J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

הערה: כל הצעדים בפרוטוקול זה אושרו על ידי UT מרכז סרטן MD Anderson. 1. דור של mTERT-ER אללו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג לדפוק במיקוד וקטור המכיל את ERT2-LBD (יגנד כריכת Domain) במעלה הזרם ובמסגרת עם הרצף הגנומי mTERT (אקסון אינטרון 1 עד 2) ולקס - PGK - ניאו - בר לקס (איור 1 א) בתאי הגזע העובריים של עכבר עם electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי הגזע העובריים בנאומיצין ל6-10 ימים. בחר שיבוטים נאומיצין עמיד ולהרחיב ב -48 צלחות גם. חלץ את הדנ&quot;א הגנומי באמצעות ערכה מסחרית ולאשר את נוק-באלל על ידי כתם דרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק שני קווי ES עם karyotypes הנורמלי מעל 95% לC57BL / 6 blastocysts עם ערכת מיקרומניפולציה תחת מיקרוסקופ הפוכה. שתל blastocysts אל תוך הרחם של אמהות פונדקאיות 23. Mate תעתועים בדרגה גבוהה ממין זכר (70-90%) לC57BL / 6 Feזכרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את genotyping של בעלי החיים mTERT-ERneo הטרוזיגוטיים על ידי כתם דרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mate בעלי החיים mTERT-ERneo הטרוזיגוטיים ובעלי החיים EIIa-Cre למחוק את קלטת NeoR. Mate בעלי החיים הטרוזיגוטיים לC57BL / 6 בעלי חיים ללפחות שלוש פעמים, ובעלי חיים mTERT-ER נוספים בין-גזע הטרוזיגוטיים ליצירת homozygosity. </li></ol> 2. דור של LSL-mTERT אללו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את נוק-במיקוד וקטור המכיל LoxP - בלם משולש - ניאו - בר LoxP והרצף הגנומי mTERT (בין אקסון אינטרון 1 ו2, איור 1) בתאי הגזע העובריים של עכבר עם electroporation 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי הגזע העובריים בנאומיצין ל6-10 ימים. בחר שיבוטים נאומיצין עמיד ולהרחיב ב -48 צלחות גם. חלץ את הדנ&quot;א הגנומי באמצעות ערכה מסחרית ולאשר את נוק-באלל על ידי כתם דרום 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Injeקווי שני ES ct עם karyotypes הנורמלי מעל 95% לC57BL blastocysts / 6 עם ערכת מיקרומניפולציה תחת מיקרוסקופ הפוכה. שתל blastocysts אל תוך הרחם של אמהות פונדקאיות 23. Mate תעתועים בדרגה גבוהה ממין זכר (70-90%) לC57BL / 6 נקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את genotyping של בעלי החיים LSL-mTERT הטרוזיגוטיים על ידי כתם דרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mate בעלי החיים הטרוזיגוטיים לC57BL / 6 בעלי חיים ללפחות שלוש פעמים, ובעלי החיים LSL-mTERT בין-גזע נוסף הטרוזיגוטיים ליצירת homozygosity. </li></ol> 3. הפעלה מחדש של הטלומרז בmTERT-ER ועכברים LSL-mTERT בVivo לmTERT-ER <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הכלים כירורגיים לפני ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים עם תא isoflurane (4% לזירוז, 2% לשמירה) ב 50% (V / V) חמצן / 50% (V / V) תערובת גז חד תחמוצת dinitrogen. או להרדים עכברים על ידי תערובת קטמין-xylazine (100 מ &#39;g / משקל גוף קילוגרם + 10 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שתושג הרדמה עמוקה, להסיר את החיה המורדמת מתא האינדוקציה, ולשמור על הראש שלהם בתוך הצינור המחובר לתא isoflurane (2%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט את כריות כף הרגל של העכברים כדי להבטיח את החיה מורדמת עמוקה. למרוח משחה על שני העיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות. נגב את החלק האחורי של העכברים עם פתרון povidone- יוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את גלולה 4-OHT איטי שחרור עם trochar דיוק (10 G) מתחת לעור של הגב ולדחוף את הכדור כל הדרך אל קו האמצע בין שתי כתפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החתך עם applier קליפ הפצע ולפקח על העכברים להתאוששות מן ההרדמה. הסר את הסרטונים 10 ימים לאחר מכן. חום נוסף אינו הכרחי משום שההליך יסתיים בקרוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקופת טיפול עם גלולה 4-OHT צריך להיות מותאמת לפי צורך המחקר. </li></ol> לLSL-mTERT &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמוקסיפן (10 מ&quot;ג / מיליליטר, מומס בשמן תירס) מוזרק intraperitoneally שני ימים רצופים (200 ul / 25 ג &#39;/ יום). </li></ol> 4. בידוד של תאי גזע עצביים והפעלה מחדש של הטלומרז במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מורדמים עם פחמן דו חמצני והמוח יוסרו. בצע את הפרוטוקול של ערכת ניתוק רקמה עצבית זמינה מסחרי כמו לכל יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend אבקת lyophilized בבקבוקון שכותרתו 4 פתרון עם 1 מיליליטר של מדיום תרבית תאים לפתרון 4. האם לא מערבולת. פתרון זה אמור להיות aliquoted ומאוחסן ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pre-חום התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך אנזים Mix 1: פתרון 1 (50 μl) ופתרון 2 (1,900 μl). הפוך אנזים Mix 2: פתרון 3 (20 μl) ופתרון 4 (10 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת אנזים 1,950 μl 1 עד 400 רקמות ומערבולת מ&quot;ג. טרום לחמם את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך15 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מוח עכבר 1 היום, ולשמור forebrains על ידי הסרת נורות חוש הריח והמוח הקטן. שמור את רקמות המוח הקדמי ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות הקר מאז פינוי וחנות ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד לעבד את הרקמה העצבית בתוך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המשקל של רקמה לוודא את מגבלת 400 מ&quot;ג לעיכול אין חריגה. מניחים את המוח על המכסה של צלחת פטרי בקוטר 35 מ&quot;מ, ולרסק את המוח באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה פיפטה 1 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר של HBSS (w / o Ca / Mg) והחלקים בחזרה לתוך צינור 15 מיליליטר פיפטה. לשטוף עם HBSS (w / o Ca / Mg). צנטריפוגה ב× גרם 300 למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר ולשאוב supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1,950 μl של תערובת אנזים שחומם מראש 1 (פתרונות 1 ו -2) לרקמת מ&quot;ג עד 400. דגירה בצינור 15 מיליליטר במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ערבוב על ידי היפוך או טלטול הצינור כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת אנזים 30 μl 2 לדגימה רקמה על ידי הוספת 20 &amp; #956; l של פתרון 3-10 μl של פתרון 4. לאחר מכן להוסיף למדגם. היפוך בעדינות לתערובת. לא מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הרקמה באופן מכאני באמצעות פיפטה פסטר רחבה שקצהו, אש המלוטשת על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים לאט. הימנע מיצירת בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, צינור היפוך כל 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב 4.11 וצעד 4.12 אם הרקמות גדולות יותר מ -200 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ההשעיה התא למסננת תא 70 מיקרומטר, שהונחה על שפופרת 50 מיליליטר. החל 10 מיליליטר של PBS דרך מסננת תא. בטל מסננת תא והשעית תא צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים עם תאי גזע בינוני עד הנפח הנדרש עבור יישומים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפעיל הטלומרז בLSL-mTERT NSCs, טיפול בתאים עם 100 מיקרומטר 4-OHT במשך יומיים. כדי להפעיל הטלומרז בmTERT-ER NSCs, לשמור על התאים במדיום תרבות עם 100 מיקרומטר 4-OHT. </li></ol> 5. FISH הטלומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הכרומוזומים metaphase מהתאים בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לFFPE (פורמלין קבוע ופרפין Embedded) סעיפי רקמות, deparaffinize בקסילן ורעננות סדרת אתנול במשך 5 דקות כל אחד (100%, 90%, 70%, 50% אתנול) וPBS במשך 5 דקות ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן במתנול: חומצה אצטית (3: 1) במשך 1-2 שעות. מייבשים בסדרת אתנול קר למשך 5 דקות כל אחד (70%, 90%, 100% אתנול) ואוויר יבש. לשטוף ב1x PBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל כרומוזומים בפורמלין 4% על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מייבשים בסדרת אתנול קר 5 דקות כל אחד (70%, 90%, 100% אתנול) ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 12 עד 25 μl של תערובת הכלאת PNA לכל שקופית. (תערובת הכלאה: פוראמיד 70%, SSC 0.06x, BSA 0.2%, בדיקות / μl tRNA, 0.5 ng / הטלומרים או centromere μl 0.5 ng) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את תלוש לכסות בבטון גומי. preps פוסט-לפגל כרומוזומליות וחתכים רקמה על 80 מעלות צלזיוס למשך 4 מ &#39;ב. להכליא בטמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות בתא לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בטמפרטורת חדר עם חיץ כביסה דקות 2 x 15. (חיץ לשטוף: פוראמיד 70%, SSC 0.06x, pH 7.2). לשטוף בטמפרטורת חדר 3 x 5 דקות עם PBST. שקופיות Counter-כתם עם DAPI או הקרינה מרחיקות אדומה לבדיקה מיקרוסקופית. </li></ol>

<ol>
	<li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion.">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA.">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs.">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li><li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age.">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing.">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li><li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity,+stress+response,+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice.">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation.">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li><li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells.">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li><li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyskeratosis+congenita.">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li><li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndromes+of+telomere+shortening.">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li><li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita.">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li><li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase,+checkpoints+and+cancer.">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li><li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-+and+ATM-dependent+apoptosis+induced+by+telomeres+lacking+TRF2.">p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2.</a> Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).</li><li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions.">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li><li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis.">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li><li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice.">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li><li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans.">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li><li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a(delta2/3)+cancer-prone+mouse.">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li><li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice.">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer.">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li><li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases.">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן, אנו מדווחים על הדור של שני אללים הטלומרז עכברי מושרה וכיצד להפעיל מחדש telomerase in vivo ובמבחנה. הצעד הקריטי להפעלה מחודשת של פעילות mTERT-ER הוא לשמור ריכוז מתמשך של טיפול בטמוקסיפן, ולכן אנחנו בוחרים להשתמש כדורים בזמן שחרור 4-OHT מיוצרים על ידי מחקר חדשני של אמריקה. כדורים לשמור שחרור 4OHT ברמת מצב יציבה דם של 1 ng / ml עד 60 ימים. במחקר קודם, שהראינו כי ההפעלה מחדש פעילות הטלומרז עם אסטרטגיה זו הצליחה לשפר פנוטיפים ניווניות כגון תשישות תאי גזע, ירידת ערך של תגובות פגיעה ברקמות וכשל איברים באיברים רבים שנגרמים על ידי הפרעה בתפקוד הטלומרים בG4 mTERT ER / ER עכברים 20. מלבד לימוד הפונקציה של הטלומרז בהזדקנות, יכולים לשמש גם שני אללים הטלומרז מושרה אלה ללמוד סרטן. מחקרים קודמים לקחויתרון של אללים אלה כדי לחקור את תפקידו של התשה הטלומרים והפעלה מחדש telomerase בעיצוב הגנום ומשפיע על הביולוגיה של לימפומה הרתי T-cell 21 וסרטן הערמונית 22. שני מחקרים אלה הראו כי תפקוד לקוי של הטלומרים בדור מאוחר G4 כספומט - / - mTERT ER / ER וG4 PB-Cre4 PTEN L / p53 L L / L LSL-mTERT L / עכברי L מספק מנגנון תדלוק רכישת אירועי mutagenic המוקדמים ל התחלה של גידול, עדיין מונע התפתחות של גידולים ממאירים באופן מלא. כאשר הטלומרז היה מחדש בהקשר של חוסר יציבות הנוצר על-תפקוד לקוי של הטלומרים הגנומי, מחסומי נזק ל- DNA וחוסר יציבות כרומוזומלית משתולל דוכאו, שאיפשר את ההתקדמות המלאה של גידולים ממאירים עם מאפיינים ביולוגיים חדשים כגון גרורות בעצמות של סרטן הערמונית 21 וחדירת המוח של thymiלימפומה ג 21. תופעות דומות נצפו גם בסוגי הסרטן אחרים, כוללים סרטן מעי גס וסרטן לבלב (תקשורת אישית עם בני הזוג. Haoqiang יינג, האדם Boutin ורונלד DePinho). כי חלבון טרט-ER ניתן מתג בקלות בין לסירוגין מדינות תלויים אם מטופלים בעלי החיים בטמוקסיפן או כלי רכב, ניתן יהיו לנצל את המודלים של הגידול שנוצרו על ידי אלל mTERT-ER לבדוק טיפול אנטי-הטלומרז. במחקר קודם, גידולים שנוצרו בG4 כספומט - / - בעלי חיים / ER mTERT ER שוחררו מ4-OHT; על דלדול הטלומרז, גידולים התכווצו סופו של דבר בשל החזרת מחסומים הנגרם הפרעה בתפקוד הטלומרים 21. עם זאת, חלק מהגידולים רכשו התנגדות בתגובה להטלומרז הכחדה על ידי הפעלת התארכות אלטרנטיבית של הטלומרים מנגנון (ALT). אפיון נוסף של גידולי ALT + עמיד אלה הראה כי tהיי יש שעתוק חריג של גני המעורבים בביולוגיה של המיטוכונדריה והגנה חמצוני כוללים רגולטור ראשי של הגנת סינתזה וחמצוני המיטוכונדריה PGC-1β. מציאה של PGC-1β או SOD2 (רגולטור נוסף של הגנת חמצוני) מבטלת באופן משמעותי תאי ALT + גידול בזמן לשמור על תאים הטלומרז + גידול להישאר יחסית ללא פגע 21. מגבלה אחת של שני אללים לדפוק באלה היא שהם יכולים להרשות לעצמם רק הפעלה מחדש של הטלומרז ברמת אנדוגני כי הם נמצאים במוקד יליד הגן הטלומרז. ברוב סוגי הסרטן אנושיים, הטלומרז הוא למעשה ביטוי יתר ברמה הרבה יותר גבוהה. על מנת לשפר את רמת הטלומרז, שינוי אחד אנחנו יכולים לשקול הוא להכניס את מבנה mTERT-ER עם אמרגן חזק כגון PGK אמרגן (kinase phosphoglycerate) למוקד Rosa26. לסיכום, שני אללים אלה הרומן מושרה עכבריים הטלומרז לספק ז&#39;נה חסרת תקדיםכלים ic ללמוד את הפונקציות של הטלומרז בהזדקנות והומאוסטזיס רקמה, כמו גם את התקדמות הגידול, במיוחד תחת הרקע של חוסר יציבות הנוצר על-תפקוד לקוי של הטלומרים רכש מראש הגנומי. גם אלל mTERT-ER יכול לשמש כדי ללמוד טיפול אנטי-הטלומרז על ידי חצייה לתוך מודלים עכבר גידול מועד אחרים.

הטלומרז הוא אנזים אחראי לשמירת הטלומרים. אלה הם רצפים חוזרים בקצוות של כרומוזומים שלהגן על היושרה שלהם. רכיבי הליבה של holoenzyme telomerase הם מקטע transcriptase ההפוך קטליטי (טרט) ומקטע RNA (TERC) המשמש כתבנית להוספת telomeric חוזר 1,2. בעוד מודחק בדרך כלל בתאים סומטיים מובחנים, הטלומרז מציג פעילות חזקה וממלא תפקידים חשובים בתאי נבט, תאי סרטן ותאי גזע. עכברי נוקאאוט mTERC וmTERT לספק גדולים במערכות מודל vivo ללמוד את הפונקציות של הטלומרז בשני תאי גזע וסרטן. MTERC וmTERT מפסיד יוצא, עכברים (G1) לא הראו שום פנוטיפים ברורים בשל המילואים הארוכים של הטלומרים בעכברים 3. עם זאת, באופן סדרתי intercrossing עכברי נוקאאוט mTERC וmTERT לדור מאוחר (G5-G6) הביא לשחיקה הדרגתית של הטלומרים וסופו של הדבר עוררה ניוון חמור של רקמות שגשוג מאוד 4. דור המאוחר (G5-G6) mTERC - / - עכברים עקרים בשל השיעור הגבוה של אפופטוזיס בדלדול תא אשך וניבט. G5-G6 mTERC - / - עכברים גם תערוכת פנוטיפים ניוונית ברקמות השגשוג ביותר כוללים מח עצם, מעי ועור בשל שיעור גבוה של אפופטוזיס ויכולת התחדשות עצמית פגומה בגזע רקמות / תאי תא אב 4. תאי גזע hematopoietic במח העצם של דור מאוחר mTERC - / - עכברי אובדן תערוכה של פוטנציאל שגשוג, יכולת התחדשות עצמית נפגעה, אפופטוזיס המוגבר וסופו של דבר תשישות תפקודית 5,6. בדומה לכך, גופים אפופטוטיים מוגברים בהדרגה במאורות מעי נצפו בכל דור של G1-G6 mTERC - / - עכברי 7,8. Tהוא השפעה מזיקה של הטלומרים לא מתפקדים לא נראה להיות מוגבל לרקמות תחלופה גבוהות שכן הן ההתפשטות של תאי גזע עצביים מבוגרים במבחנה וneurogenesis in vivo היו נפגעות קשה בדור מאוחר (G4-G5) mTERC - / - עכברים 9 . התפקיד של הטלומרז בתאי גזע נתמך גם על ידי הממצאים בcongenita נדיר אנושי הפרעה גנטית דיסקרטוזיס (DKC), אשר במובנים מסוימים דומה הזדקנות מוקדמת של 10,11. DKC נגרמים על ידי מוטציות בTERC, טרט, והגנים המקודדים dyskerin, מקטע הטלומרז ליבה, וdyskerin אחר חלבונים הקשורים 12. בממוצע, הטלומרים בחולי DKC הם קצרים יותר מאשר 99% בקבוצת ביקורת באותו גיל. התחלואה העיקרית של המחלה היא כתוצאה מאנמיה אפלסטית, אשר נגרמת על ידי תחזוקה לקויה של תאי גזע hematopoietic. היבטים אחרים של המחלה כגון leukoplakia האוראלי, מסמר ניוון, retardati הנפשיב, ניוון אשכים וסיבוכים ריאתי כל מציעים לקוי פונקציות של תאי רקמת גזע ותאי אב 10, ממצאים בהסכם קרוב עם אלה בדור המאוחר של עכברי נוקאאוט הטלומרז. חולי DKC נוטים תסמונת המיאלודיספלסטית ויש לי שכיחות מוגברת של שאתות ממאירות ברירית. כך, מחסור בהטלומרז בחולים אנושיים משחזר את הפגמים של פונקציות תאי גזע ונטיית גידול שנצפו בעכברי נוקאאוט הטלומרז דור מאוחר. טלומרים קצרים ופעילות גבוהה הטלומרז הם מסימני היכר של הסרטן. כתאים נורמלים או טרום לחלק, תוצאות הפעילות הטלומרז נמוכות או חסרות בסופו של הדבר לשחיקת הטלומרים והפעלת מחסומים סלולריים דומים לאלה עוררו על ידי ה- DNA גדילים כפולים הפסקות (DSBs) 13. כמו DSBs הקלאסי, תפקוד לקוי של הטלומרים הוכח לגרום p53 וקשורים תגובות הסלולר, כגון הזדקנות ו / או apoptosiזה 14,15. על איון מוטאציות של p53, רכיבה על אופניים תא והישרדות תא משופרים בתאים עם תפקוד לקוי של הטלומרים, שמספק מנגנון המוטטורי פרו-מסרטנת המאופיין בטרנסלוקציות וamplifications האזורי ומחיקות 16,17. במקביל, המשיך תפקוד לקוי של הטלומרים וחוסר יציבות כרומוזומלית משתולל קשור (אפילו בתאי null p53) מופיע להגביל התקדמות ממארת מלאה של סרטן מסוג זה. לדוגמא, G4-G5 הדור מאוחר mTERC - / - Ink4a / ארף - / - עכברים הראו שכיחות לימפומה מופחתת באופן משמעותי בהשוואה לעכברי null Ink4a / ארף עקב התשה הטלומרים. במחקר אחר, נגעי adenomatous מתקדמים יותר בG4 mTERT - / - עכברי דקות APC דוכאו באופן משמעותי בהשוואה לעכברי דקות APC בשל מעצר צמיחה משמעותי ואפופטוזיס 18,19.תצפית שהטלומרים תפקוד לקוי-induced חוסר יציבות גנומית מעכבת התקדמות גידול מבקשת הספקולציות כי ההפעלה הטלומרז עשויה לאפשר התקדמות ממארת בחלקו על ידי דיכוי חוסר יציבות גנומית לרמה תואמת ליכולת קיום של תאי הסרטן ו / או p53 תלוי נטרול או מנגנוני מחסום -independent. כדי ללמוד אם הפעלה מחדש telomerase יכולה לעצור או אפילו להפוך הזדקנות של תאי גזע, ואם הפעלה מחדש telomerase יכולה לקדם את יצירת הגידולים על רקע חוסר היציבות גנומית, אנחנו שנוצרנו שני אללים הטלומרז עכבריים מושרה. הראשון הוא 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) היתוך -inducible טרט-קולטן אסטרוגן (ER-mTERT) לדפוק באלל. בהעדר 4-OHT, עכברים הומוזיגוטים לmTERT-ER (mTERT ER / ER המיועד) הן פעילות הטלומרז לקויה ולקיים אותו פנוטיפים ציטוגנטית וסלולריים כmTERT או מ &#39;קונבנציונלייםמודל נוקאאוט TERC. על 4-OHT טיפול, פעילות חלבון טרט-ER ניתן לשחזר לרמות דומות לחלבון האם של טרט 20, 21. אלל השני הוא לדפוק באלל המכיל קלטת LoxP-בלם-LoxP אינטרוניים (LSL- טרט מושרה רומן mTERT); על Cre בתיווך הכריתה של LSL, mTERT מחדש הביע תחת מנגנוני בקרת ביטוי אנדוגני 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21810031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1005796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine-xylazine mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxfien</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT pellet</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>Custermized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Trochar (10 Gauge)</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clip applier</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clip</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A-433S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>22-032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>F84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA telomere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F1001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA centromere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F3003-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1325-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5636-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber cement</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

הטלומרים תפקוד לקוי-induced אובדן שלמות הגנום ואיתות הנזק ל- DNA הקשורים אליו ותגובות מחסום נהגים ותיקים שגורמים לניוון רקמה במהלך הזדקנות. סרטן, עם שיעורי היארעות להגדיל באופן משמעותי עם גיל, מאופיין באורכי הטלומרים קצרים ופעילות הטלומרז גבוהה. כדי לחקור את התפקידים של חוסר תפקוד הטלומרים והפעלה מחדש telomerase בהזדקנות וסרטן, הפרוטוקול מראה כיצד ליצור שתי הטלומרז מושרה עכברי נוק-באללים 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible טרט-קולטן אסטרוגן (ER-mTERT) ולקס -Stopper-לקס טרט (LSL-mTERT). הפרוטוקול מתאר את הנהלים כדי לגרום לתפקוד הלקוי של הטלומרים ולהפעיל מחדש את פעילות הטלומרז בעכברי mTERT-ER וLSL-mTERT in vivo. הנתונים מראים כי הנציג מחדש של פעילות הטלומרז יכול לשפר פנוטיפים ניוונית רקמה הנגרמים על ידי הפרעה בתפקוד הטלומרים. בORDאה כדי לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש telomerase ביצירת גידולים, אנחנו שנוצרנו ערמונית PB-Cre4 G4 מודל גידול PTEN L / p53 L L / L LSL-mTERT L / L ומודל לימפומה T-cell הרתי G4 כספומט - / - mTERT ER / ER . הנתונים מראים כי הנציג מחדש telomerase ברקע של חוסר יציבות גנומית הנגרמת על ידי הפרעה בתפקוד הטלומרים יכול לשפר באופן משמעותי היווצרות גידול ב. הפרוטוקול מתאר גם את הנהלים המשמשים לבודד תאי גזע עצבי (NSCs) מmTERT-ER וLSL-mTERT עכברים ולהפעיל מחדש את פעילות הטלומרז בNSCs במבחנה. הנתונים מראים כי הנציג מחדש של הטלומרז יכול לשפר את יכולת התחדשות העצמית וneurogenesis במבחנה. לבסוף, הפרוטוקול מתאר את הנהלים לביצוע FISH הטלומרים (Fluorescence In Situ הכלאה) על שני FFPE העכבר (פורמלין קבוע וParafרקמות סנפיר Embedded) מוח וכרומוזומים metaphase של תאים בתרבית.

האסטרטגיות ליצירת mTERT-ER העכברי וLSL-mTERT לדפוק באללים תוארו באיור 1 א ו -1 B. באופן ספציפי, LoxP - בלם משולש - ניאו - בר LoxP הוכנס בין אקסון 1 ואקסון 2 של מוקד mTERT ליצור אלל LSL-mTERT. כדי ליצור אלל mTERT-ER, תחום ERT2-LBD במסגרת עם גן mTERT היה מוכנס לתוך N-הסופי של אקסון 1. הראינו כי כאשר הטלומרז היה מחדש זמני בעכברי תפקוד לקוי של הטלומרים תוך התייחסות אליהם עם כדורי 4-OHT במשך 4 שבועות, פנוטיפ ניוונית יכולים להשתפר באיברים רבים כגון המוח (איור 2 א) ואשכים (איור 2). על מנת לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש telomerase על תאים בתרבית במבחנה, אנחנו מבודדים תאי גזע עצביים (NSCs) מG4 הדור מאוחר LSL-mTERT וG4 mTERTעכברי -er. אנחנו הראיתי שכאשר הטלומרז היה מחדש בNSCs מתפקד הטלומרים, יכולת ההתחדשות העצמית של NSCs גדלה במידה רבה (איור 3 א), ובneurogenesis המבחנה גם היה משופרת באופן משמעותי (איור 3). על מנת לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש telomerase ביצירת גידולים בהקשר של חוסר תפקוד הטלומרים, שנוצרנו PB-Cre4 PTEN L LSL-mTERT / L (מודל ערמונית גידול) / p53 L L / L L והכספומט - / - mTERT ER / ER (מודל הרתי T-cell lymphoma) קבוצות דור מאוחר. כאשר הטלומרז היה מחדש על ידי הטיפול בטמוקסיפן בעכברים אלה עם הזרקה (איור 4 א) או כדורי 4-OHT במשך 8 שבועות (איור 4), יצירת הגידולים היו מאוד משופר בשני מודל הגידול בערמונית (איור 4 א) ודגם T-cell lymphoma הרתי ( <stron<html> g&gt; איור 4). לבסוף, דיווחנו פרוטוקולים של ביצוע FISH הטלומרים ברקמות מוח עכבר FFPE (איור 5) וכרומוזומים metaphase (איור 5, הבלעה). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> איור 1: (א) mTERT-ER לדפוק באסטרטגיה. טלוויזיה, מיקוד וקטור; WT, אלל סוג בר; KI, לדפוק באלל; LA, זרועו השמאלית; RA, יד ימין; E1, אקסון 1; E2, אקסון 2; ניאו, PGK אמרגן מונע גן עמיד נאומיצין; ER, קולטן אסטרוגן שונה יגנד (ERT2) מחייב תחום; DT, dyphteria גן רעלן. אסטרטגית LSL-mTERT (B) לדפוק ב. טלוויזיה, מיקוד וקטור; WT, אלל סוג בר; KI, לדפוק באלל; LA, זרועו השמאלית; RA, יד ימין; E1, אקסון 1; E2, אקסון 2; ניאו, PGK אמרגן מונע גן עמיד נאומיצין; פקק, שלושה רצפי תחנת תעתיק חוזרים ונשנים; DT, dyphteria גן רעלן. class = &quot;jove_content&quot; fo: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> איור 2: נציגי נתונים כדי להראות מחדש telomerase קילה פנוטיפים ניווניות של איברי נציג תמונות של מוח (משמאל). ואשכים (מימין) של עכברי G0 וG4 mTERT-ER שטופלו בפלצבו או 4-OHT במשך 4 שבועות. ברים בקנה מידה מצביעים על 50 מיקרומטר. Re-ההדפסה באישור 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> איור 3:. נציגי נתונים כדי להראות מחדש telomerase משפר התחדשות עצמית וneurogenesis של תאי גזע עצביים במבחנה () נציג תמונות של תאי גזע עצבייםs מבודדת מG4 LSL-mTERT (פנל עליון) וG4 mTERT-ER (פנל תחתון) גדל במדיום בתאי גזע שטופל ברכב או 4-OHT. (ב) נציג תמונות של במבחנה neurogenesis (Tuj1 +) של תאי גזע עצביים המבודדים מG4 mTERT-ER תרבית בינוני בידול (עם 1% FBS) שטופלה ברכב או 4-OHT. ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> איור 4:. נציגי נתונים כדי להראות מחדש telomerase משפר יצירת גידולים על רקע חוסר היציבות גנומית () נציג תמונות של גידולי ערמונית גזורים מG0 PB-Cre4 PTEN L / p53 L L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB- Cre4 PTEN L L p53 / L / L LSL-mTERT- / -, ו- L / p53 L G4 PB-Cre4 PTEN L טופל LSL-mTERT L / L / L בטמוקסיפן. להדפיס מחדש באישור 22. (ב) נציג תמונות של לימפומות T-cell הרתי גזור מG0 כספומט - / - mTERT + / ER, G4 כספומט - / - mTERT ER / ER טופל ברכב, וG4 כספומט - / - mTERT ER / ER טופל ב4- OHT במשך 8 שבועות. ברים בקנה מידה מצביעים על 1 סנטימטר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> איור 5: נציג תמונות של telomeric וFISH centromeric על רקמת עכבר FFPE המוח וmetaphase (הבלעה). אדום מציין DNA, ירוק מציין מכתים הטלומרים, וציאן מציין ceצביעת ntromere. ברים בקנה מידה מצביעים על 1 מ&quot;מ.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer at JoVE.com

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

ניצול Murine עין מתנהל הטלומרז אללים במחקרים של ניוון רקמה / התחדשות והסרטן

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Views.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

Video: Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

דגם orthotopic של סרטן שלפוחית ​​השתן Murine

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

Immunohistochemical המכתים של B7-H1 (PD-L1) בפרפין מוטבע-שקופיות של רקמת לבלב אדנוקרצינומה

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

דגם Murine פרה של גרורות כבדית

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

<em&gt; במבחנה</em&gt; תרדמת דגם של סרטן השד רגיש לאסטרוגן במוח העצם: כלי ללימודי מנגנון מולקולרי והשערת דור

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

דגם bm12 העין מתנהל של זאבת אדמנתית המערכתית (לופוס) בC57BL עכברים / 6

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

דגם Murine Orthotopic פרה-קליני של סרטן ערמונית האדם

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

ניתוח מועיל אפקטים של תוספי תזונה על פונקציות מעיים אפיתל מכשול במהלך ניסיוני קוליטיס

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

יצירת מודל של סרטן שד גרורתי Orthotopic מאתר וביצוע מאתר כריתה רדיקלית

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...