שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על טלומרים, כגון שמרים טלומרים noncoding RNA TERRA לוקליזציה, ואני יכול להתעקש שזה טלומר ממוצא או טרנס, קרומס-mants שונים היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת לחוקרים לדמיין מולקולות TERRA לבטא טלומר אחד בתאים חיים. להדגים את ההליך יהיו קלאודיו אוס פגואר וניקול בטין, שני סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל לגדל תאי AGS בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, כאשר התאים מגיעים 50 עד 60%confluence לשנות אותם עם sgRNA Cas9 המביע וקטור ואת הקלטת MS2. למחרת להחליף את המדיום culturing עם בינוני המכיל Neomycin. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של 0.25% Tripsyn לכל באר של צלחת 96 באר.
באמצעות מיקרוסקופ וסמן, סמן את המיקום של כל שיבוט גלוי בצלחת. החלף את המדיום culturing Neomycin עם מספיק PBS כדי ליצור סרט דק של נוזל על השיבוטים. באמצעות פיפטה 10 microliter המכיל חמישה microliters של טריפסין, לאט לשחרר את טריפסין למושבה.
אפשר ל- Trypsin לנתק את התאים למשך דקה אחת. לגרד את המושבה עם הקצה, ולמצוץ אותו לתוך הקצה. לאחר מכן, להעביר את התאים מהמושבה לתוך באר של צלחת 96 באר.
דגירה הצלחת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מלאו את הטוב ב-150 מיקרוליטרים של מדיום סלקטיבי. לאחר מכן, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ג'לטין לכל באר של שלוש 96 צלחות באר.
הדגירה את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, ולשטוף את הצלחות עם PBS פעמיים. לאחר השיבוטים להגיע 90% confluence, שאפו את המדיום מכל באר של הצלחת, ולשטוף את הצלחת עם PBS. לאחר מכן מוסיפים 30 מיקרוליטרים של טריפסין לכל באר, ו דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לאחר מכן, להוסיף 70 microliters של מדיום סלקטיבי לכל בארות. לשבש את התאים על ידי צינור למעלה ולמטה. מעבירים 30 מיקרוליטרים של התערובת לגם של צלחת הדנ"א הג'לטין המכילה 120 מיקרוליטרים של מדיום סלקטיבי.
לאחר מכן מעבירים 30 מיקרוליטרים של התערובת לצלחת ההקפאה הג'לטין המכילה 50 מיקרוליטרים של מדיום. מניחים את הדנ"א באינקובטור, ומאפשרים לתאים לגדול ב-37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים ל-90%. לאחר מכן, מוסיפים 80 מיקרוליטרים של מדיום מקפיא קר כקרח לכל באר של הצלחת המקפיאה.
לאטום את הצלחת עם parafilm, להחליף את המכסה, ולעטוף את הצלחת בנייר אלומיניום. ואז לשמור על צלחות הקפאה ב 80 מעלות צלזיוס. לאחר השיבוטים בצלחת ה-DNA להגיע 90% confluence, לשטוף את הצלחת עם PBS פעמיים.
לאחר מכן lyse התאים עם 50 microliters של מאגר Lysis. מכסים את הצלחת בפרפילם, מחליפים את המכסה, ועוטפים את הצלחת בגלישת סארן. לאחר מכן, הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
למחרת להוסיף 100 microliters של פתרון נתרן כלוריד אתנול לכל באר, ולאפשר משקעים DNA במשך שש שעות או לילה בטמפרטורת החדר. ואז להפוך את הצלחת ולשטוף אותו שלוש פעמים עם 200 microliters של אתנול 70% לגם. מוסיפים 20 מיקרוליטרים של פתרון RNase A לכל באר של הצלחת, ו דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר מכן, השתמש בשלושה מיקרוליטרים של דנ"א גנומי להגברת PCR, והגדר את מכונת ה- PCR. לגדול שיבוטים חיוביים PCR בשש צלחות גם על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר השיבוטים להגיע 90%confluence, לשטוף את התאים עם PBS, ולהוסיף 250 microliters של חיץ ליזה עם Proteinase K לכל באר.
השתמש מגרד תא כדי לגרד את התאים, ולהעביר את Lysate לצינור 1.5 מיליליטר. דגירה Lysate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. מוסיפים מיליליטר אחד של אתנול ללייט, ומנערים במרץ.
אפשר לשכפול לגדול בגודל F-12K על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הוסיפו את אדנווירוס ההבעה של Cre לתאים ברגע שהם מגיעים ל-70%. 48 שעות לאחר ההדבקה, לפצל את התאים לשלוש מנות 10 ס"מ.
ואז תרבות הכלים השלישיים להקפאת תאים, והפקת RNA. ראשית, צלחת שיבוטים TERRA-MS2 ואת סוג הבר AGS תאים במנות תחתית זכוכית. לאחר מכן הוסיפו את פוליברן ואת MS2-GFP המבטאת רטרווירוס למדיום.
לאחר 24 שעות להשליך את המדיום המכיל את רטרווירוס, ולהוסיף מדיום טרי ללא פנול אדום לתאים. לבסוף, באמצעות מיקרוסקופ הפוך ותצלמת מצלמה רגישה התאים עם המטרה המתאימה ואת הצמצם. בפרוטוקול זה שיבוטים של תאים סרטניים המכילים תג רצף MS2 בתת-בית אחד נוצרו ודימוי.
שיבוטים עמידים Neomycin הוקרן באמצעות PCR. השיבוטים החיוביים היו מתורבתים ב lysed עבור מיצוי DNA גנומי וניתוח כתם דרומי. השיבוטים החיוביים לניתוח כתמים PCR ודרום נדבקו ב- CRE-GFP המבטא את אדנווירוס על מנת להסיר את הגן Neomycin הנוכחי בקלטת MS2.
לאחר חיסול גן ההתנגדות Neomycin אושרה, RNA שחולצו מן השיבוטים נבדקו לביטוי של תעתיקים TERRA-MS2. על מנת לדמיין תעתיקי TERRA-MS2 בתאים חיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקאלית, השיבוטים שנבחרו היו נגועים רטרווירוס המבטא חלבון היתוך MS2-GFP. תעתיקי TERRA-MS2 וטרומרים הודמיו בו זמנית בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית על ידי ביטוי שותף של חלבון ההיתוך MS2-GFP וחלבון מחייב טלומר מותך mCherry, TRF2, ב השיבוטים שנבחרו.
בעת ניסיון הליך זה חשוב לעשות כל מאמץ כדי לבחור שיבוט יחיד במקום אוכלוסייה מעורבת של שיבוטים. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו DNA FISH על התפשטות כרומוזום, ניתן להשתמש כדי לדמיין את השילוב של קלטת MS2 בתאים קבועים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הטלומרים לחקור את לוקליזציה תאית של מולקולות TERRA טלומר יחיד בתאים אנושיים חיים.
אל תשכח כי עבודה עם וקטורים ויראליים וחומרים רדיואקטיביים יכול להיות מאוד לא בטוח. ואמצעי זהירות, כגון לבישת חלוקי מעבדה, כפפות ושימוש במגני פרספקס כדי למזער את הקרינה תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.
