מחקר זה נתמך על ידי משרד האנרגיה של ארה&quot;ב (DE-FG02-09ER09-08 ו-de-PS02 09ER09-18), מרכז מקיף Jonsson הסרטן באוניברסיטת קליפורניה, והתכנית התעשייה האוניברסיטה שיתופית מחקר (UC דיסקברי גרנט, bio07 -10,665). אנו מודים לד&quot;ר Nagichettiar Satyamurthy צוותי במתקן ביו הציקלוטרון UCLA למתן ה-F-18 radioisotope ודיונים תובנות רבות. אנו מודים בני הזוג. מייקל קולינס, גרג לבלאן, יוסף למברט, ואת קלר Barnhardt מ CEM עבור ייעוץ טכני ותמיכתם. אנו מודים דירק וויליאמס, דרין וויליאמס, בני הזוג. יוסף דן הונג לין, ומיכאל ואן דאם עבור חלקים בעיצוב עיבוד כדי לשנות את הכור מיקרוגל CEM עבור מודולים טיהור SPE.

1. ההכנות ראשוניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> V-בקבוקון (5-מ&quot;ל) RV1 (עם ערבוב בר) משמש כלי התגובה העיקרי לביצוע סינתזה מיקרוגל. הוא מחובר למתאם הצצה עם שבעה כניסת / יציאות מתחבר לשקע והניח בתוך חלל המיקרוגל (ראה איור 2). RV2 מחובר SPE מיכל (אני) כדי לאסוף את גולמי [18 F] SFB. RV3 מחובר SPE מחסנית (II) לאיסוף הסופי [18 F] פתרון SFB. זה יכול להיות ממוקם בתוך אמבט מים חמים (40 מעלות צלזיוס) לרכז את הפתרון המתאים לפני ומשחזר ב PBS חיץ, במיוחד עבור radiolabeling במורד הזרם של ביומולקולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת לאיסוף גס [18 F] SFB: מלאו את MeCN / H 2 O [6 מ&quot;ל; 01:04 (v: v)] פתרון, AcOH מימית 5% (8 מ&quot;ל), MeCN (2 מ&quot;ל) עבור המאגר, B ו-C, בהתאמה. ואז להפעיל מחסנית SPE (אני) (קלקר, מרק LiCholut EN) עם אתנול (10 מ&quot;ל), ואחריו 5% כביסה מימית (10 מ&quot;ל) AcOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת לאיסוף מטוהרים [18 F] SFB: הכנת מאגר D ו-E התמלא 10 מ&quot;ל של H 2 O ו - 3 מ&quot;ל של האתר diethyl בהתאמה. השני SPE מחסנית (II) (קלקר, מרק LiCholut EN) מופעל על ידי הליך זהה שהוזכרו לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל (חיץ elution: MeCN / H 2 O, 01:01 (v / v) המכיל 0.2 TFA%; קצב זרימה: 3 mL / min) HPLC למיזוג מראש את העמודה HPLC [הפוכה שלב חצי הכנה עמודה (לונה, 5 מיקרומטר C18 (2) 100, 250 x 10 מ&quot;מ), Phenomenex, טורנס, קליפורניה, ארה&quot;ב]. </li></ol> 2. הכנת יבשים [כלומר הספק לא מוסף, (NCA)] פלואוריד [18 ו] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [18 F] פתרון הפלואוריד [18 O] H 2 O (100 μL) נוספה תערובת של Kryptofix 222 (20 מ&quot;ג), 1M K 2 CO מימית 3 (26 μL) ו MeCN (0.8 מ&quot;ל) ב Eppendorf הצינור. הפתרון כולו הוא מעורב אז גם לפני העברת RV1 באמצעות קו היניקה 1. [18 F] פתרון פלואוריד יכולה להיות מועברת גם דרך anionic החלפת מחסנית (למשל QMA אור ספטמבר-Pak מ ווטרס) ללכוד את פלואוריד-18 ואז eluted החוצה בתערובת של K 2 CO 3 ו Kryptofix ב MeCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את רצף ייבוש (20W, 3 דק &#39;) במסגרת תוכנית הבקרה מיקרוגל להסיר שאריות מים RV1 [תחת ואקום]. לאחר הקירור למטה כמו טמפרטורת המערכת היא מתחת ל -50 ° C, MeCN נוספים (1.0 מ&quot;ל) הוכנס הכור ואת רצף חוזר על עצמו פעם אחת. </li></ol> 3. סינתזה של אתיל 4 - [18 F] fluorobenzoate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון DMSO (0.4 מ&quot;ל) המכיל אתיל - 4 (N, N, N-trimethylammonium) triflate בנזואט (1.5 מ&quot;ג) נוספה לתוך RV1 דרך כניסת קו 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את רצף תיוג (50W, 1 דקות) במסגרת תוכנית מיקרוגל שליטה עם הקירור, ערבוב כלי וכל השסתומים סגורים להרשות אתיל 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). </li></ol> 4. סינתזה של 4 אשלגן - [18 F] fluorobenzoate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון DMSO (0.5 מ&quot;ל) המכילה KOtBu (13 מ&quot;ג) נוספה לתוך RV1 דרך קו היניקה 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע התוכנית Deprotect (40 W, 1 דקות) במסגרת תוכנית מיקרוגל שליטה עם הקירור, ערבוב כלי וכל השסתומים סגורים להרשות לעצמם את 4 - [18 F] fluorobenzoate מלח ([18 F] 3). </li></ol> 5. סינתזה של נפט גולמי [18 F] SFB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי פתרון אצטוניטריל (2.5 מ&quot;ל) המכילה TSTU (30 מ&quot;ג) נוספה RV1 דרך קו כניסת 6. TSTU הוא לחות ו הרגישים לאור. זה צריך להיות aliquoted לתוך בקבוקון קטן המאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס בכלי סגור מכוסה בנייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע רצף צימוד (30W, 2 דק &#39;) במסגרת התוכנית מיקרוגל שליטה עם הקירור, ערבוב כלי וכל השסתומים סגורים להרשות הגולמי [18 F] SFB. </li></ol> 6. הכנת SPE-מטוהרים [18 F] SFB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AcOH מימית 5% (1.0 מ&quot;ל) נוספה RV1 דרך כניסת קו 7 על מנת לנטרל את תערובת התגובה. הפתרון היה מועבר לתוך B בקבוקון המכיל 8 מ&quot;ל של מימית AcOH 5% (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את תערובת התגובה מדולל באמצעות מחסנית SPE (אני) כדי ללכוד גולמי [18 F] SFB באמצעות חנקן (10 psi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> WASH SPE מחסנית (אני) בתערובת של MeCN ו H 2 O [10 מ&quot;ל, 01:04 (v: v)] מן המאגר א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [18 F] SFB היה eluted אל RV2 באמצעות MeCN (2 מ&quot;ל) ממאגר ג </li></ol> 7. טיהור גולמי [18 F] SFB עם רדיו-HPLC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל או גס [18 F] SFB או SPE-מטוהרים [18 F] SFB עם H 2 O (2 מ&quot;ל) ב RV2 ולהעביר את התערובת לתוך הלולאה HPLC (5 מ&quot;ל). הפתרון היה מוזרק רדיו HPLC [MeCN / H 2 O, 01:01 (v / v) המכיל 0.2 TFA%; קצב זרימה: 3 mL / min]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את שבריר המכיל מטוהרים [18 F] SFB (החזקת timדואר: 8-10 דקות) לתוך בקבוקון D (לפני מלאות 10 מ&quot;ל של H 2 O) (איור 2). שלב קריטי: אם מבוצע כראוי, את עוצמת השבר שנאספו כאן צריך להיות 4-5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את תערובת התגובה מדולל באמצעות מחסנית SPE (II) כדי ללכוד מטוהרים [18 F] SFB באמצעות חנקן (10 psi). יבש את מחסנית עם זרם של חנקן במשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [18 F] SFB היה eluted אל RV3 באמצעות diethylether (3 מ&quot;ל) מתוך מאגר ה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הממס ב RV3 על יובש על ידי זרם עדין של גז חנקן (10 psi) באמצעות אמבט מים (40 ° C). מיובשים הסופי [18 F] SFB ניתן מחדש לתוך PBS חיץ עבור היישום במורד הזרם. </li></ol> 8. נציג תוצאות: פיתחנו פשוט, מהיר, חד סיר שיטה לסנתז [18 F] SFB באמצעות אסטרטגיה deprotection בתנאים נטול מים וחימום במיקרוגל במשך טרנספורמציה radiochemical / כימי אחד. איור 1 מציג את הפרטים של radiosynthesis שלנו. זהותו של המוצר הסופי אושרה על ידי השוואה של זמן השמירה HPLC עם הפניה SFB שאינם רדיואקטיביים. מטוהרים [18 F] SFB נותח גם דרך רדיו ו-TLC HPLC לקבוע radiochemical שלה וטוהר כימיים. RCY של [18 F] SFB היה 35 ± 5% בתוך 60 דקות לאחר טיהור HPLC (n&gt; 30), עם טוהר radiochemical גבוהה (&gt; 99%) וטוהר כימיים טוב (ראה עקבות UV בפרופיל HPLC, איור 3 ). פעילות ספציפית היה CA. 67-330 GBq / μmol (1.8-9.0 Ci / μmol), בהתאם רדיואקטיביות ההתחלה. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מיקרוגל בסיוע חד סיר radiosynthesis של [18 F] SFB. ראשית, radiofluorination של אתיל 4 - (N, N, N-trimethylammonium) triflate בנזואט (1) בוצעה תחת חימום במיקרוגל (50 W, 1 דקות) בנוכחות [K ⊃ 2.2.2] [18 נ] F - מורכבות dimethylsulfoxide (DMSO) להרשות לעצמם אתיל 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). ללא טיהור, פתרון DMSO של אשלגן טרט-butoxide (t BuOK) נוספה ואת כלי התגובה היה מיקרוגל מוקרן (40 W, 1 דקות) כדי להשלים את deprotection נטול מים. ההמרה הסופית של [18 F] 3 אל [18 F] SFB הושג באמצעות O-(N-succinimidyl) - N, N, N &#39;, נ&#39;, tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU) ההפעלה. TSTU ב אצטוניטריל נוספה התגובה התערובת המכילה את 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 3) מלח, זה צעד סינתטי האחרון הניב גולמי [18 F] SFB לאחר חימום (30 וואט, 2 דקות). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תרשים סכמטי של ההתקנה מיקרוגל בסיוע חד סיר [18 F] סינתזה SFB. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Radio-HPL chromatograms של סופי [18 F] SFB. למעלה: האות ב UV 254 nm; התחתונה: רדיואקטיבי האות; הבלעה: UV האות ב 254 ננומטר (x 33.3). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755table1.jpg" alt="טבלה 1" /> . טבלה 1 סיכום [18 F] radiosyntheses SFB דווח בספרות באמצעות אלקיל 4 - (trimethylammonium) triflate בנזואט כמו קודמיו.

שיטה זו הוגשה בקשה לפטנט עבור ארה&quot;ב.

זה פשוט בן שלושה שלבים, אחד סיר radiosynthesis של ריאגנט ה-F-18 acylation [18 F] SFB היא פותחה על בסיס כימיה אי - מימית. תהליך זה reproducibility מעולה יכול לשמש אמין לייצור [18 F] SFB במודולים radiochemistry אוטומטיות, בשל שני שינויים מרכזיים כמתואר הבאים: 1. אנו מעסיקים צעד deprotection / סבון ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> חומצה אצטית בתמיסה מימית (5%, v / v) </td><td> דיג </td><td> A38-500 </td><td> הוכן במעבדה שלנו </td></tr><tr><td> אצטוניטריל </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 75-05-8 </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl האתר </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 14775 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfoxide דימתיל (DMSO) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 472301 </td><td></td></tr><tr><td> אתיל 4 - (N, N, N-trimethylammonium) בנזואט triflate </td><td> הוכן במעבדה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1 ,10-diazabicyclo [8.8.8] hexacosane (K222) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 29,111-0 </td><td></td></tr><tr><td> O - (N-succinimidyl) - N, N, N &#39;, נ&#39;, tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 105832-38-0 </td><td></td></tr><tr><td> אשלגן פחמתי בתמיסה מימית (1M) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 209619 </td><td> הוכן במעבדה שלנו </td></tr><tr><td> אשלגן טרט-butoxide </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 156671 </td><td></td></tr></tbody></table>

microwave-assisted one-pot synthesis of n-succinimidyl-4-[18f]fluorobenzoate ([18f]sfb)

ביומולקולות, כולל פפטידים, חלבונים 1-9, 10,11 ונוגדנים ושברי מהונדסים שלהם, 12-14 צוברים חשיבות כמו גם הרפוי פוטנציאליים וסוכני הדמיה מולקולרית. יש לציין, כאשר תווית עם פוזיטרונים פולטות רדיואיזוטופים (למשל, CU-64, GA-68 או F-18), הם יכולים לשמש בדיקות הדמיה ממוקד של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. 15-18 לפיכך, מאמץ משמעותי מוקדש סינתזה וחקירה של ה-F-18 שכותרתו ביומולקולות. אמנם יש דוגמאות אלגנטי של ה-F-18 ישירה תיוג של פפטידים, 19-22 התנאים תגובה חריפה (כלומר, אורגני pH ממס, קיצוניות, טמפרטורה גבוהה) הקשורים radiofluorination ישירה הן בדרך כלל בקנה אחד עם דגימות חלבון שביר. עד כה, ולכן, שילוב של קבוצות תותבת radiolabeled לתוך ביומולקולות נשארת השיטה של בחירה. 23,24 N-Succinimidyl-4-[18 F] fluorobenzoate ([18 F] SFB), 25-37 מגיב בולטון האנטר מסוג זה מגיב עם קבוצות אמינו ראשונית של ביומולקולות, היא קבוצה מאוד תכליתי תותבת עבור תיוג F-18 של ספקטרום רחב של גורמים ביולוגיים, במונחים של יציבות vivo ו radiolabeling תשואה גבוהה מאליו שלה. לאחר תיוג עם [18 F] SFB, שהתקבל [18 F] ביומולקולות fluorobenzoylated יכול להיחקר כמו קליעים נותבים PET פוטנציאל במחקרים vivo הדמיה. רוב 1 [18 F] radiosyntheses SFB המתואר הספרות הנוכחי דורשים שניים או אפילו שלושה כורים ו purifications מרובים באמצעות מיצוי שלב או מוצק (SPE) או בעלי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC). תהליכים ממושכים כאלה סל הייצור השוטפת ויישומים נרחב radiolabeling של ביומולקולות. למרות כמה מודול בסיוע [18 F] סינתזות SFB דווחו, 29-32, 41-42 הם מתבססים בעיקר על נהלים מסובך וארוך באמצעות יקר, זמין מסחרית תיבות radiochemistry (טבלה 1). לכן, פישוט נוסף של radiosynthesis של [18 F] SFB באמצעות התקנה בעלות נמוכה יהיה מועיל מאוד עבור adaption שלה לתהליך אוטומטי. בזאת, אנו מדווחים הכנה תמציתית של [18 F] SFB, המבוססת על סינתזה פשוטה במיקרוגל בסיוע חד סיר (איור 1). הגישה שלנו אינה דורשת טיהור בין השלבים או כל ריאגנטים מימית. בנוסף, קרינה מיקרוגל, אשר שימש את סינתזות של קליעים נותבים PET כמה, 38-41 יכול נותן RCYs סלקטיביות גבוהה יותר מאשר התגובות תרמי המתאים או שהם מספקים תשואות דומות זמני תגובה קצרים יותר. 38 והכי חשוב, כאשר תיוג ביומולקולות , הזמן הציל יכול להיות מופנות bioconjugation הבאים או צעד הדמיה PET 28,43 החידוש שלנו השתפר [18 F] סינתזה SFB היא כפולה: (1). האסטרטגיה deprotection anhydrous לא דורש טיהור ביניים (ים) בין כל צעד ו (2) המיקרוגל בעזרת טרנספורמציות radiochemical מאפשרים ייצור מהיר, אמין [18 F] SFB.

Watch this Scientific Journal Video about Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB at JoVE.com

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

קליל, אחד בסיר סינתזה של N-succinimidyl-4-[<sup&gt; 18</sup&gt; F] fluorobenzoate ([<sup&gt; 18</sup&gt; F] SFB) פותחה על בסיס תהליך בלתי מימית שלושה שלבים, radiochemical. באמצעות חימום במיקרוגל, ההליך כולו יכול להסתיים תוך פחות מ 30 דקות או 60 דקות עם טיהור נוספת על ידי preparative HPLC. ריקבון, תיקן התשואות radiochemical (RCYs) היו 35-5% (n&gt; 30).

מיקרוגל בעזרת סינתזה אחת סיר N-Succinimidyl-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

microwave-assisted-one-pot-synthesis-n-succinimidyl-4

Research

JoVE Journal

Biology

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

12.9K Views.  University of California at Los Angeles. קליל, אחד בסיר סינתזה של N-succinimidyl-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB) פותחה על בסיס תהליך בלתי מימית שלושה שלבים, radiochemical. באמצעות חימום במיקרוגל, ההליך כולו יכול להסתיים תוך פחות מ 30 דקות או 60 דקות עם טיהור נוספת על ידי preparative HPLC. ריקבון, תיקן התשואות radiochemical (RCYs...

Video: Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

אופטימיזציה של התגובה אוגי באמצעות סינתזה במקביל וטיפול נוזלי אוטומטי

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

סינתזה כיול nanoprobes זרחני עבור הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

סינתזה של<em&gt; ב-vivo</em&gt;-MRI לגילוי אפופטוזיס בדיקה

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

סינתזה שלב מוצק של פפטיד Bis פונקציונליות שימוש &quot;בטיחות תפוס&quot; מתודולוגיה

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

הערכה של דה נובו חלבון סינתזה שיעורי Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...