Questo studio è stato finanziato dal Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti (DE-FG02-09ER09-08 e DE-PS02-09ER09-18), la Jonsson Comprehensive Cancer Center presso la UCLA, e l&#39;Industria-Università programma di ricerca cooperativa (UC Discovery Grant, bio07 -10.665). Ringraziamo il Dott. Nagichettiar Satyamurthy e personale presso l&#39;impianto di UCLA Biomedical Ciclotrone per la fornitura del F-18 radioisotopi e discussioni penetranti molti. Ringraziamo Drs. Michael Collins, Greg Leblanc, Joseph Lambert, e Keller Barnhardt dal CEM per i loro consigli e supporto tecnico. Ringraziamo Dirk Williams, Darin Williams, Drs. Joseph Lin Hong Dun, e Michael van Dam per le parti progettazione e lavorazione di modificare il reattore a microonde CEM e per i moduli di purificazione SPE.

1. Preparativi iniziali <ol><li> Un V-flacone (5 mL) RV1 (con agitazione bar) viene utilizzato come recipiente di reazione principale per l&#39;esecuzione di sintesi a microonde. E &#39;collegato ad un adattatore PEEK con sette entrata / uscita porte collega e collocato all&#39;interno della cavità a microonde (vedi Figura 2). RV2 è collegata a cartuccia SPE (I) per raccogliere il greggio [18 F] SFB. RV3 è collegata a cartuccia SPE (II) per la raccolta finale [18 F] soluzione SFB. Può essere collocato in un bagno d&#39;acqua calda (40 ° C) per concentrare la soluzione corrispondente prima di ricostituire in tampone PBS, soprattutto per la radiomarcatura a valle di biomolecole. </li><li> Setup per la raccolta di greggio [18 F] SFB: Riempire MECN / H 2 O [6 ml; 1:4 (v: v)] soluzione acquosa al 5% AcOH (8 ml), MECN (2 ml) per serbatoio A, B e C, rispettivamente. Poi attivare una cartuccia SPE (I) (polistirolo, Merck LiCholut EN) con etanolo (10 mL), seguita da AcOH acquosa al 5% (10 ml) di lavaggio. </li><li> Setup per la raccolta purificata [18 F] SFB: Preparare serbatoio D ed E riempito con 10 ml di H 2 O e 3 ml di etere etilico, rispettivamente. La seconda cartuccia SPE (II) (polistirolo, Merck LiCholut EN) viene attivata la stessa procedura di cui sopra. </li><li> Avviare l&#39;(tampone di eluizione: MECN / H 2 O, 1:1 (v / v) contenente 0,2% TFA; portata: 3 ml / min) HPLC per la pre-condizionamento della colonna HPLC [a fase inversa semi-prep colonna (Luna, 5 micron C18 (2) 100 A, 250 x 10 mm), Phenomenex, Torrance, CA, USA]. </li></ol> 2. Preparazione di essiccati [cioè non-vettore aggiunto, (NCA)] [18 F] fluoro <ol><li> [18 F] fluoro soluzione in [18 O] H 2 O (100 mL) è stato aggiunto ad una miscela di Kryptofix 222 (20 mg), 1M acquosa K 2 CO 3 (26 mL) e MECN (0,8 ml) in una Eppendorf tubo. L&#39;intera soluzione è poi mescolato bene prima del trasferimento al RV1 tramite la linea di ingresso 1. La [18 F] fluoro soluzione può anche essere passato attraverso uno scambio anionico cartuccia (ad es QMA-luce Sep-Pak da Waters) per intrappolare il fluoro-18 e poi eluita con una miscela di K 2 CO 3 e Kryptofix in MECN. </li><li> Eseguire la sequenza di essiccazione (20W, 3 min) nell&#39;ambito del programma di controllo a microonde per eliminare l&#39;acqua residua nel RV1 [sotto vuoto]. Dopo il raffreddamento la temperatura del sistema è inferiore a 50 ° C, ulteriori MECN (1,0 ml) è stato introdotto nel reattore e la sequenza viene ripetuta una volta. </li></ol> 3. Sintesi di etile 4 - [18 F] fluorobenzoate <ol><li> Ad una soluzione di DMSO (0,4 ml) contenente etilico 4 - (N, N, N-trimetilammonio) benzoato triflate (1,5 mg) è stato aggiunto in RV1 tramite linea di ingresso 2. </li><li> Eseguire la sequenza di etichettatura (50W, 1 min) nell&#39;ambito del programma di controllo a microonde con agitazione, raffreddamento nave e tutte le valvole chiuse per permettersi di etile 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). </li></ol> 4. Sintesi di potassio 4 - [18 F] fluorobenzoate <ol><li> Ad una soluzione di DMSO (0,5 ml) contenente KOtBu (13 mg) è stato aggiunto in RV1 tramite linea di aspirazione 3. </li><li> Eseguire il programma Deprotect (40 W, 1 min) nell&#39;ambito del programma di controllo a microonde con agitazione, raffreddamento nave e tutte le valvole chiuse per permettere il 4 - [18 F] fluorobenzoate sale ([18 F] 3). </li></ol> 5. Sintesi di greggio [18 F] SFB <ol><li> Per una soluzione acetonitrile (2,5 ml) contenente TSTU (30 mg) è stato aggiunto al RV1 tramite la linea di aspirazione 6. TSTU è all&#39;umidità e sensibile alla luce. Dovrebbe essere aliquotati nella fiala piccole e conservato a 4 ° C in un contenitore chiuso coperta da un foglio di alluminio. </li><li> Eseguire la sequenza di accoppiamento (30W, 2 min) nell&#39;ambito del programma di controllo a microonde con agitazione, raffreddamento nave e tutte le valvole chiuse per permettere il greggio [18 F] SFB. </li></ol> 6. La Preparazione di SPE-purificata [18 F] SFB <ol><li> AcOH acquosa al 5% (1,0 ml) è stato aggiunto al RV1 tramite linea in ingresso da 7 a neutralizzare la miscela di reazione. La soluzione è stata poi trasferita in B fiala contenente 8 ml di soluzione acquosa AcOH 5% (Figura 2). </li><li> Passare la miscela diluita di reazione attraverso la cartuccia SPE (I) per intrappolare greggio [18 F] azoto SFB con (10 psi). </li><li> LAVAGGIO cartuccia SPE (I) con un misto di MECN e H 2 O [10 ml, 1:4 (v: v)] dal serbatoio A. </li><li> [18 F] SFB è stata eluita fuori in RV2 utilizzando MECN (2 ml) da serbatoio C. </li></ol> 7. Purificazione del greggio [18 F] SFB con Radio-HPLC <ol><li> Diluire sia greggio [18 F] SFB o SPE-purificata [18 F] SFB con H 2 O (2 ml) in RV2 e trasferire il composto nel circuito HPLC (5 ml). La soluzione è stata iniettata la radio-HPLC [MECN / H 2 O, 1:1 (v / v) contenente 0,2% TFA; portata: 3 ml / min]. </li><li> Raccogliere la frazione purificata contenente [18 F] SFB (ritenzione di time: 8-10 minuti) nel flaconcino D (pre-riempite con 10 ml di H 2 O) (Figura 2). Passo fondamentale: se eseguita correttamente, il volume frazione raccolta qui dovrebbe essere ml 4-5. </li><li> Passare la miscela diluita di reazione attraverso la cartuccia SPE (II) per intrappolare purificata [18 F] azoto SFB con (10 psi). Asciugare la cartuccia con un flusso di azoto per 2-3 minuti. </li><li> [18 F] SFB è stata eluita fuori in RV3 con etere etilico (3 ml) dal serbatoio E.. </li><li> Evapora il solvente in RV3 a secco con una leggera corrente di azoto (10 psi) con un bagno d&#39;acqua (40 ° C). La secca finale [18 F] SFB può essere ricostituito in tampone PBS per l&#39;applicazione a valle. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Abbiamo sviluppato una versione semplificata, rapida, one-pot metodo per la sintesi di [18 F] SFB utilizzando una strategia di deprotezione in condizioni anidro e riscaldamento a microonde durante ogni radiochimica / trasformazione chimica. La figura 1 illustra i dettagli del nostro radiosynthesis. L&#39;identità del prodotto finale è stato confermato dal confronto dei tempi di ritenzione HPLC con un non-radioattivo riferimento SFB. Il purificato [18 F] SFB è stato analizzato anche attraverso la radio-TLC e-HPLC per determinare la sua purezza radiochimica e chimica. Il RCY di [18 F] SFB è stata del 35 ± 5% entro 60 minuti dopo la purificazione HPLC (n&gt; 30), con elevata purezza radiochimica (&gt; 99%) e purezza chimica buona (vedi la traccia UV nel profilo HPLC, figura 3 ). L&#39;attività specifica è stata ca. 67-330 GBq / mmol (1,8-9,0 Ci / mmol), a seconda della radioattività di partenza. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Micro-onde one-pot radiosynthesis di [18 F] SFB. In primo luogo, la radiofluorination di etile 4 - (N, N, N-trimetilammonio) benzoato triflate (1) è stata eseguita sotto riscaldamento a microonde (50 W, 1 min) in presenza di [K ⊃ 2.2.2] [18 F] F - complessi in dimetilsolfossido (DMSO) di permettersi di etile 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). Senza purificazione, una soluzione di DMSO di potassio terz-butossido (t BuOK) è stato aggiunto e la nave reazione è stata microonde irradiato (40 W, 1 min) per completare la deprotezione anidro. La conversione finale di [18 F] 3 in [18 F] SFB è stato realizzato utilizzando O-(N-succinimidile) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU) di attivazione. TSTU in acetonitrile è stato aggiunto alla miscela di reazione contenente il 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 3) sale, questo ultimo passo sintetico prodotto greggio [18 F] SFB dopo il riscaldamento (30 W, 2 min). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Lo schema di impostazione per micro-onde one-pot [18 F] sintesi SFB. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Radio-HPL cromatogrammi di finale [18 F] SFB. Top: segnale UV a 254 nm; in basso: il segnale radioattivo; inset: segnale UV a 254 nm (x 33,3). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755table1.jpg" alt="Tabella 1" /> . Tabella 1 Riassunto di [18 F] radiosyntheses SFB riportati in letteratura con alchil 4 - (trimetilammonio) triflate benzoato come precursori.

Questo metodo è stato presentato per la richiesta di brevetto negli Stati Uniti.

Questo semplificata in tre fasi, one-pot radiosynthesis degli F-18 acilazione reagente [18 F] SFB è sviluppato sulla base non acquosa chimica. Questo processo è eccellente riproducibilità e potrebbe essere utilizzato in modo affidabile per la produzione di [18 F] SFB in moduli radiochimica automatizzati, a causa di due modifiche principali descritto come seguenti: 1. Ci avvaliamo di uno deprotezione / saponificazione passo nella anidro KOtBu / DMSO sistema per sostituire le comuni sol...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> acido acetico in soluzione acquosa (5%, v / v) </td><td> Pescatore </td><td> A38-500 </td><td> Preparato nel nostro laboratorio </td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 75-05-8 </td><td></td></tr><tr><td> Etere etilico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 14775 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 472301 </td><td></td></tr><tr><td> Etilico 4 - (N, N, N-trimetilammonio) benzoato triflate </td><td> Preparati in laboratorio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1 ,10-diazabiciclo [8.8.8] hexacosane (K222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 29,111-0 </td><td></td></tr><tr><td> O - (N-succinimidile) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 105832-38-0 </td><td></td></tr><tr><td> Carbonato di potassio in soluzione acquosa (1M) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 209619 </td><td> Preparato nel nostro laboratorio </td></tr><tr><td> Potassio tert-butossido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 156671 </td><td></td></tr></tbody></table>

microwave-assisted one-pot synthesis of n-succinimidyl-4-[18f]fluorobenzoate ([18f]sfb)

Biomolecole, tra cui i peptidi, 1-9 proteine, 10,11 e anticorpi ingegnerizzati e loro frammenti, 12-14 stanno guadagnando importanza sia come potenziali terapie e gli agenti di imaging molecolare. In particolare, se marcato con radioisotopi che emettono positroni (ad esempio, Cu-64, Ga-68, o F-18), possono essere usati come sonde per l&#39;imaging mirato di molti processi fisiologici e patologici. 15-18 Pertanto, gli sforzi significativi dedicata alla sintesi e l&#39;esplorazione di 18 F-etichettati biomolecole. Anche se ci sono esempi elegante della diretta 18 F-etichettatura dei peptidi, 19-22 le dure condizioni di reazione (per esempio, solventi organici, pH estremi, alta temperatura) associato radiofluorination diretta di solito sono incompatibili con campioni di proteine ​​fragile. Ad oggi, quindi, la costituzione di gruppi prostetici radiomarcato in biomolecole rimane il metodo di scelta. 23,24 N-succinimidile-4-[18 F] fluorobenzoate ([18 F] SFB), 25-37 uno Bolton-Hunter di tipo reattivo che reagisce con i gruppi amminici primari di biomolecole, è un gruppo molto versatile protesi per i 18 F-etichettatura di un ampio spettro di entità biologiche, in termini di evidente stabilità in vivo e la resa radiomarcatura alto. Dopo l&#39;etichettatura con [18 F] SFB, il risultante [18 F] biomolecole fluorobenzoylated potrebbero essere esplorate come traccianti PET potenziale per gli studi di imaging in vivo. La maggior parte 1 [18 F] radiosyntheses SFB descritte nella letteratura corrente richiedono due o anche tre reattori e purificazioni multipli utilizzando estrazione in fase solida (SPE) o ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC). Tali processi lunghi ostacolano la produzione di routine e applicazioni diffuse in radiomarcatura di biomolecole. Anche se diversi moduli assistita [18 F] sintesi SFB sono stati segnalati, 29-32, 41-42 sono principalmente basati su procedure complicate e lunghe utilizzando costose reperibili in commercio scatole di radiochimica (Tabella 1). Pertanto, un&#39;ulteriore semplificazione del radiosynthesis di [18 F] SFB con un basso costo di setup sarebbe molto utile per il suo adattamento a un processo automatizzato. Qui, riportiamo una preparazione sintetica di [18 F] SFB, basato su un semplice one-pot di micro-onde sintesi (Figura 1). Il nostro approccio non richiede purificazione tra i passaggi o reagenti acquosi. Inoltre, l&#39;irradiazione a microonde, che è stato utilizzato nella sintesi di traccianti PET diversi, 38-41 può RCYs dà maggiore e migliore selettività rispetto al corrispondente reazioni termiche o offrono rendimenti simili a tempi di reazione più brevi. 38 più importante, per l&#39;etichettatura biomolecole , il tempo risparmiato può essere deviato verso bioconjugation successive o passo imaging PET 28,43 La novità della nostra migliore [18 F] sintesi SFB è duplice: (1). strategia deprotezione anidro non richiede purificazione di intermedi (s) tra ogni passo e (2) trasformazioni radiochimica il micro-onde consentire la rapida e affidabile di produzione [18 F] SFB.

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Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

Una facile, one-pot sintesi di N-succinimidile-4-[<sup&gt; 18</sup&gt; F] fluorobenzoate ([<sup&gt; 18</sup&gt; F] SFB) è stato sviluppato sulla base di una non acquosa, in tre fasi radiochimica. Utilizzando riscaldamento a microonde, l&#39;intera procedura può essere completata in meno di 30 minuti o 60 minuti con ulteriore purificazione per HPLC preparativa. Il decadimento-rendimenti corretti radiochimica (RCYs) sono stati 35-5% (n&gt; 30).

Di micro-onde one-pot di Sintesi N-Succinimidile-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

microwave-assisted-one-pot-synthesis-n-succinimidyl-4

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Biology

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

12.9K Views.  University of California at Los Angeles. Una facile, one-pot sintesi di N-succinimidile-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB) è stato sviluppato sulla base di una non acquosa, in tre fasi radiochimica. Utilizzando riscaldamento a microonde, l'intera procedura può essere completata in meno di 30 minuti o 60 minuti con ulteriore purificazione per HPLC preparativa. Il decadimento-rendimenti corretti radiochimica (RCYs) sono stati 35-5% (n> 30).

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Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Ottimizzazione della reazione Ugi Con Sintesi parallela e automatica Gestione liquidi

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

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Biologia

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici

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Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

Sintesi di uno<em&gt; In vivo</em&gt; RM-rilevabile Apoptosis Probe

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Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Sintesi in fase solida di un funzionalizzato Bis-Peptide Uso di &quot;Sicura del fucile&quot; Metodologia

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Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

In vitro Sintesi di mRNA modificata per l&#39;induzione di espressione della proteina nelle cellule umane

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Sintesi della lunghezza d&#39;onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

Valutazione dei tassi di sintesi proteica de novo in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...