מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי

פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת קסנוגרפטים שמקורם במטופלים, המאכלסים מחדש את ההיסטופטולוגיה של מומים הוורידיים. זה הורשה עוד יותר לשאת את הבדיקות הטיפוליות הקדם קליניות שלנו. טכניקה זו מספקת מערכת NVivo מהירה ואמינה המאפשרת ניטור יומי של הצמיחה של תאי אנדותל ישירים למטופל ואת התגובה לטיפול ניסיוני.

שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לחקור סוגים אחרים של אנומליות כלי דם או הלימפה. התחל על ידי הכנת ההשעיה התא להזרקה. טריפסיניזציה של תאי ה אנדותל עם חמישה מיליליטר של 0.05% מחומם מראש-tripsin-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.

לנטרל את הנסיעות ועל ידי הוספת חמישה מיליליטר של EGM ולאסוף את התאים לתוך צינור חרוט 150 מיליליטר. צנטריפוגה זה 400 פעמים G במשך חמש דקות ואז לשאוף את supernatant ולתלות את התאים בשלושה מיליליטר של EGM. לספור את התאים עם המוציטומטר.

סיכון נפח עם מספר התא הרצוי לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר גלולה התאים שוב על ידי צנטריפוגה. שאפו את העל-טבעי והשאירו נפח קטן כדי לשחרר את גלולת התא. תן שימוש חוזר לכדור התא עם 220 מיקרוליטרים של BMEM לכל זריקה.

מערבבים את ההשעיה התא ביסודיות על הקרח הקפדה להימנע מיצירת בועות. שאף את תרבות התאים BMEM לערבב לתוך פתיחת מזרק מיליליטר אחד על ידי משיכת הבוכנה. אתה תנעל מחט סטרילית 26 מד למזרק ולשמור את המזרקים מוכנים שטוח על קרח לפני ההזרקה.

לאחר הבטחת העכבר יש הרדמה כראוי למקם אותו על הבטן שלה לחטא את אזור ההזרקה עם 70%אתנול. מגלגלים בעדינות את המזרק המוכן כדי לעכל מחדש את כל התאים המיושבים. פתית בועות עד סוף המזרק ולגרש נפח קטן של ההשעיה התא.

צבוט את העור באתר ההזרקה כדי ליצור אוהל כמו מבנה. ואז להכניס את המחט ממש מתחת לעור ולוודא כי המחט היא רק עור עמוק על ידי שחרור עור צביטה כדי למנוע הזרקה לתוך רקמת השריר. מחזיק את המחט בהתמדה להזריק 200 microliters של ההשעיה התא כדי ליצור מסה כדורית קטנה.

יש לדאוג כדי למנוע הזרקת ההשעיה התא לתוך השריר. למדוד את האורך והרוחב של כל תקע עם caliper. יישר את תקעי הקסנוגרפט המנותלים על קרש חיתוך ליד סרגל וקח תמונה כדי לתעד את כלי הדם הגולמיים של הנגעים.

לאחר מכן תקן את התקעים על ידי שקוע אותם 10% פורמלין לילה בטמפרטורת החדר. לאחר הניתוח, תקעי הנגע מעובדים לניתוח היסטולוגי ומוכתמים עבור UEA-1 כדי לזהות תאים אנדותל שמקורם בבני אדם בתוך התקע. קח חמש תמונות HPF לכל קטע נגע עם מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של 20 X בתבנית מישור X בתוך מקטע ההנעה כדי למנוע חפיפה.

הקפד לכלול סרגל קנה מידה בתמונות שצולמו. פתח את תמונות HPF בתמונה J.To את הפיקסלים של סרגל קנה המידה, השתמש בכלי הקו הישר ועקף את סרגל קנה המידה. לאחר מכן המירו את הפיקסלים שנמדדו למילימטרים על-ידי לחיצה על נתח וגדיר קנה מידה.

לאחר מכן לחצו על 'נתח מדידות מוגדרות' ובחרו אזור והוסיפו לשכבות-על. למדוד את שטח השדה הכולל של HPF באמצעות לנתח ולמדוד שמירה של מדידה זו לכמות. שימוש בכלי בחירות היד החופשית מתאר ידנית את ערוץ כלי הדם החיובי UEA-1.

לחץ על נתח ולמדוד כדי לכמת את האזור המתואר. למדוד את כל תעלות כלי הדם בתוך HPF. חזור על התהליך עבור חמשת HPF שצולמו בתוך כל מקטע והעבר את הערכים ל- Excel לצורך ניתוח נוסף.

לאחר מכן לחשב את אחוז שטח כלי הדם וצפיפות כלי הדם על פי הוראות כתב היד. באמצעות פרוטוקול זה תקעי ההנעה עם תאי אנדותל מוטנטים היפראקטיביים TIE2 או PIK3CA הם כלי דם בעליל ומפרפרים בתוך שבעה עד תשעה ימים לאחר ההזרקה. תקעי ההנעה דומים מאוד לתכונות ההיסטופתולוגיות של רקמת VM אנושית ותעלות כלי דם גדולות המיושרות על ידי שכבה דקה של תאי אנדותל גלויים.

מבני כלי דם אלה מכילים בדרך כלל אריתוציטים המאשרים אנסטומוזיס תפקודי עם כלי הדם של העכבר המארח. כתמים אימונוהיסטוכימיים באמצעות Lectin UEA-1 הספציפי האנושי מאשר כי התאים רירית אזורי כלי הדם נגזרים תאים מושתלים אנושיים ולא כלי דם של העכבר. בעקבות הליך זה, כתמים נוספים של מקטעי הנגע עבור סמנים של התפשטות או אפופטוזיס ניתן לבצע כדי לנתח השפעות ספציפיות של טיפולים ניסיוניים.

מודל scenographic זה שימש למחקרים פרה-קליניים של טיפולים חדשים עבור מום ורידי, כגון מעכב mTOR rapamycin, אשר הראה יעילות במספר ניסויים קליניים עבור חולי VM.