עבודה זו מומנה על ידי תוכנית קרן המדע הלאומית Genomics הסביבה (גרנט לא EF-0723707).

1. תא מיקרוביאלית Extraction: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize מחצלות חיידקים עם העלי שחיקה סטרילי על ידי ערבוב יסודי. כל מקום בערך 30 גרם (משקל רטוב) של חומר הומוגני מחצלת לתוך מיכל סטרילי של וורינג בלנדר, להוסיף כ 100 מ&quot;ל של 1 M NaCl (או ריכוז ספציפיים מדגם בשימוש), ואת תערובת שלוש פעמים במהירות בינונית במשך דקות עם 1 קירור לסירוגין מקפיא ° C -20 דקות 1. מעבירים את התערובת לתוך בקבוק 250 מ&quot;ל צנטריפוגות ולמלא את הריק הנותר עם נפח 1 M NaCl. הכן פתרון NaCl במים DI autoclaved ולסנן לעקר אותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף לסלק את התאים חיידקים מהמטריצה ​​על ידי רועדת (150 סל&quot;ד) באמצעות vortexer (וורטקס-Genie R 2) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות נמוכה (500x ז) במשך 15 דקות ב 4 ° C. בעדינות להעביר את supernatant לתוך בקבוק עם הפרעה מינימלית במשקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש משקעים pelleted, חזור מיזוג צעדים 1.2 ו 1.3 ארבע פעמים נוספות עם תוספת של NaCl טריים כל משקעים גלולה בסוף צעד 1.3. Supernatant מתוך מיצוי כל NaCl מועבר לתוך בקבוק טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את supernatants מתוך 5 עקירות התא צנטריפוגות ב aliquots של 200 מ&quot;ל במהירות גבוהה (25,000 XG) במשך 15 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant, resuspend כל תא גלולה ב 10 מ&quot;ל של נתרן hexametaphosphate 2%, לשלב כדורי ולעשות את הווליום עד 200 מ&quot;ל עם hexametaphosphate נתרן 2%. שטפו תאים על ידי רועדת (150 סל&quot;ד) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בסוף שלב זה אתה צריך רק צינור של תאים כדי להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות גבוהה (25,000 XG) במשך 15 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant, resuspend תא גלולה ב 200 מ&quot;ל של TE (50 mM EDTA), ולשטוף תאים על ידי רועדת (150 סל&quot;ד) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות גבוהה (25,000 XG) במשך 15 דקות ב 4 ° C, לבטל את supernatant, resuspend ב 15 מ&quot;ל TE (10 mM EDTA), ולאחסן 200 μL aliquots ב -80 ° C עד הדרוש DNA עקירות. </li></ol> 2. הפקת DNA וטיהור: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL 5 M NaCl, 200 SDS μL 10%, ו 100 μL 14.3 M β-mercaptoethanol את aliquot 200 μL התא של חיידקים. מערבבים בעדינות על ידי 4-6 פעמים היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת בכפוף ל 3 סיבובים של הפשרה, הקפאה באמצעות חנקן נוזלי שוקע בתוך 2 דקות ואחריה להפשרה אמבטיה 65 מעלות צלזיוס מים 5 דקות. הרחבת הסופי הפשרה על 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 אצטט μL 5 M אשלגן (pH 5.5) ומניחים על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב XG 10,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור חדש באמצעות טיפ רחב נשא פיפטה. הוסף 3 μL של RNase A ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים נפח שווה של כלורופורם, ללחוץ בקצרה על ידי היפוך, ו צנטריפוגות ב XG 15,000 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את השכבה העליונה של supernatant לתוך צינור חדש באמצעות טיפ רחב נשא פיפטה. הימנע pipetting שכבת ממשק לבן הממוקם בין שכבות העליון והתחתון. חזור על הליך כלורופורם-החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של צונן (ב -20 ° C) isopropanol את supernatant ו לדגור על קרח למשך 30 דקות כדי לזרז DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה על מהירות מרבית (20,800 XG) במשך 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף DNA גלולה עם 1 מ&quot;ל של צונן (ב -20 ° C) 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה על מהירות מרבית (20,800 XG) במשך 10 דקות ב 4 ° C, לבטל את supernatant, חזרו לשטוף אתנול 70%, אוויר יבש DNA גלולה במשך 10 דקות. חזור על לשטוף אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA Resuspend ב 25 TE μL (10 mM EDTA), חמים 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לשלב לתוך צינור אחד אם צינורות מרובים היו בשימוש, ואיפור נפח μL עם TE 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL קר כקרח (או 4 ° C) 20% פוליאתילן גליקול (PEG) (שהוכנו 1.2 M NaCl). מערבבים בעדינות על ידי היפוך, דגירה על קרח במשך 10 דקות, ו צנטריפוגה במהירות המרבית עבור 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה DNA. הסר להתעלמות supernatant לשטוף את ה-DNA pelleted עם 1 מ&quot;ל של אתנול 70% צונן, אוויר יבש 10 דקות, ו resuspend ב 30-50 μL TE או מים כיתה מולקולרית. להקל resuspension של ה-DNA על ידי ההתחממות על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו-DNA חנות ב -80 ° C. </li></ol> 3. טוהר ה-DNA, ריכוז ונחישות גודל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת איכות ה-DNA על ידי מדידת 260/280 ו 260/230 יחס באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop 1000 או כל מכשור מתאים אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז ה-DNA באמצעות קוואנט-IT ערכת dsDNA Assay על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת גודל ה-DNA באמצעות שדה הדופק ג&#39;ל אלקטרופורזה. הכן 1% agarose ג&#39;ל עם TBE 0.5X ולהשתמש הפרמטרים הבאים על Mapper השף XA המערכת; הזמן לעבור הראשונית של 0.35 שניות, זמן לעבור הסופי של 7.67 שניות, ו 120 ° כלול זווית שיפוע של 6.0 V / ס&quot;מ r ליניאריamping גורם. הכתם ג&#39;ל עם 1 x SYBR גרין אני למשך 30 דקות. טען בין 700-1000 מסך ng DNA על ג&#39;ל. ראה איור. עבור 3 בצורה מתומצתת של פרוטוקול מלא. </li></ol> נציג תוצאות: תא מיצוי: Sequential התא של חיידקים תמציות (supernatants) הראו כי עכירות של תמציות פוחתת ככל שמספר להגדיל עקירות. הדבר מצביע על ירידה במספר התאים הבאים מיצוי כל תא רצופים. חשוב לציין כאן כי כל צעד נוסף מיצוי תא מספק הזדמנות הקדמה זיהום, מספר תאים עקירות צריך להיות ממוזער כך שהתא גלולה הסופי הוא נציג של הקהילה חיידקים הכוללת. מקורות אחרים של זיהום נשלטו על ידי אימוץ טכניקות מעבדה מספיק סטרילית. למשל, הפתרונות הוכנו במים DI autoclaved ולסנן מעוקרים. מיכלי עוקרו עם אלכוהול, autoclaved, והתייחסו תחת אור אולטרה סגול UV ו crosslinker. ה-DNA ריכוז ונחישות איכות: פרוטוקול הניב כ -2 מיקרוגרם של HMW DNA (35-50 קילו) (איור 4) לגרם מדגם מחצלת עם יחס של 1.6 260/280, 260/230 ו יחס של 0.7 (טבלה 1). למרות יחס 260/230 שנראה נמוך, אין עיכוב יישום מולקולרית מבוסס במורד כגון הגברה-PCR של 16S rRNA גנים נצפתה במחקר נפרד 7. חשוב לציין כי ה-DNA מן hypersaline מחצלות יש שני מקורות עיקריים של זיהום; EPS ומלחים. לפיכך, ייתכן כי עקבות של חומרים מזהמים אלה עשויים להיות השפעה על יחסי 260/230 למרות מאמצים עצומים כדי לצמצם את השפעתם על יישומים זרם למטה. קביעת גודל ה-DNA: ג&#39;ל אלקטרופורזה דופק שדה מעסיקה זרימת הנוכחי פועמת עם מתגים כיוונית לסירוגין והתוצאה היא משטח ה-DNA כפי שמוצג באיור 3. פרוטוקול ה-DNA שלנו הניב HMW של כ 35-50 kb. בעוד כמה גודל DNA עשוי להיות קטן יותר מ -30 kb, חשוב להיות חלק למרוח מעל 35 kb בהתחשב בעובדה שיבוט fosmid דורש ~ 40 kb מחדיר דנ&quot;א שברי דנ&quot;א גדולים לספק גישה רחבה יותר מסלולים biosynthetic ללא פגע. במחקרים שלנו, למרוח את ה-DNA מעל 35 קילו היה נכרת וטיהר עבור שיבוט גדול להכניס וקטור ויישומים מולקולריים אחרים. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="איור 1"/> 1. איור חיידקים Hypersaline מחצלת דגימה באתר (בריכה גדולה) הממוקם על אליאותרה, Bahamas. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. חתך של המזרן חיידקים hypersaline השתמשו במחקר זה. מחצלת חיידקים התקבל בברכה hypersaline ממוקם על אליאותרה, Bahamas. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. ייצוג סכמטי של הליכים מעורבים מיצוי התא של חיידקים, תמוגה התא, חילוץ, טיהור של ה-DNA metagenomic. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. אפיון המשקל המולקולרי של הדנ&quot;א מופק באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה הדופק בתחום. ליין M הוא סמן HMW, ועל נתיבי 1 ו -2 הם משכפל הדנ&quot;א metagenomic שחולצו מן המחצלת אליאותרה hypersaline באמצעות פרוטוקול לעיל. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שיטת מיצוי </td><td></td><td> ריכוז ng / g </td><td> 260/280 </td><td> 260/230 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> הודעות 1 </td><td> 1806.1 </td><td> 1.64 </td><td> 0.76 </td></tr><tr><td></td><td> הודעות 2 </td><td> 2010.8 </td><td> 1.61 </td><td> 0.75 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מדידה של ריכוז ואיכות ה-DNA המופק מחצלת hypersaline מיקרוביאלי.

<ol>
	<li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms+in+intertidal+systems:+an+overview.">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li><li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats.">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li><li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments.">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li><li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials.">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li><li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples.">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li><li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis.">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li><li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats.">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li><li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+does+matter:+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics.">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology &#38; Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li><li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+the+Soil+Metagenomic:+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms.">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li><li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Rhodopsin:+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea.">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בהתחשב בכך הכולל הסרת תאים מדגימות מחצלת מורכב ומגוון מאוד של חיידקים אינה מעשית, הדאגה העיקרית היא באיזו מידה את התאים חילוץ לייצג את הקהילה הכוללת מחצלת מיקרוביאלי. במחקר קודם, ה-PCR-DGGE ניתוח של גנים 16S rRNA הראו כי חיידקים חמש הסרת תא צעדים להשתמש בפרוטוקול זה תמציות ת?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> פוליאתילן גליקול 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20% 1.2 M NaCl </td></tr><tr><td> אשלגן אצטט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td></td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> קוואנט-IT Assay dsDNA ערכת </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Epicentre </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> BDH כימיקלים </td><td> BDH8014 </td><td> מתאים קונצרט כלשהו. </td></tr><tr><td> Dodecyl סודיום סולפט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 03-500-509 </td><td> 10% מים </td></tr><tr><td> נתרן hexametaphosphate </td><td> EMD כימיקלים </td><td> SX0583-3 </td><td> 2% במים </td></tr><tr><td> TBE </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> השף Mapper XA מערכת </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> מדעי תעשיות בע&quot;מ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סגול Crosslinker </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> וורינג בלנדר </td><td> וארינג מעבדה </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of high molecular weight dna from microbial mats

ניתוח מוצלח ומדויק ופרשנות של נתונים metagenomic תלוי מיצוי יעיל של באיכות גבוהה, ה-DNA מולקולרי גבוה (HMW) במשקל הקהילה. עם זאת, דגימות מחצלת סביבתיים מהווים לעיתים קרובות בקשיים להשגת ריכוזים גדולים של ה-DNA באיכות גבוהה HMW,. מחצלות Hypersaline חיידקים מכילים כמויות גדולות של חומרים פולימריים תאיים (EPS) 1 ומלחים שעשויים לעכב יישומים במורד הזרם של ה-DNA חילוץ. שיטות ישיר וקשה משמשים לעיתים קרובות מיצוי דנ&quot;א מדגימות עקשן. שיטות אלה משמשים בדרך כלל משום למניה ב מחצלות, מטריצה ​​דבק, נקשר ה-DNA 2,3 במהלך תמוגה ישיר. כתוצאה שיטות מיצוי קשים, ה-DNA הופך מקוטעת לתוך בגדלים קטנים 4,5,6. ה-DNA ובכך הופך הולם שיבוט גדול להכניס וקטור. על מנת לעקוף את המגבלות האלה, אנו מדווחים על מתודולוגיה משופרת להפיק דנ&quot;א HMW באיכות וכמות טובה של מחצלות חיידקים hypersaline. אנחנו עובדים בשיטה עקיפה מעורבים הפרדת תאים מיקרוביאליים מהמטריצה ​​רקע מחצלת באמצעות מיזוג צנטריפוגה ההפרש. שילוב של נהלים מכני וכימי שימש כדי לחלץ ולטהר DNA מתאי חיידקים שחולצו. פרוטוקול שלנו התשואות כ -2 מיקרוגרם של HMW DNA (35-50 kb) לגרם מדגם מחצלת, עם יחס של 260/280 1.6. יתר על כן, הגברה של גנים 16S rRNA 7 עולה כי הפרוטוקול יכול להקטין או למנוע תופעות מעכבות של מזהמים. התוצאות שלנו לספק המתודולוגיה המתאימה החילוץ של ה-DNA HMW מ מחצלות חיידקים ללימודי metagenomic פונקציונלי עשויות לחול על דגימות סביבתיות אחרות שמהן מיצוי DNA הוא מאתגר.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats at JoVE.com

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

אנו מספקים פרוטוקול משופר לחילוץ משקל מולקולרי גבוה DNA של חיידקים מחצלות hypersaline. תאים מיקרוביאלית מופרדים המטריצה ​​מחצלת לפני מיצוי DNA וטיהור. זה משפר את הריכוז, איכות, גודל של ה-DNA. הפרוטוקול ניתן להשתמש בדגימות עקשן אחרים.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

extraction-of-high-molecular-weight-dna-from-microbial-mats

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Views.  Arnold School of Public Health, University of South Carolina. אנו מספקים פרוטוקול משופר לחילוץ משקל מולקולרי גבוה DNA של חיידקים מחצלות hypersaline. תאים מיקרוביאלית מופרדים המטריצה ​​מחצלת לפני מיצוי DNA וטיהור. זה משפר את הריכוז, איכות, גודל של ה-DNA. הפרוטוקול ניתן להשתמש בדגימות עקשן אחרים.

Video: Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Biology of Microbial Communities  - Interview

ביולוגיה של הקהילות מיקרוביאלית - ראיון

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

DNA Extraction from 0.22 &amp;mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucin Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ&quot;א הפקת DNA

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

שיטות ששונו לטעינת לוחות מיצוי DNA בתפוקה גבוהה להפחית את הפוטנציאל לזיהום

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...