وأيد هذه الدراسة من قبل وزارة الطاقة الأميركية (DE - FG02 - 08 - 09ER09 وDE - PS02 - 09ER09 18) ، ومركز جونسون الشامل للسرطان في جامعة كاليفورنيا ، والبرنامج التعاوني لأبحاث الصناعة الجامعة (جامعة كاليفورنيا اكتشاف المنحة ، bio07 -10665). نشكر الدكتور Nagichettiar Satyamurthy والعاملين في مرفق UCLA السيكلوترون الطبية لتوفير النظائر المشعة F - 18 والعديد من المناقشات الثاقبة. نشكر الدكاترة. مايكل كولينز ، غريغ لوبلان ، لامبرت يوسف ، وكيلر Barnhardt من CEM للحصول على المشورة الفنية والدعم. نشكر ديرك ويليامز ، ودارين ويليامز ، د. جوزيف دان هونغ لين ، ومايكل فان دام لقطع تصميم وتصنيع لتعديل مفاعل الميكروويف CEM وحدات لتنقية SPE.

1. التحضيرات الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استخدام V - فيال (5 مل) RV1 (مع التحريك بار) كما وعاء التفاعل الرئيسي لأداء توليف الميكروويف. توصيله إلى محول PEEK مع منافذ مدخل / مخرج seven يربط وضعت داخل تجويف الميكروويف (انظر الشكل 2). يرتبط RV2 لخرطوشة SPE (I) لجمع الخام [18 F] SFB. يرتبط RV3 لخرطوشة SPE (الثاني) لجمع النهائي [18 F] حل SFB. يمكن وضعه في حمام ماء دافئ (40 درجة مئوية) للتركيز على حل المطابق قبل إعادة تشكيل العازلة في برنامج تلفزيوني ، وبخاصة لradiolabeling المصب من الجزيئات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإعداد لجمع الخام [18 F] SFB : املأ MeCN / H 2 O [6 مل ؛ 01:04 (ت : ت)] حل ، AcOH مائي 5 ٪ (8 مل) ، MeCN (2 مل) للخزان ، باء وجيم ، على التوالي. ثم تنشيط خرطوشة SPE (I) (البوليسترين ، ميرك LiCholut EN) مع الايثانول (10 مل) ، تليها 5 ٪ مائي الغسيل (10 مل) AcOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإعداد لجمع المنقى [18 F] SFB : تحضير خزان D و E تمتلئ 10 مل من H 2 O و 3 مل من الأثير ثنائي اثيل على التوالي. تنشيط الثانية SPE خرطوشة (II) (البوليسترين ، ميرك LiCholut EN) من قبل نفس الإجراء المذكورة أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء (شطف العازلة : MeCN / H 2 O ، 1:1 (V / V) التي تحتوي على 0،2 ٪ TFA ؛ معدل التدفق : 3 مل / دقيقة) HPLC لتكييف قبل العمود HPLC [عكس المرحلة الإعدادية شبه العمود (لونا ، 5 ميكرون C18 (2) 100 ، 250 × 10 ملم) ، Phenomenex ، تورانس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية]. </li></ol> 2. إعداد المجففة [أي غير الناقل المضافة ، (NCA)] [18 F] الفلوريد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [18 F] تم إضافة الفلوريد في حل [18 O] O 2 H (100 ميكرولتر) إلى خليط من Kryptofix 222 (20 ملغ) ، 1M مائي K 2 CO 3 (26 ميكرولتر) وMeCN (0.8 مل) في إيبندورف الأنبوب. ثم يتم خلط الحل كله جيدا قبل ان ينتقل الى RV1 عبر خط مدخل 1. و[18 F] يمكن حل فلوريد مرت أيضا من خلال تبادل خرطوشة أنيوني (مثل QMA الضوء سبتمبر الباكستانية من مياه) لاعتراض فلوريد - 18 ثم eluted الخروج مع خليط من K 2 CO 3 وKryptofix في MeCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ تسلسل التجفيف (20W ، 3 دقائق) في إطار برنامج مكافحة الميكروويف لإزالة المياه المتبقية في RV1 [تحت فراغ]. بعد تبريد درجة الحرارة أقل من 50 نظام وقدم درجة مئوية ، MeCN إضافية (1.0 مل) في المفاعل ويتم تكرار تسلسل مرة واحدة. </li></ol> 3. توليف إيثيل 4 -- [18 F] fluorobenzoate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى حل DMSO (0.4 مل) تحتوي على إيثيل 4 -- (N ، ​​N ، N - trimethylammonium) بنزوات triflate (1.5 ملغ) وأضيف إلى RV1 عبر خط مدخل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ تسلسل وصفها (50W ، 1 دقيقة) في إطار برنامج مكافحة ميكروويف مع التحريك تبريد السفينة ، والصمامات جميع الأسئلة المغلقة على تحمل إيثيل 4 -- [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). </li></ol> 4. توليف 4 البوتاسيوم -- [18 F] fluorobenzoate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى حل DMSO (0.5 مل) تحتوي على KOtBu (13 ملغ) وأضيف إلى RV1 عبر خط مدخل 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ برنامج Deprotect (40 W ، 1 دقيقة) في إطار برنامج مكافحة ميكروويف مع التحريك تبريد السفينة ، والصمامات جميع الأسئلة المغلقة على تحمل 4 -- [18 F] fluorobenzoate الملح ([18 F] 3). </li></ol> 5. توليف الخام [18 F] SFB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى حل أسيتونتريل (2.5 مل) تحتوي على TSTU (30 ملغ) وأضيف إلى RV1 عبر خط مدخل 6. TSTU هو الرطوبة والضوء الحساسة. وينبغي أن aliquoted في قارورة صغيرة وتخزينها في 4 درجات مئوية في حاوية مغلقة تغطيها رقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل تنفيذ توصيلات (30W ، 2 دقيقة) في إطار برنامج مكافحة ميكروويف مع التحريك تبريد السفينة ، والصمامات جميع الأسئلة المغلقة على تحمل الخام [18 F] SFB. </li></ol> 6. التحضير للجمعية مهندسي البترول ، المنقى [18 F] SFB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأضاف AcOH مائي 5 ٪ (1.0 مل) إلى RV1 عبر خط مدخل 7 إلى تحييد خليط التفاعل. ثم نقل الى حل باء قارورة تحتوي على 8 مل من AcOH مائي 5 ٪ (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير خليط التفاعل المخفف من خلال خرطوشة SPE (I) إلى اعتراض الخام [18 F] SFB باستخدام النيتروجين (10 رطل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> WASH SPE خرطوشة (أنا) مع خليط من MeCN و H 2 O [10 مل ، 01:04 (ت : ت)] من ألف خزان </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [18 F] كان eluted SFB للخروج الى RV2 MeCN به (2 مل) من الخزان C. </li></ol> 7. تنقية الخام [18 F] SFB مع راديو - HPLC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما تمييع الخام [18 F] SFB أو المنقى ، SPE [18 F] SFB مع H 2 O (2 مل) في RV2 ونقل الخليط في حلقة HPLC (5 مل). تم حقن الحل في الراديو HPLC [O 2 MeCN / H ، 1:1 (V / V) التي تحتوي على 0،2 ٪ TFA ؛ معدل التدفق : 3 مل / دقيقة]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الكسر التي تحتوي على تنقية [18 F] SFB (احتباس تيمه : 8-10 دقائق) في مد فيال (قبل مملوءة ب 10 مل من H 2 O) (الشكل 2). خطوة حاسمة : إذا أجريت بشكل صحيح ، وحجم جزء جمعت هنا ينبغي مل 4-5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير خليط التفاعل المخفف من خلال خرطوشة SPE (II) إلى اعتراض المنقى [18 F] SFB باستخدام النيتروجين (10 رطل). تجفيف خرطوشة مع دفق من النيتروجين لمدة 2-3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [18 F] كان eluted SFB للخروج الى RV3 باستخدام diethylether (3 مل) من E. الخزان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتبخر المذيب في RV3 للجفاف من قبل تيار رقيقة من غاز النيتروجين (10 رطل) باستخدام حمام مائي (40 درجة مئوية). والمجففة النهائي [18 F] يمكن أن يعاد تشكيل SFB العازلة في برنامج تلفزيوني لتطبيق المصب. </li></ol> 8. ممثل النتائج : طورنا مبسطة وسريعة ، وعاء واحد ، طريقة لتجميع [18 F] SFB باستخدام استراتيجية deprotection في ظل ظروف اللامائية الميكروويف والتدفئة خلال كل تحول الإشعاعية / الكيميائية. الشكل 1 يعرض تفاصيل radiosynthesis لدينا. وتم تأكيد هوية المنتج النهائي مقارنة مع الوقت الاحتفاظ HPLC مرجع SFB غير المشعة. والمنقى [18 F] وقد تم أيضا تحليل SFB من خلال الراديو وTLC - HPLC لتحديد الإشعاعية والكيميائية نقاء. والحروف الأولى من الأسماء من [18 F] كان SFB 35 ± 5 ٪ في غضون 60 دقيقة بعد تنقية HPLC (ن&gt; 30) ، مع نقاء عالية الإشعاعية (&gt; 99 ٪) وحسن نقاء الكيميائية (راجع تتبع الأشعة فوق البنفسجية في ملف HPLC ، الشكل (3) ). كان نشاط معين كاليفورنيا. 67-330 جيغا بكريل / μmol (1،8-9،0 تسى / μmol) ، اعتمادا على النشاط الإشعاعي البداية. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. ميكروويف بمساعدة واحدة من وعاء radiosynthesis [18 F] SFB. أولا ، من radiofluorination إيثيل 4 -- تم تنفيذ (N ، ​​N ، N - trimethylammonium) بنزوات triflate (1) تحت التدفئة الميكروويف (50 W ، 1 دقيقة) في وجود [K ⊃ 2.2.2] [18 F] F -- المعقدة في dimethylsulfoxide (DMSO) على تحمل إيثيل 4 -- [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). من دون تنقية ، وأضيف إلى حل DMSO من البوتاسيوم رابع بوتاكسيد (ر BuOK) وعاء التفاعل والميكروويف المشع (40 W ، 1 دقيقة) لإكمال deprotection اللامائية. التحويل النهائي [18 F] (3) في [18 F] تم تحقيقه باستخدام SFB O - (N - succinimidyl) -- N ، N ، N &#39;، N&#39; - tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU) التنشيط. وأضاف في TSTU أسيتونتريل إلى خليط التفاعل التي تحتوي على 4 -- [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 3) الملح ، وهذا الخطوة الأخيرة الاصطناعية حقق الخام [18 F] SFB بعد التسخين (30 ث ، 2 دقيقة). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الرسم التخطيطي للإعداد للبمساعدة الميكروويف وعاء واحد [18 F] SFB التوليف. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. راديو وHPL chromatograms النهائي [18 F] SFB. العلوي : إشارة الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر ؛ القاع : إشارة المشعة ؛ أقحم : الأشعة فوق البنفسجية في اشارة 254 نانومتر (س 33.3). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755table1.jpg" alt="الجدول 1" /> . الجدول 1 موجز [18 F] radiosyntheses SFB ذكرت في الأدبيات به الكيل 4 -- (trimethylammonium) triflate بنزوات والسلائف.

وقد قدم هذا الأسلوب لطلب البراءة في الولايات المتحدة.

هذه ثلاث خطوات مبسطة ، وعاء واحد من كاشف radiosynthesis F - 18 أسيلة [18 F] تم تطويرها استنادا SFB غير مائي الكيمياء. هذه العملية قد استنساخ ممتازة ويمكن استخدامها بشكل موثوق لإنتاج [18 F] SFB في وحدات الكيمياء الإشعاعية الآلي ، نظرا لاثنين من التعديلات الرئيسية على ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> حمض الخليك في محلول مائي (5 ٪ V / V) </td><td> الصياد </td><td> A38 - 500 </td><td> أعد في مختبرنا </td></tr><tr><td> أسيتونتريل </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 75-05-8 </td><td></td></tr><tr><td> إثيل الأثير </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 14775 </td><td></td></tr><tr><td> ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 472301 </td><td></td></tr><tr><td> إيثيل 4 -- (N ، ​​N ، N - trimethylammonium) بنزوات triflate </td><td> أعد في المختبر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4،7،13،16،21،24 Hexaoxa - 1 - ،10 - diazabicyclo [8.8.8] هيكساكوزان (K222) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 29،111-0 </td><td></td></tr><tr><td> O -- (N - succinimidyl) -- N ، N ، N &#39;، N&#39; - tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 105832-38-0 </td><td></td></tr><tr><td> كربونات البوتاسيوم في محلول مائي (1M) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 209619 </td><td> أعد في مختبرنا </td></tr><tr><td> البوتاسيوم رابع بوتاكسيد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 156671 </td><td></td></tr></tbody></table>

microwave-assisted one-pot synthesis of n-succinimidyl-4-[18f]fluorobenzoate ([18f]sfb)

الجزيئات الحيوية ، بما في ذلك الببتيدات والبروتينات 1-9 ، 10،11 والأضداد وشظاياها هندسيا ، 12-14 تكتسب أهمية لأن كلا من العلاجات المحتملة وكلاء التصوير الجزيئي. ولا سيما عندما المسمى مع بوزيترون النظائر المشعة التي تنبعث منها (على سبيل المثال ، النحاس - 64 ، GA - 68 ، أو 18 - F) ، ويمكن استخدامها في التحقيقات التي تستهدف لتصوير العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية. 15-18 لذلك ، فقد بذل جهد كبير المكرسة لتركيب الجزيئات الحيوية والاستكشاف من طراز F - 18 المسمى. وإن كانت هناك أمثلة أنيقة من طراز F - 18 مباشرة توسيم الببتيدات ، 19-22 الظروف القاسية رد الفعل (على سبيل المثال ، المذيبات العضوية ، ودرجة الحموضة الشديدة ودرجات الحرارة المرتفعة) المرتبطة مباشرة radiofluorination وعادة ما تكون غير متوافقة مع عينات من البروتين الهشة. حتى الآن ، وبالتالي فإن إدماج الجماعات الاصطناعية radiolabeled الجزيئات الحيوية لا تزال في طريقة الاختيار. 23،24 N - Succinimidyl - 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] SFB) ، 25-37 كاشف نوع بولتون - هنتر أن يتفاعل مع المجموعات الأمينية الأساسية من الجزيئات الحيوية ، هي مجموعة صناعية متعددة جدا لوضع العلامات F - 18 من طائفة واسعة من الكيانات البيولوجية ، من حيث الاستقرار واضحا في الجسم الحي ، وارتفاع العائد radiolabeling. بعد وضع العلامات مع [18 F] SFB ، الناتجة [18 F] يمكن استكشاف الجزيئات الحيوية fluorobenzoylated كأثر PET إمكانات التصوير في الدراسات المجراة. معظم 1 [18 F] radiosyntheses SFB الموصوفة في الأدبيات الحالية تتطلب اثنين أو حتى ثلاثة مفاعلات و التنقيات متعددة باستخدام إما استخراج المرحلة الصلبة (SPE) أو عالية الأداء اللوني السائل (HPLC). هذه العمليات مطولة تعوق انتاجه الروتينية وتطبيقات على نطاق واسع في radiolabeling الجزيئات الحيوية. على الرغم من أن العديد من وحدة بمساعدة [18 F] تم الإبلاغ عن التوليفات SFB ، 29-32 ، 41-42 أنها تقوم أساسا على اجراءات معقدة وطويلة مكلفة باستخدام مربعات الكيمياء الإشعاعية المتاحة تجاريا (الجدول 1). لذلك ، المزيد من التبسيط في radiosynthesis من [18 F] سوف SFB باستخدام الإعداد منخفضة التكلفة تكون مفيدة جدا للتكيف لعملية مؤتمتة. هنا ، علينا إعداد تقرير موجز [18 F] SFB ، استنادا إلى تجميع مبسطة بمساعدة الميكروويف وعاء واحد (الشكل 1). نهجنا لا تتطلب تنقية بين الخطوات أو أي الكواشف مائي. بالإضافة إلى ذلك ، تشعيع الميكروويف ، التي كانت تستخدم في توليفات من استشفاف PET عدة ، يمكن أن يعطي 38-41 RCYs أعلى وأفضل الانتقائية من ردود الفعل المقابلة الحرارية أو أنها توفر عوائد مماثلة في أوقات أقصر رد الفعل (38). والأهم من ذلك ، عندما وضع العلامات الجزيئات الحيوية ويمكن تحويل الوقت الذي وفره لاحقة أو bioconjugation PET خطوة 28،43 التصوير والجدة لدينا تحسن [18 F] SFB التوليف ذو شقين : (1) استراتيجية deprotection اللامائية لا يتطلب تنقية المتوسطة (ق) بين كل خطوة و (2) بمساعدة الميكروويف التحولات الإشعاعية تمكين السريع وإنتاج موثوق ل[18 F] SFB.

Watch this Scientific Journal Video about Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB at JoVE.com

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

وسطحية ، واحدة وعاء تجميع N - succinimidyl - 4 - [<sup&gt; 18</sup&gt; F] fluorobenzoate ([<sup&gt; 18</sup&gt; F] SFB وقد وضعت) على أساس غير مائي ، الإشعاعية عملية من ثلاث خطوات. التسخين باستخدام الميكروويف ، ويمكن الانتهاء من الإجراء بأكمله في أقل من 30 دقيقة أو 60 دقيقة مع تنقية المزيد من هبلك إعدادي. كانت تسوس لتصحيح غلة الإشعاعية (RCYs) 35-5 ٪ (ن&gt; 30).

بمساعدة الميكروويف واحدة وعاء تجميع N - succinimidyl - 4 - [ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

microwave-assisted-one-pot-synthesis-n-succinimidyl-4

Research

JoVE Journal

Biology

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

12.9K Views.  University of California at Los Angeles. وسطحية ، واحدة وعاء تجميع N - succinimidyl - 4 - [ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB وقد وضعت) على أساس غير مائي ، الإشعاعية عملية من ثلاث خطوات. التسخين باستخدام الميكروويف ، ويمكن الانتهاء من الإجراء بأكمله في أقل من 30 دقيقة أو 60 دقيقة مع تنقية المزيد من هبلك إعدادي. كا...

Video: Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

الأمثل للتفاعل UGI طريق تجميع ومعالجة وبالتوازي السائل الآلي

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

التوليف ومعايرة Nanoprobes الفسفورية للتصوير الأوكسجين في النظم البيولوجية

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

توليف لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; دقق في موت الخلايا المبرمج التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

الصلبة التجميعي المرحلة من الببتيد البس Functionalized استخدام &quot;سلامة الصيد&quot; منهجية

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

في المختبر توليف التعديل مرنا للتحريض التعبير البروتين في الخلايا البشرية

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

تجميع لتحويل الطول الموجي تهجين الحمض النووي تحقيقات باستخدام صامد Cyanine الأصباغ

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

تقييم معدلات تخليق البروتينات في Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...