이 연구는 에너지의 미 교육부 (DE - FG02 - 09ER09 - 08 및 DE - PS02 - 09ER09 - 18), UCLA에서 존슨 종합 암 센터 및 산학 협동 연구 프로그램 (UC 디스커버리 그랜트, bio07 지원했습니다 -10665). 우리는 F - 18 방사성 동위 원소 많은 통찰력 토론을 제공하는 UCLA 바이오 메디컬 사이클로 트론 시설에서 박사 Nagichettiar Satyamurthy 및 직원을 감사드립니다. 우리는 DRS 감사합니다. 마이클 콜린스, 그렉 르블랑, 조셉 램버트, 그들의 기술 조언과 지원 CEM에서 켈러 반하트. 우리는 더크 윌리엄스, 대린 윌리엄스, DRS 감사합니다. 요셉 홍콩 둔 린, 그리고 설계 및 가공 부품 마이클 반 댐은 CEM의 마이크 로파 반응기를 수정하고 SPE 정화 모듈 있습니다.

1. 초기 준비 <ol><li> V - 유리병 (5 ML) RV1는 (바 교반 포함) 마이크로 웨이브 합성을 수행하는 주요 반응 용기로 사용됩니다. 이것은 (그림 2 참조) 연결 7 입구 / 출구 포트 피크 어댑터에 연결하고 전자 캐비티 내부에 배치됩니다. RV2이 원유를 수집하는 SPE 카트리지 (I)에 연결되어있다 [18 F] SFB. RV3은 최종 [18 F] SFB 솔루션을 수집하기 위해 SPE 카트리지 (II)로 연결되어 있습니다. 이것은 특히 biomolecules의 하류 radiolabeling위한 PBS 버퍼에 reconstituting 전에 해당 솔루션을 집중하는 온수 욕조 (40 ° C)에 배치하실 수 있습니다. </li><li> 솔루션 5 % 수성 AcOH (8 ML), 저수지에 대한 MeCN (2 ML); 채워 MeCN / H 2 O [1시 4분 (V V) 6 ML :] SFB 원유 [F 18] 수집을위한 설정 각각 B와 C,. 다음 5% 수성 AcOH (10 ML) 세탁 다음 에탄올 (10 ML)과 SPE 카트리지 (I) (폴리스티렌, 머크 LiCholut EN)은 활성화합니다. </li><li> 정화를 수집하기위한 설정 [18 F] SFB : 준비 저수지 D와 E H 2 O의 10 ML 각각 디에틸 에테르 3 ML로 가득. 두 번째 SPE 카트리지 (II) (폴리스티렌, 머크 LiCholut EN)은 위에서 언급한 동일한 절차에 의해 활성화됩니다. </li><li> 미리 조절을위한 HPLC 컬럼 [리버스 위상 반 준비 열 :; : HPLC (3 ML / 분 유량 MeCN / H 2 O, 0.2 % TFA를 포함 1시 1분 (V / V) 용출 버퍼)를 시작합니다 (루나, 5 μm의 C18 (2) 100, 250 × 10 ㎜), Phenomenex, 토랜스, CA, 미국]. </li></ol> 2. 건조 [예 비 캐리어 추가 (NCA)] [18 F] 불소의 준비 <ol><li> [18 F] [18 O] H 2 O (100 μL)에서 불소 솔루션은 Eppendorf에서 Kryptofix 222 (20 MG), 1M 수성 K 2 CO 3 (26 μL)와 MeCN (0.8 ML)의 혼합물에 추가되었습니다 관. 전체 솔루션은 다음 유입 1 호선을 통해 RV1에 전송하기 전에 잘 혼합합니다. [18 F] 불소 용액은 또한 불소 - 18를 트랩하는 음이온 교환 카트리지 (워터스의 예 QMA - 가벼운 9 월 박) 통과 후 MeCN에서 K 2 CO 3 Kryptofix의 혼합물과 함께 밖으로 eluted 수 있습니다. </li><li> [진공 아래] RV1에서 잔류 수분을 제거하는 전자 제어 프로그램에서 건조 순서 (20W, 3 분)을 실행합니다. 시스템 온도가 아래에 50로 냉각 후 아래 ° C, 추가 MeCN (1.0 ML)은 반응기에 도입되었으며 순서가 한 번만 반복됩니다. </li></ol> 3. 에틸 4 합성 - [18 F] fluorobenzoate <ol><li> 에틸 4 포함한 DMSO 용액 (0.4 ML)로 - (N, N, N - trimethylammonium) 벤조 산 triflate (1.5 MG) 입구 2 호선을 통해 RV1에 추가되었습니다. </li><li> 감동, 선박 냉각 모든 밸브와 전자 제어 프로그램에서 레이블 순서 (50W, 1 분)을 실행하면 에틸 4 여유 폐쇄 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). </li></ol> 4. 칼륨 4 합성 - [18 F] fluorobenzoate <ol><li> KOtBu을 (13 MG)가 포함된 DMSO 용액 (0.5 ML)로 입구 3 호선을 통해 RV1에 추가되었습니다. </li><li> 감동, 선박 냉각 모든 밸브와 전자 제어 프로그램에 의해 Deprotect 프로그램 (40 W, 1 분)을 실행하면 4 살에 폐쇄 - [18 F] fluorobenzoate 소금 ([18 F] 3). </li></ol> 5. 원유 [18 F] SFB의 합성 <ol><li> TSTU을 (30 MG) 포함하는 acetonitrile 용액 (2.5 ML)로 유입 6 호선을 통해 RV1에 추가되었습니다. TSTU은 수분과 빛을 구분합니다. 그것은 작은 유리병에 aliquoted과 4 ° C 알루미늄 호일이 적용 닫힌 용기에 보관해야합니다. </li><li> 감동, 선박 냉각 모든 밸브와 전자 제어 프로그램에 의해 커플링 순서 (30W, 2 분)를 실행하면 [18 F] SFB 원유 여유로 마감했다. </li></ol> 6. SPE - 정화 [18 F] SFB의 준비 <ol><li> 5% 수성 AcOH (1.0 ML)은 반응 혼합물을 무력화 입구 7 호선을 통해 RV1에 추가되었습니다. 솔루션은 다음 5% 수성 AcOH (그림 2) 8 ML를 포함하는 유리 B로 전송되었습니다. </li><li> 트랩을 SPE 카트리지 (I)를 통해 희석 반응 혼합물 패스 원유 [18 F] SFB 사용하여 질소 (10 PSI). </li><li> 저수지 A. 출처 : MeCN 및 H 2 O [10 ML, 1시 4분 (V V)]의 혼합물로 세척 SPE 카트리지 (I) </li><li> [18 F] SFB는 저수지 C.에서 MeCN (2 ML)을 사용하여 RV2 밖으로 eluted되었습니다 </li></ol> 7. 조잡의 정화 [18 F] SFB 라디오 - HPLC와 함께 <ol><li> 중 원유를 희석 [18 F] SFB 또는 SPE - 정화 [18 F] RV2에서 H 2 O (2 ML)로 SFB와 HPLC 루프 (5 ML)로 혼합물을 전송하기만하면됩니다. 솔루션은 무선 HPLC에 주입되었다 [MeCN / H 2 O, 0.2 % TFA를 포함 1시 1분 (V / V), 유량 : 3 ML / 분]. </li><li> 정화 [18 F] SFB (유지 팀을 포함하고있는 분수를 수집E : 8~10분) 유리병 D (H 2 O의 10 ML 사전 가득한) (그림 2)에. 중요 단계 : 제대로 수행한 경우, 여기를 수집한 분수 볼륨 4-5 ML해야합니다. </li><li> 트랩을 SPE 카트리지 (II)를 통해 희석 반응 혼합물 패스 정화 [18 F] SFB 사용하여 질소 (10 PSI). 2-3분에 대한 질소의 흐름으로 카트리지를 건조시킵니다. </li><li> [18 F] SFB는 저수지 E.에서 디에 틸 에테르 (3 ML)을 사용 RV3 밖으로 eluted되었습니다. </li><li> 물 목욕 (40 ° C)를 사용하여 질소 가스의 부드러운 흐름 (10 PSI)에 의해 건조에 RV3에서 용매를 증발. 최종 건조 [18 F] SFB는 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 PBS 버퍼로 재구성 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : 우리는 빠른 단순, 합성 한 냄비 방법 개발 [18 F] SFB 각 화학 / radiochemical 변환하는 동안 무수 조건 및 마이크 로파 가열 아래 deprotection 전략을 사용합니다. 그림 1은 우리 radiosynthesis의 세부 정보를 제공합니다. 최종 제품의 정체성이 아닌 방사성 SFB 참조와 HPLC의 보존 기간의 비교에 의해 확인되었다. 정화 [18 F] SFB는 또한 radiochemical 화학 순도를 결정하는 라디오 - TLC 및 HPLC를 통해 분석되었다. 의 RCY [18 F] SFB 높은 radiochemical 순도 (&gt; 99 %)과 좋은 화학적 순도 (HPLC 프로필에 UV 추적을 참조 그림 3, HPLC 정화 (N&gt; 30) 후 60 분 이내에 35 ± 5 %입니다 ). 구체적인 활동 CA되었습니다. 67-330 GBq / μmol (1.8-9.0 CI / μmol)을 시작 방사능에 따라 다릅니다. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1.의 마이크로 웨이브를 이용한 한 냄비 radiosynthesis [18 F] SFB. 첫째, 에틸 4 radiofluorination - (N, N, N - trimethylammonium) 벤조 산 triflate (1)의 존재에 전자 레인지 가열 (50 W, 1 분)에 따라 수행되었다 [K ⊃ 2.2.2] [18 F] F - 에틸 4 여유 dimethylsulfoxide (DMSO)의 복잡한 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). 정화없이, tert - butoxide (t BuOK) 칼륨의 DMSO 솔루션은 추가되고 반응 선박은 무수 deprotection을 완료하는 조사 전자렌지 (40 W, 1 분)였습니다. 의 마지막 변환 [18 F]에 3 [18 F] SFB는 O - (N - succinimidyl)를 사용하여 달성되었습니다 - N, N, N &#39;, N&#39;- tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU) 활성화합니다. acetonitrile에 TSTU은 4 포함된 반응 혼합물에 추가되었습니다 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 3) 소금, 마지막 합성 단계는 굴복 원유 [18 F] 가열 후 SFB (30 W, 2 분). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. [18 F] SFB 합성 한 냄비 전자 레인지를 이용한 설치 프로그램의 개략도 그림. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 최종의 무선 - HPL chromatograms [18 F] SFB. 최고 : 254 nm의 자외선에 신호를, 하단 : 방사선 신호; 삽입된 페이지 : 254 NM (X 33.3)에서 UV 신호. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755table1.jpg" alt="표 1" /> . 표 1 요약 알킬 4를 사용 문헌에 보고된 [18 F] SFB의 radiosyntheses - (trimethylammonium) 엽 성의 전구 물질로 벤조 산의 triflate.

이 방법은 미국 특허 출원을 위해 제출되었습니다.

이것은 간단하게 3 단계, 한 냄비 18 F - acylation 시약의 radiosynthesis [18 F] SFB가 아닌 수성 화학을 기반으로 개발되고 있습니다. 이 과정은 우수한 재현성을 가지고 있으며, 생산을위한 안정적으로 사용될 수 [18 F] 때문에 다음과 같이 설명 두 가지 핵심 변경 사항을 자동 radiochemistry 모듈에 SFB 1. 우리는 일반적인 수성 기본 또는 산성 솔루션을 대체하는 무수 KOtBu / DMSO 시스템에...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 수용액에 초산 (5 %, V / V) </td><td> 어부 </td><td> A38 - 500 </td><td> 우리가 실험실에서 준비 </td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 75-05-8 </td><td></td></tr><tr><td> 디에틸 에테르 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 14,775 </td><td></td></tr><tr><td> 디메틸 Sulfoxide (DMSO) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 472301 </td><td></td></tr><tr><td> 에틸 4 - (N, N, N - trimethylammonium) 벤조 산 triflate </td><td> 실험실에서 준비 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4,7,13,16,21,24 - Hexaoxa - 1 ,10 - diazabicyclo [8.8.8] hexacosane (K222) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 29,111-0 </td><td></td></tr><tr><td> O - (N - succinimidyl) - N, N, N &#39;, N&#39;- tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 105832-38-0 </td><td></td></tr><tr><td> 수용액에 탄산 칼륨 (1M) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 209619 </td><td> 우리가 실험실에서 준비 </td></tr><tr><td> 칼륨 tert - butoxide </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 156671 </td><td></td></tr></tbody></table>

microwave-assisted one-pot synthesis of n-succinimidyl-4-[18f]fluorobenzoate ([18f]sfb)

펩티드, 단백질 1-9, 10,11 및 항체 및 엔지니어링 조각을 포함하여 Biomolecules, 12-14는 잠재적인 치료제와 분자 이미징 요원 모두 같은 중요성을 확보하고 있습니다. 특히, 양전자 방출 - radioisotopes (예 : 잘라내기 - 64, GA - 68 또는 F - 18)로 표시하면, 그들은 많은 생리와 병리 학적 프로세스의 목표 이미지에 대한 프로브로 사용할 수 있습니다. 15-18 따라서, 상당한 노력이있다 18 F - 라벨 biomolecules의 합성과 탐구에 전념. 펩티드의 직접 18 F - 라벨링의 우아한 예제, 19-22 거친 반응 조건이 있지만 (즉, 유기 용매, 극단적인 산도, 높은 온도) 직접 radiofluorination과 관련된는 깨지기 쉬운 단백질 샘플 일반적으로 호환되지 않습니다. 지금까지 따라서, biomolecules에 radiolabeled 보철 그룹의 설립은 선택의 방법은 남아있다. 23,24가 N - Succinimidyl - 4 - [18 F] fluorobenzoate 18 F - 라벨에 대한 ([18 F] SFB), 25-37 biomolecules의 주요 아미노산 그룹과 반응 볼턴 - 헌터 타입 시약입니다 매우 다양한 보철 그룹 생체내 안정성과 높은 radiolabeling 수율 년에 확연히의 관점에서 생물 학적 기관의 다양한 스펙트럼의. 와 라벨 후 [18 F] SFB, 결과 [18 F] fluorobenzoylated biomolecules가 생체내 이미징 연구에 대한 잠재적인 애완 동물 추적기으로 살펴 수 1. 대부분의 [18 F] 현재 literatures에서 설명 SFB의 radiosyntheses가 두 개 또는 심지어 세 원자로를 필요로하고 중 고체 상 추출 (SPE) 또는 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC)를 사용하여 여러 purifications. 이러한 긴 과정은 일상적인 생산과 biomolecules의 radiolabeling에서 광범위한 응용 프로그램을 방해. 비록 몇 가지 모듈을 이용한 [18 F] SFB의 syntheses가보고되었습니다, 29-32, 41-42들은 주로 비용 상용 - 가능한 radiochemistry 상자 (표 1)을 사용하여 복잡하고 긴 절차를 기반으로합니다. 따라서의 radiosynthesis의 더욱 단순화 [18 F] 저렴한 비용으로 설치 프로그램을 사용 SFB는 자동화된 프로세스하기 위해 adaption 매우 도움이 될 것입니다. 여기에, 우리는의 간결 준비 보고서 [18 F] 단순 한 냄비 전자 레인지를 이용한 합성 (그림 1)에 따라 SFB. 우리의 접근 방식은 단계 또는 수성 시약 사이의 정화가 필요하지 않습니다. 또한, 여러 가지 애완 동물 추적기의 syntheses에 사용되었습니다 마이크 로파 조사, 38-41 높은 RCYs과 해당 열 반응보다 나은 선택성을 제공하거나 그들이 짧은 반응 시간에 유사한 산출을 제공합니다. 38 가장 중요한 biomolecules을 라벨링 때 저장된 시간 이후 bioconjugation 또는 PET 이미징 단계로 우회 수의 개선의 28,43 참신 [18 F] SFB 합성은 두 배입니다. (1) 무수 deprotection 전략 사이의 중간 (S)에 대한 정화가 필요없는 각 단계 및 (2) 전자 레인지를 이용한 radiochemical 변환은 [18 F] SFB의 급속한 안정적인 생산을 가능하게합니다.

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Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

의 손쉬운, 한 냄비 합성 N - succinimidyl - 4 - [<sup&gt; 18</sup&gt; F] fluorobenzoate ([<sup&gt; 18</sup&gt; F] SFB)가 아닌 수성, 3 단계 radiochemical 프로세스를 기반으로 개발되었습니다. 마이크 로파 가열을 사용하여 전체 절차는 30 분, 또는 예비 HPLC에 의해 더욱 정화와 60 분 안에 완료할 수 있습니다. 부패 - 수정 radiochemical 수확량 (RCYs)는 35-5% (n은&gt; 30)되었습니다.

의 마이크로 웨이브를 이용한 원 - 냄비 합성 N - succinimidyl - 4 - [ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

microwave-assisted-one-pot-synthesis-n-succinimidyl-4

Research

JoVE Journal

Biology

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

12.9K 조회수.  University of California at Los Angeles. 의 손쉬운, 한 냄비 합성 N - succinimidyl - 4 - [ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)가 아닌 수성, 3 단계 radiochemical 프로세스를 기반으로 개발되었습니다. 마이크 로파 가열을 사용하여 전체 절차는 30 분, 또는 예비 HPLC에 의해 더욱 정화와 60 분 안에 완료할 수 있습니다. 부패 - 수정 radiochemical 수확량 (RCYs)는 35-5% (n은> 30)되었습니다.

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Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

병렬 합성 및 자동 액체 처리를 사용하여 Ugi 반응의 최적화

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

연구

생물학

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

생물 학적 시스템에서 산소 이미징에 대한 인광을 발하는 나노 프로브의 합성 및 교정

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

의 합성<em&gt; 생체내에서</em&gt; MRI-감지 Apoptosis 프로브

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

기능화 비스 - 펩타이드의 고상 합성은 방법론 &quot;을 안전 잡아라&quot;사용

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

체외 합성에 인간의 세포에서 단백질 발현 유도의 mRNA를 수정의

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...