הטכניקה שלנו מאפשרת הדמיה מדויקת של תאי חיסון אנושיים שנצברו בריאה בתנאים דלקתיים של ויוו ומספקת תובנות מרגשות על תהליך ביות תאי T. פרוטוקול זה תומך במחקר תרגום על ביות ריאות תא T ובכך עשוי לסייע בזיהוי מטרות חדשות לטיפול אופטימיזציה של מחלות ריאות דלקתיות או אלרגיות. בפרט, היכולת לשקול את ההשפעה של תכונות תאים חיסוניים ספציפיים למחלות, ארגון רקמת ריאות, ומילייה דלקתי על ביות ריאות תא T עושה שיטה זו יתרון רב.
בסך הכל, הטכניקה שלנו היא ערך גבוה למחקר אימונולוגי בתחום מחלות ריאות דלקתיות כרוניות, אשר מונעים לעתים קרובות על ידי הצטברות רקמות מכריע של תאים חיסוניים פעילים. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן לפחות 16 גרם, שישה שבועות, הרדמה C57 שחור 6J עכבר, להשתמש micropipet לאט לספק 10 microliters של פתרון פפאין מוכן טרי לתוך נחיר אחד של העכבר פעם ביום במשך שלושה ימים רצופים. יום לאחר ממשל הפפאין האחרון, שכבה 10 מיליליטר של מדיום Ficoll תחת דם היקפי אנושי ממתנדב בריא מדולל מראש ביחס של אחד עד שניים ב- PBS להפרדת שיפוע צפיפות על ידי צנטריפוגה.
מעבירים את תא הדם המונונוקלארי ההיקפי או את שכבת האינטרפאז PBMC לצינור חדש של 50 מיליליטר ואוסף את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, בצע בידוד microbead מגנטי של תאים חיוביים CD4 על פי פרוטוקול היצרן. השעיה מחדש של תאי CD4 חיוביים מבודדים של חרוזים עד פי 10 עד תאי T השביעיים לכל לפחות 500 מיקרוליטרים של ריכוז PBS.
סמן את התאים עם אור אדום מתאים להתרבות תאים צבע במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, עצרו את תגובת התיוג עם חמישה כרכים של מדיום RPMI בתוספת 10% FBS במשך חמש דקות על קרח ואחריו שלוש שטיפות במדיום. להעברה מאמצת של תאי ה-CD4 החיוביים האנושיים לעכברי נמען חשופי פפאין, להשעות מחדש את תאי T המסומנים באופן פלואורסצנטי לתאי T פי 10 לתאים השביעיים לריכוז מיליליטר ב- PBS ולהעמיס 100 מיקרוליטרים של תאים לתוך מזרק אחד של מיליליטר המצויד במחט של 30 מד לכל בעל חיים נמען, ואז להזריק את כל נפח התאים ממזרק אחד לתוך וריד הזנב חיה אחת שטופלה בפפאין שומרת על קצה המחט בתוך וריד. חמש שניות לאחר מסירת התא כדי למנוע פריקה של ההשעיה התא.
שלוש שעות לאחר העברת תאים מאמצים, לנקב את החדר הימני של כל עכבר המתת דם עם cannula 21-מד מחובר קטטר ולעשות חתך בחדר השמאלי. לאט לאט לבלבל את הריאה עם 20 מיליליטר של PBS קר כקרח בתוספת חמישה מילימולרים EDTA ואחריו שני מיליליטר של קרח קר 4% paraformaldehyde. כאשר כל התיקון כבר סמוק דרך הרקמה, להסיר את בלוטות הרוק לחתוך את שריר עצם החזה כדי לאפשר מדחפים להיות החליק מתחת קנה הנשימה לחשוף את רקמת airtube.
בצע ניקוב ראשוני של קנה הנשימה החשוף עם מחט 30-מד לפני החלפת המחט עם קטטר קהה 30-מד כדי למנוע נזק נוסף לרקמה. השתמש במחזיק מחט כדי לאטום את הצומת בין הקטטר שהוכנס קנה הנשימה, בזהירות למלא את דרכי הנשימה עם כ 37 מעלות צלזיוס 0.75% התעורר עד התגלגלות מלאה של הריאה. צומת הדוק בין קטטר קנה הנשימה הוא קריטי להרחבת הריאה לגודל הפיזיולוגי שלה ושמירה על ארכיטקטורת רקמות להדמיה.
כאשר ההתעוררות התגבשה לחלוטין, הסר את הקטטר והעבר בזהירות את הריאה לצינור חשוך של שני מיליליטר מלא בפרפורמלדהדייה 4%. לאחר מכן, לייבש את הרקמה עם דגירה אתנול רציפה תחת סיבוב מתמשך ב 31 סיבובים לדקה וארבע מעלות צלזיוס כפי שצוין במשך ארבע שעות לכל דגירה. לאחר התייבשות מוחלטת, מעבירים את הדגימה לאתיל סינמט לצורך דגירה לילית בטמפרטורת החדר עד שהרקמות מופיעות שקופות.
למיקרוסקופ פלואורסצנטי בהיר, השתמשו בירידה קטנה של דבק יציב ממס אורגני כדי להדביק את הריאה למחזיק הדגימה של המיקרוסקופ ולהגדיר את אונת הריאה על המחזיק במצב זקוף. מניחים את מחזיק הדגימה בתאו ובחרו את הלייזרים המתאימים לניסוי בתוכנת המכשיר. לאחר מכן, השתמש המחוונים תחת אופטיקה כדי להגדיר רוחב גיליון כי הצמצם המספרי לחשוף באופן אחיד את האיבר כולו או קטע מסוים של עניין.
השתמשו במ המחוון להגדרת עוצמת הלייזר תחת בקרת שידור בלייזר לכל לייזר שנבחר ולחצו על 'החל'. השתמשו בהגדרות מדידה מתקדמות למיזוג גליונות האור השמאליים והימין ליצירת תמונה מוארת באופן הומוגני. הגדר את מיקומי ההתחלה והסיום של מחסנית Z שיש למדוד תחת טווח סריקה והגדר את גודל השלב לחמישה מיקרומטרים ולאחר מכן בחר שמירה אוטומטית כדי לשמור את הקבצים באופן אוטומטי ולהתחיל במדידה כדי ללכוד את התמונות.
לאחר שכל התמונות נרכשו, הפעילו את הלחצן 'עלה' בתוכנת הניתוח 'תלת-ממדי' לאחר ההדמיה וטעינו את התמונה הראשונה מערימת Z אחת כדי ליזום שחזור תלת-ממדי פותח ואוטומטי של כל התמונות האחרות של מחסנית Z שנבחרה, ולאחר מכן, תחת 'התאמת תצוגה', התאימו את העוצמה, הרמה השחורה והניגודיות לכל ערוץ. כדי להשוות את הצטברות התאים האנושיים בתוך רקמת הריאה לדגימות שונות, בחר 'עריכה' ו'חתוך תלת-ממדי' כדי להגדיר קוביית ריאה עם נפח מסוים. כדי לכמת את התאים המסווים בתוך קוביית הריאה המוגדרת, פתח את הוסף כתמים חדשים בסרגל הכלים, לחץ על דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני ובחר את ערוץ 640 ננומטר.
הגדר את קנה המידה של הרדיוס ל- 10.00 מיקרון, לחץ על בחר ותחת עריכה, הקש Shift באמצעות לחצן העכבר השמאלי כדי לסמן בנפרד כל תא פלואורסצנטי באמצעות נקודה. המספר הכולל של תאים שנספרו יוצג בסטטיסטיקה. ללכידת תמונה, השתמש בכלי תצלום בזק או השתמש בכלי ההנפשה ללכידת וידאו.
העשרת תאים מבוססי Microbead ותיוג פלואורסצנטיות לאחר מכן כפי שהוכח בדרך כלל לגרום טוהר חיובי CD4 של לפחות 95%, תיוג מוצלח של תאים אלה כפי שנקבע על ידי ציטומטריית זרימה. ניקוי רקמות מבוסס cinnamate אתיל משיג רמה גבוהה של שקיפות איברים המציינת התאמת אינדקס שבירה מוצלחת. האות הפלואורסצנטי האוטומטי של רקמת הריאה מציע כלי מועיל לתמונה המבנה האנטומי של הריאה על ידי מיקרוסקופיה של יריעות אור אשר ניתן להציג כהקרנה בעוצמה ממוצעת או במצב פני השטח.
בהשוואה למיקרוסקופיה קונבנציונלית, מיקרוסקופיה של יריעות אור מציעה את היתרון של הדמיית איברים שלמה ושחזור תלת מימדי לאחר מכן המאפשר זיהוי והדמיה של תאי T אנושיים בעלי תווית של התפשטות, המועברים בהקשר של האיבר כולו, יתר על כן, ההעדפה של תאי T אנושיים שהועברו להצטברות סלקטיבית בתוך רקמת הריאה מודלקת של בעלי חיים חשופי פפאין נתמכת עוד יותר על ידי העובדה כי תאי T חיוביים CD4 אנושיים לא ניתן לאחזר מרירית המעי של בעלי החיים. עבור כימות והשוואה של הצטברות ריאתי של תאי T חיוביים CD4 אנושי בין תנאים שונים, התאים המסווים ניתן לספור גם במספר קוביות ריאות של נפח מוגדר כפי שהוכח. הכנת רקמות זהירות כולל חליטת ריאות, אינפלציה וגיול רקמות חשובה מאוד עבור דור ממוטב של תמונות מיקרוסקופיות של יריעות אור ברזולוציה גבוהה.
כדי לאשר עוד יותר את diapedesis מוצלח של לימפוציטים אנושיים שהועברו, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות משולב עם כימות ציטומטרי זרימה של לימפוציטים אנושיים בתוך מליאת ברונכואלוולאר מורין. היכולת לנטר תאים חיסוניים הנגזרים מחולים בודדים בתנאי vivo תומכת בזיהוי שינויים תפקודיים בתאי החיסון המוטבעים על ידי מחלה או טיפול מסוימים.
