Parafilm מס &#39;OM992 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 ו 24 microplates היטב </td><td> אוורגרין מדעי </td><td> 222-8044-01F </td></tr><tr><td> Superfrost / פלוס מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4mL צלוחיות ברור </td><td> לאומית מדעי </td><td> B7800-2 </td></tr></tbody></table>

a method for labeling vasculature in embryonic mice

הקמתה של רשת כלי דם תפקודית הוא חלק חיוני של organogenesis, והוא נחוץ לצורך תפקוד האיבר אופטימלית. לדוגמה, במבנה vasculature התימוס נכונה דפוסים חיונית כניסה thymocyte לתוך איבר ויציאה בוגרת T-cell לפריפריה. הסידור המרחבי של כלי הדם התימוס תלוי אותות microenvironment המקומית, כלומר בתאי אפיתל הרתי (TEC). הדיווחים האחרונים מצביעים על כך מספר שיבוש תוצאות אלו אותות כלי דם התימוס 1,2 פגמים. מחקרים קודמים תיארו טכניקות המשמשים התווית התימוס ילודים ומבוגרים 1,2 vasculature. אנו מדגימים כאן טכניקה תיוג כלי הדם התימוס עובריים. שיטה זו משלבת את השימוש FITC-dextran או Griffonia (Bandeiraea) לקטינים Simplicifolia אני (GSL 1 - isolectin B 4) זריקות וריד הפנים CD31 מכתים נוגדן לזהות מבנים וסקולרית התימוס ועל PDGFR-β לתייג הרתי perivascular mesenchyme 3-5. האפשרות של שימוש cryosections או חלקים vibratome הוא גם סיפק. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות מומים בכלי הדם התימוס, שהוא קריטי עבור הגדרת התפקידים של TEC-derived מולקולות היווצרות כלי דם התימוס. כפי שיטת התוויות vasculature כולו, זה יכול לשמש גם כדי לנתח את רשתות כלי דם באיברים ורקמות רבות ברחבי העובר כולל העור לב 6-10.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice at JoVE.com

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

a-method-for-labeling-vasculature-in-embryonic-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Views.  University of Georgia. מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.

Video: A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

דימות אופטי לא פולשנית של כלי דם הלימפה של עכבר

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

הדמיה של multimodality 4D<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; זיהומים בעכברים

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death through pulmonary embolism or results in the post-thrombotic syndrome, characterized by chronic leg pain, swelling, and ulceration, or in chronic pulmonary hypertension resulting in significant chronic respiratory compromise. This is the most common cardiovascular disease after myocardial infarction and ischemic stroke and is a clinical challenge for all medical disciplines, as it can complicate the course of other disorders such as cancer, systemic disease, surgery, and major trauma.
Experimental models are necessary to study these mechanisms. The stasis model induces consistent thrombus size and a quantifiable amount of thrombus. However, it is necessary to systematically ligate side branches of the inferior vena cava to avoid variability in thrombus sizes and any erroneous data interpretation. We have developed a non-invasive technique to measure thrombus size using ultrasonography. Using this technique, we can assess thrombus development and resolution over time in the same animal. This approach limits the number of mice required for quantification of venous thrombosis consistent with the principle of replacement, reduction, and refinement of animals in research. We have demonstrated that thrombus weight and histological analysis of thrombus size correlate with measurement obtained with ultrasonography. Therefore, the current study describes how to induce deep vein thrombosis in mice using the inferior vena cava stasis model and how to monitor it using high frequency ultrasound.

The present protocol describes the steps to obtain venous thrombosis using a stasis model. In addition, we are using a non-invasive method to measure thrombus formation and resolution over time.

פקקת ורידים עמוקה שנגזרות Stasis בעכברים המנוטרת על-ידי בדיקת אולטרה סאונד בתדירות גבוהה

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections may be one possible cause. The typical animal model used for studying BA is established by inoculating a neonatal mouse with a rhesus rotavirus. Silver nanoparticles have been shown to exert antibacterial and antiviral effects; their function in the BA mouse model is evaluated in this study. Currently, in BA animal experiments, the methods used to improve the symptoms of BA mice are generally symptomatic treatments given via food or other drugs. The aim of this study is to demonstrate a new method for ameliorating BA syndrome in mice by the intraperitoneal injection of silver nanoparticles and to provide detailed methods for preparing the silver nanoparticle gel formulation. This method is simple and widely applicable and can be used to research the mechanism of BA, as well as in clinical treatments. Based on the BA mouse model, when the mice exhibit jaundice, the prepared silver nanoparticle gel is injected intraperitoneally to the surface of the lower liver. The survival status is observed, and biochemical indicators and liver histopathology are examined. This method allows a more intuitive understanding of both the establishment of the BA model and novel BA treatments.

This article describes in detail a method based on silver nanoparticles for ameliorating biliary atresia syndrome in an experimental biliary atresia mouse model. A solid understanding of the reagent preparation process and the neonatal mouse injection technique will help familiarize researchers with the method used in neonatal mouse model studies.

שיטת ננו-חלקיק כסף Ameliorating בהכנת בכיס המרה תסמונת בעכברים

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...