1. היפוקסיה המושרה על ידי פתרון 2 CoCl קובלט (II) hexahydrate כלוריד (CoCl 2 • 6 שעות 2 O, מגה = 237.9) הוא inducer הכימי של היפוקסיה, גורם ועין מתנהלת 1.3-8. מוצר זה הוא מסיס במים (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל), מניב פתרון ברור, אדום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 25mm במים dd סטרילי, (להכין מיד לפני השימוש) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש CoCl 2 בריכוז הסופי של 100μM בתרבות המדיה שלך סדיר תא לגרום היפוקסיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את CoCl 2 מדיה המכילה תאים שלך דגירה התרבויות עבור 24hours בתוך חממה קונבנציונאלי (37 ° C; 2 C0 5%). </li></ol> הריכוז הנ&quot;ל עובד עבור שורות תאים בדקנו אבל כל שורת תאים יש לבדוק בריכוזים שונים (להקים עקומת המינון תלוי), כמו גם בזמנים דגירה שונים, במטרה לצמצם רעילות התרופה הקשורות לייעל את assay. 2. היפוקסיה המושרה מודולרי החממה הקאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לפחות שני בתרביות תאים זהים (תרבות תאומים). תרביות תאים יכול להיות צלוחיות, צלחות או כלים התרבות. כדי לפתוח את החדר, פתח תחילה את שני מהדק פלסטיק לבן הממוקם על צינורות המחוברים תא (צינורות המשמשים הזריקה / טיהור הגז hypoxic) בעדינות לפתוח את מהדק טבעת פלדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את מהדק. המכסה ומגשים כעת ניתן להסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התרבות התאים בתא hypoxic. כמו כן במקום צלחת פטרי המכילה מים סטריליים בחדר לספק humidification נאותה התרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תרבות &quot;התאום&quot; תא normoxia כמו שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא המגשים שלך מובטחות ולא נעים, ולאחר מכן סגור את תא עם מכסה שלו. נכונה עמדת מהדק טבעת פלדה כדי להבטיח את סגירת hermetical של החדר וסגור אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור היפוקסיה, לצרף את צינורות עד &quot;טנק היפוקסיה&quot; המכיל 1% O 2 תערובת הגזים. אם יש לך מד זרימת מחובר הטנק שלך בחדר שלך יהיה מחובר ישירות אליו (טנקים זרימת הגז מטר קאמרית). אנו משתמשים מד זרימת שולבו הרגולטור שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב להסיר את רוב אם לא כל הנוכחים חמצן בתא ובתקשורת שלך, לעשות זאת לשטוף את החדר על ידי פתיחת מיכל הדלק בקצב זרימה של 20 ליטר דקות 70-10 דקות, ואז מהר לכבות את דלק הזרימה לגמרי לסגור את חדר על ידי סגירת שני מלחציים לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את תא אל חממה קונבנציונאלי לתקופה הרצויה של זמן. אם אתה משתמש תרבויות גדולות, לאפשר התקשורת בתרבויות דה גז במשך 1-2 שעות ולאחר מכן חזור על לשטוף. הצעדים שלעיל מבוססים על המלצות בנאי &quot;(Billups-רוטנברג, Inc). הקפד מיכל הדלק מאובטחים כראוי בכל עת. </li></ol> הערות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסל את O 2 הכלול התקשורת מומלץ גז מחדש את החדר פעם אחת לאחר 1-3hours. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן הדגירה יותר 48hours מומלץ גם לחדר מחדש גז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיישני חמצן (אלקטרודות / מד הלחץ), אשר מאפשרים מדידות של O 2 הכלול תאים / תא תספק מדידה מדויקת יותר של תאיים / תא O 2 מכילים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים culturing ב אורכים זמן שונים כדי ליצור זמן עקומת יעזור לקבוע את הביטוי זמן אופטימלי של HIF-1α בתאים הספציפית שלך. </li></ul> 3. הערכה של היפוקסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HIF-1 α זיהוי על ידי כתם המערבי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח מחדש החדר שלך כמתואר בסעיף 2.2 ומיד המקום תרבויות שלך על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים שטופלו ולא טופלו היפוקסיה עם פתרון SDS 5% הצלחות מכן להעביר את lyzate התא צינורות, sonicate, spindown פסולת התא לאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת ריכוז חלבון באמצעות ערכת BCA, להכין מדגם ידי הוספת מאגר טעינת וחימום ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese חלבונים על ג&#39;ל SDS-polyacrylamide 8% ולהעביר ממברנות Nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה ב PBS המכילה 5% שומן חלב שאינו יבש 0.1% Tween 20 בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 ° C במשך הלילה על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunoblot לילה עם נוגדן אנטי-HIF 1α חד שבטיים העיקרית (1 / 600) במאגר באותו 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים PBS המכיל 0.1% Tween 20 בטמפרטורת החדר, 5min כל זמן דגירה עם נוגדן HRP-משנית (1 / 2000) ב-PBS + 0.1% Tween 20 דקות 45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים PBS המכיל 0.1% Tween 20 בטמפרטורת החדר, 5min / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פירס ECL ערכת רנטגן הסרט להראות את הלהקה חלבון </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלמנט Responsive היפוקסיה (HRE). HIF-1α מסדיר גנים רבים (כלומר VEGF, EPO) על ידי קשירה רצף שנקרא אלמנט הסדרת היפוקסיה (HRE). HRE שימוש הקשורים לגן סמן iלא ניתן לזהות פעילות HIF 9. כדי להשתמש בשיטה זו, תחילה עליך transfect התאים שלך עם HRE-בלוציפראז הפלסמיד בשיטת transfection מותאם לתאים. לדוגמה השתמשנו Lipofectamine 2000. תאים צריכים להיות transfected לפחות 4 שעות לפני כדי להיות מודגרות ב היפוקסיה ו normoxia. זמן זה מאפשר ה-DNA כדי להזין את התאים כך זה הצעד הראשון אינו מושפע היפוקסיה. האות בלוציפראז מזוהה באמצעות ערכת Assay בלוציפראז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים HRE-transfected שלך היפוקסיה בתא מודולרי או להשתמש HRE-transfected תאים מודגרות עם CoCl 2, כוללים שליטה normoxia. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה הרצויה, להסיר בינוני צמיחה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים PBS, להסיר את PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 400μl מגיב תמוגה 1X לתוך צלחת תרבות לגרד תאים המצורפת, ולאחר מכן להעביר אותם צינורית המיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה פסולת על ידי צנטריפוגה קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20μl מיקס של התא lysates supernatant עם 100μl של מגיב Assay בלוציפראז ולמדוד את הארה באמצעות luminometer. </li></ol></li></ol> 4. נציג תוצאות: ב K562 תאים (קו אנושי תא לוקמיה) בתרבית 2 ימים חמצן נמוכה, לעומת normoxia, היפוקסיה גורם גידול של החלבון HIF-1α כי זוהה על ידי כתם המערבי (איור 1). שימוש ב-HRE בלוציפראז שונה 293 תאים (קו עובריים כליות) בתרבית היפוקסיה, עלייה משמעותית של פעילות HIF-1α זוהתה בתאי hypoxic (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1: הגדלת HIF-1α בתאים hypoxic. K562 התאים היו תרבות normoxia ו היפוקסיה (חוסר חמצן קאמרית) עבור 48 שעות ונותחו על ידי כתם המערבי באמצעות נוגדן ספציפי HIF-1α. נוגדנים ספציפיים עבור אקטין שימש לשלוט הטעינה. <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="איור 2"/> Figure2: HIF-1α פעילות. HRE-בלוציפראז שונה היו 293 תאים בתרבית היפוקסיה ו normoxia עבור 48 שעות ו lysed אז לזהות אות בלוציפראז באמצעות ערכת assay בלוציפראז ו luminometer. תוצאות באים לידי ביטוי כיחידה הארה יחסית (RLU).

<ol>
	<li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer.">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li><li>van Laarhoven, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+in+relation+to+vasculature+and+proliferation+in+liver+metastases+in+patients+with+colorectal+cancer.">Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).</li><li>Hockel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+pO2+predicts+survival+in+advanced+cancer+of+the+uterine+cervix.">Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix.</a> Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1+and+human+disease:+one+highly+involved+factor.">HIF-1 and human disease: one highly involved factor.</a> Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1:+master+regulator+of+O2+homeostasis.">Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.</a> Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).</li><li>Tatum, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia:+importance+in+tumor+biology,+noninvasive+measurement+by+imaging,+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy.">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).</li><li>Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF+at+a+glance.">HIF at a glance.</a> J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).</li><li>Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoCl2,+a+chemical+inducer+of+hypoxia-inducible+factor-1,+and+hypoxia+reduce+apoptotic+cell+death+in+hepatoma+cell+line+HepG2.">CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2.</a> Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).</li><li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+(FOXO3a).">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

התפשטות תאים הכדאיות בתנאים hypoxic להשתנות הרבה בהתאם לסוגי תאים. לכן, כדאי להתאים את מספר הנייד או מספר צלחות תרבויות אתה מתחיל עם לוודא יהיה לך מספיק תאים / חלבונים עבור הניסויים שלך. השיטה קובלט כלוריד יש את היתרון להיות זול ומהיר. מוצר זה מחקה היפוקסיה ידי גרימת HIF-1/3α אך ניתן גם להסדיר גנים אחרים, יש לוודא כי מוצר זה להתאים את הפרוייקט על ידי בדיקת מה תופעות אחרות זה היה יכול להיות על התפקוד ואת הפנוטיפ של תאים מסוימים באופן עצמאי של &quot;לחקות- אפקט hypoxic &quot;. עוד תרופה המשמשת גם לחקות היפוקסיה היא mesylate Deferoxamine (DFO, השתמשו בריכוז 100 מיקרומטר הסופי). השימוש בתרופות אלה מאפשר experimentator כדי לפתוח את צלחת תרבות / תבשיל / בקבוקון פעמים רבות מבלי להשפיע על &quot;מצב hypoxic&quot;. רמת החמצן הכלול תערובת הגז יכול להשתנות בהתאם הניסויים שלך סוגי תאים כערכים היפוקסיה להשתנות בהתאם הרקמות סוגי תאים. ואכן, תאים מסוימים hypoxic ב 5% O 2 צריך אחרים פחות מ 1% O 2 להיות hypoxic. 5% CO 2 הוא הוסיף תערובת הגז כדי לייצב את pH של התרבויות, שאר הגז הוא בדרך כלל חנקן. לתאי hypoxic יש את היתרון של שימוש בסמים לא יכול חלופי התנהגות התא עצמאי של מתח החמצן. עם זאת, לא כל סוגי ניסויים אפשר לעשות כמו חמצן החוזרת בפתיחת כל תא ובכך מפחית היפוקסיה. אתה צריך לשקול גורם זה בניסויים שלך; היפוקסיה / מחדש חמצון הוא מצב ספציפי אשר יכולים להשפיע על כמה סוגי תאים. חלופה היא להשתמש בתחנות עבודה היפוקסיה (מחובר טרום מעורבת בלוני גז או למערכות גז ערבוב) או היפוקסיה אינקובטור גדול (תא עיבוד היפוקסיה עם תא הכפפות) המאפשר ניסויים לשנות את התקשורת ולטפל תאים בסביבה hypoxic רציפה. לתאי hypoxic שונים כבר ממוסחר בעשור האחרון ו צריכים להיבחר על פי המעבדה שלך בשימוש, פרויקטים, מרחב, גודל התקציב. תמיד להבטיח את השימוש במצב טוב של החדר שלך כדי להבטיח את התנאים תרבות נכונה. באופן כללי בעת שימוש קאמרית, רמת היפוקסיה יכול להיות מווסתת על ידי בחירת תערובות גזים שונות (כלומר 1%, 5% -10% חמצן). לגבי זיהוי של HIF-1α, חשוב לדעת כי חלק קו תאים סרטניים לבטא HIF-1α ב normoxia. לכן זה קריטי להשתמש normoxia שליטה לקבוע את רמת הבסיס של HIF אלה שורות תאים. HIF-1α יכול גם להיות נוכח normoxia שאינם תאים ממאירים הבאים גירוי התא או מתח. זה יכול להתרחש גם אם תאים אלה הם מורעבים, ודא בתרביות תאים שלך כמו שצריך להאכיל ומתוחזק.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Anti-HIF-1α </td><td> Invitrogen </td><td> 458400 </td></tr><tr><td> קובלט (II) כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> C8661-25 גרם </td></tr><tr><td> החממה הקאמרית </td><td> Billups-רוטנברג </td><td> MIC-101 </td></tr><tr><td> HRE-בלוציפראז פלסמיד </td><td> Adgene </td><td> פלסמיד 26731 </td></tr></tbody></table>

induction and testing of hypoxia in cell culture

היפוקסיה מוגדרת הפחתה או חוסר חמצן איברים, רקמות, או תאים. זו ירידה של מתח החמצן יכול להיות בשל אספקת חמצן מופחת (סיבות כוללות כלי דם מספקת הרשת, כלי דם פגומים, ואנמיה) או לצריכה מוגברת של חמצן ביחס לאספקת (הנגרם על ידי קצב התפשטות פתאומית גבוהה התא) . היפוקסיה יכול להיות פיזיולוגי או פתולוגי כגון סרטן מוצק 1-3, וכו &#39;שגרונית, דלקת פרקים טרשת עורקים ... כל רקמות ותאים יש יכולת שונה להסתגל למצב החדש הזה. במהלך היפוקסיה, גורם היפוקסיה ועין מתנהלת אלפא (HIF) הוא התייצב מסדיר גנים שונים כגון המעורבים אנגיוגנזה או הובלה של חמצן 4. ההתייצבות של חלבון זה הוא סימן ההיכר של היפוקסיה, ולכן גילוי HIF משמש באופן שגרתי למסך עבור 5-7 היפוקסיה. במאמר זה, אנו מציעים שתי שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים יונקים בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תאים אלה.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture at JoVE.com

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

כאן אנו מציעים שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים ו בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תרבויות.

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

induction-and-testing-of-hypoxia-in-cell-culture

Research

JoVE Journal

Biology

84.5K Views.  Baylor College of Medicine. כאן אנו מציעים שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים ו בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תרבויות.

Video: Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

תרבות עצבית עכבר מקדימים לתאי גזע

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of an antigen against which the immune system has been primed. The inflammatory reaction is characterized by redness and swelling of the site of antigenic challenge. It is a convenient model to determine the in vivo efficacy of immunosuppressants. Cutaneous DTH can be induced either by adoptive transfer of antigen-specific T lymphocytes or by active immunization with an antigen, and subsequent intradermal challenge with the antigen to induce the inflammatory reaction in a given skin area. DTH responses can be induced to various antigens, for example ovalbumin, tuberculin, tetanus toxoid, or keyhole limpet hemocyanin. Such reactions can also be induced against autoantigen, for example to myelin basic protein (MBP) in rats with experimental autoimmune encephalomyelitis induced with MBP, an animal model for multiple sclerosis (1).
Here we demonstrate how to induce an adoptive DTH reaction in Lewis rats. We will first stimulate ovalbumin-specific T cells in vitro and inject these activated cells intraperitoneally to naive rats. After allowing the cells to equilibrate in vivo for 2 days, we will challenge the rats with ovalbumin in the pinna of one ear, while the other ear wil receive saline. The inflammatory reaction will be visible 3-72 hours later and ear thickness will be measured as an indication of DTH severity.

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T (TEM) lymphocytes. Here we demonstrate how to activate antigen-specific TEM cells, induce adoptive DTH in Lewis rats and monitor the inflammatory response.

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-Type המאמצת בחולדות

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

חלבון C-FOS איתור immunohistological: כלי שימושי כסמן של מסלולים מרכזיים המעורבים בתגובות פיסיולוגיות ספציפיות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; RNA הנפתח ב adipocyte תרבות

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...