הודות Anseth קריסטי במעבדה של אוניברסיטת קולורדו בבולדר בנדיבות עבור אספקת MIN6 תאים. המימון לפרויקט זה סופק על ידי NSF.

1. PEGDM סינתזה PEGDM photoactive macromer הכנה פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 2g של PEG (ליניארי, 10,000 Da) לתוך בקבוקון זכוכית 40mL עם מכסה פלסטיק קשיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כ 308μL של אנהידריד methacrylic ואת כובע רופף את הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוגל את הבקבוקון על גבוה למשך 2 דקות במיקרוגל ביתי רגיל. חום לבישת כפפות עמידות, מערבולת ביסודיות את הבקבוקון, אז מיקרוגל גבוה עבור 5 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לאפשר הבקבוקון להתקרר מספיק כדי להיות מטופלים עם כפפות. פותח את הפקק לאט להוסיף מתילן כלוריד בעוד מתערבל את הבקבוקון. הוסף מספיק כך שהפתרון נראה ברור ואחיד, vortexing המדגם לפי הצורך. ההיקף הכולל של מתילן כלוריד המשמש צריך להיות 1.5-2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PEGDM המשקע ב 200 מ&quot;ל של קר, עוררה אתר diethyl ידי הוספת dropwise פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את PEGDM על ידי סינון ואקום ולאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את PEGDM בסכום הולםמים deionized (בדרך כלל 100 -150 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze הפתרון נגד מים deionized במשך 5 ימים בצינור דיאליזה בעל משקל מולקולארי חתך של 1000 Da. החלף את המים פעם ביום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot הפתרון לתוך מכולות מתאים להקפיא ב -80 מעלות למשך הלילה. Lyophilize הפתרון במשך 4 ימים להניב מטוהרים לבן אבקת PEGDM. אחסן את האבקה על 4 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון PEGDM photoactive, תחילה להכין 0.5 אחוזים במשקל photoinitiator פתרון המניות על ידי המסת Irgacure 2959 במים deionized. הפתרון וורטקס ולאחסן אותו בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PEGDM 10 wt% ו 0.025% wt Irgacure 2959 פתרון תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS). וורטקס ביסודיות כדי להבטיח פירוק PEGDM. אנחנו בדרך כלל להכין 1mL של פתרון זה בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק לתוך צינור microcentrifuge 1.8 מ&quot;ל. לעטוף את הצינור בנייר אלומיניוםולאחסן ב 4 ° C </li></ol> 2. תרבות, זיהומים, הצטברות של תאים MIN6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MIN6 תאים בתרבית בינוני 1640 RPMI בתוספת 10% FBS, גלוקוז 7mm, 100 יחידות / מ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין, ועל 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל amphotercin B בסביבה humidified ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחרר את התאים מן השטח טופלו בקבוק תרבות, לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים עם 37 ° C סידן / מגנזיום ללא HBSS, לשאוב HBSS, ולאחר מכן להוסיף 2 מ&quot;ל של 37 ° C-EDTA טריפסין פתרון ולאפשר לתאים דגירה במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היטב בצנצנת את הצד של הבקבוק כדי להפיל את התאים ללא תשלום, ולאחר מכן להוסיף 8 מ&quot;ל של 37 ° C ו-בינוני במרץ פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה מקפיד שלא להכניס בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את התאים לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ&quot;ל ולבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer או תאים אחרים ספירת ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהכנת להדביק את התאים עם יצרניתהנגיף, תחילה לקבוע את המספר הכולל של תאים להיות נגוע לחשב את עוצמת הקול של השעיה וירוס הנדרש כדי להשיג את הרצוי ריבוי של זיהום (משרד הפנים) (5-10 חלקיקים זיהומיות לכל תא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנגיף HBSS בקפידה על ידי pipeting את הכמות הנכונה של השעיה וירוס לתוך נפח טרום aliquoted של HBSS בתוך צינור microcentrifuge 1.8 מ&quot;ל. 50 μL של HBSS לכל טוב של תאים צבירה המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר את התאים על ידי pipeting אותם למעלה ולמטה הצינור שלהם, אז pipet נפח הדרושים כדי להשיג 400,000 תאים לכל גם לתוך הבארות של צלחת 6-היטב בתרבות ההשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מתאים של הנגיף מדולל היטב כל אחד כדי להשיג את הרצוי משרד הפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני עד טוב כל כדי להביא את הנפח הכולל של עד 1.7 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית בתוך האינקובטור. הגדר את שייקר על הגדרה נמוכה, כך המדיום בעדינות שוטף סביב בארות (~ 100 סל&quot;ד). אפשר את התאים aggregate עבור 24-36 שעות. המצרפים בקוטר משוער של 75-175 מיקרומטר צריך להיווצר. </li></ol> 3. Encapsulation של תאים PEGDM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים עשויים להיות במארז כמו פיזור (שלב 2.4) או צבירת הבא (שלב 2.10). מאז מבשר הידרוג פתרון PEGDM הוא נוזל, תאים נוטים להתיישב לפני crosslinking היווצרות הידרוג&#39;ל. אם ליישוב צפויה להתרחש במהירות, כגון עם אגרגטים גדולים יותר, זה עשוי להיות מועיל כדי לייצר את הידרוג בשני שלבים, כך התאים ליישב למישור המרכזי של הג&#39;ל. צעד אחד סינתזה הידרוג הליך מתאים תאים מפוזרים מוצג (איור 2) ואת הליך בן שני שלבים מוצג היטב (איור 3) ו המפורטים להלן (3.2-3.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת כלי שבו הידרוג תוקם על ידי חיתוך קצה נמוגו של מזרק פלסטיק 1 מ&quot;ל ו הצבתו לפתוח בסופו של דבר במעמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 Pipet μL של PEGDM photoactive כךlution אל הקצה הפתוח של המזרק על הבוכנה לוודא נפח מכסה את פני הבוכנה כולה. התאם את הבוכנה במרווחים קטנים על מנת להשיג משטח שטוח נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את pipet במעמד ולמקם את מתלה מתחת מנורת UV (365nm, ~ 7 mW / cm 2) למשך כ 8 דקות, כדי לאפשר crosslinking הידרוג&#39;ל. במהלך תקופה זו, הכנה של תאים עשויה להיות החל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח Pipet המכיל את המספר הרצוי של תאים / אגרגטים לתוך צינור 1.8 microcentrifuge מ&quot;ל, כובע, ו צנטריפוגות התחתית 130 גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micropipettor, להסיר בזהירות את התקשורת מבלי להפריע לתא גלולה בקצה הצינור. כאשר ראש התקשורת מתקרב גלולה, זה עשוי להיות מועיל להשתמש עדינה, 10 טיפ pipet μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend התא גלולה ב 20 μL של פתרון photoactive PEGDM (משתמש קצה פעורת פה pipet אם עובדים עם אגרגטים) ולהוסיף את ההשעיה התא המזרק על גבי הדואר crosslinked בעבר חלק הידרוג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את המזרק עד 8 דקות נוספות של אור UV להשלים את הבנייה של הידרוג. בסיום, התאים צריכים להיות במארז מלא בתוך הידרוג גלילית (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את הידרוג מן המזרק לתוך 1 מ&quot;ל של HBSS היטב הצלחת 24 באר בקצרה לשטוף את הג&#39;ל. מעבירים את הג&#39;ל על 1 מ&quot;ל של התקשורת גם הצלחת 24 באר ותרבות בתנאים הרצוי. </li></ol> 4. היפוקסיה מעקב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב כלשהו במהלך התמונה תרבות, התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר תחילת איתות hypoxic. תלוי מה נעשה הדמיה ניתן התמונה צלחת רב היטב או להעביר את הג&#39;ל אל המיקרוסקופ שקופית לפני ההשמה על הבמה מיקרוסקופ. עירור שיא של Ds האדום מושגת ב 556nm ופליטה השיא מתרחש 586nm. פליטה חזקה למדי ולכן photobleaching לא היה observאד להיות בעייתי. זמן השהיה בין תחילת ייצור החלבון וזיהוי האות הראשונה היא כ 12 שעות. אות הוא ספציפי מספיק כדי לזהות תאים איתות בודדים, אבל ההחלטה עשויה להיות מספקת לצורך קביעת לוקליזציה אותות תאיים. בתאים איתות, אות הוא נצפה בדרך כלל בצורה אחידה בכל בציטופלסמה. עוצמת האות ניתן גם להגדיל את החשיפה המורחבת היפוקסיה, למרות שאנחנו עדיין לא נקבע באופן מלא אם זה נובע ביטוי חלבון מוגברת, הצטברות חלבון הכוללת, או חלבון התבגרות מאוחרת. </li></ol> 5. נציג תוצאות למשל נציג MIN6 אגרגטים הגלום הידרוג PEG מוצגת באיור 4. ג&#39;ל crosslinked יהיה מוצק לאורך, לוקח את הצורה של הכלי שבו התגובה בוצעה. ג&#39;ל עם המשטחים החיצוניים חלקים עדיפה להשתלה כדי לסייע למניעת מחדש גוף זרsponse. בתוך הג&#39;ל, אגרגטים התא צריך להיות סגור לגמרי במטריצה ​​ומופץ homogenously כדי לאפשר תחבורה מזין יותר. תמונות נציג איתות hypoxic ב MIN6 אגרגטים הם בתמונה באיור 5. זהים MIN6 אגרגטים נגוע בווירוס סמן היו בתרבית או 20% O 2 (5 א) או 1% O 2 (5 ב) עבור 44 שעות לפני לכידת תמונה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של פעילות של מערכת סמן היפוקסיה שלנו. הכניסה adenoviral של האדום Ds DR גנים האמרגן הזרם HRE מאפשר ייצור היפוקסיה-Induced של חלבון פלואורסצנטי תחת שליטה של ​​HIF-1. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg" /> באיור 2. תרשים זרימה פרוצדורלי אנקפסולציה צעד יחיד של התפזרו MIN6 תאים CRosslinked הידרוג PEGDM. עבור כל ג&#39;ל, התאים מפוזרים הם תלויים 40μL של הפתרון PEGDM photoactive macromer. זה ממוקם מזרק 1mL ערופה לבין הידרוג נוצר תחת אור UV 365nm לאחר 10-12 דקות. בסיום, הדיסק הידרוג יוסר המזרק, שטף והניח בצלחת בינוני מלא גם עבור הדגירה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg" /> באיור 3. תרשים זרימה פרוצדורלי אנקפסולציה כפול צעד של MIN6 התאים מצטברים הידרוג PEGDM crosslinked. עבור ג&#39;ל כל חצי ג&#39;ל נוצר לראשונה על ידי crosslinking UV של 20μL של הפתרון PEGDM macromer photoactive במשך 8 דקות. MIN6 אגרגטים מושעים בקפידה 20μL נוספת של פתרון photoactive macromer אשר מתווסף על גבי ג&#39;ל וחצי מראש יצרו. הג&#39;ל מלא נוצרת על ידי 8 דקות נוספות של חשיפה UV עם אגרגטים במארז מלא המדיאלימטוס של הג&#39;ל. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg" /> איור 4. מקדימה של הידרוג 40μL בהגדלה 20X. MIN6 אגרגטים (~ 400,000 תאים בסך הכל) נראים בבירור בתוך הג&#39;ל. קוטר Hydrogel הוא כ 6 מ&quot;מ (בר = 1mm). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg" /> איור 5. היפוקסיה פלורסנט איתות MIN6 התאים מצטברים הידרוג PEGDM. תאים שהיו במארז והניח אז הדגירה 20% O 2 במשך 44 שעות לא יוצגו איתות היפוקסיה (א) תוך התאים היו ארוזים אז מודגרות ב 2% O 2 במשך 44 שעות להציג איתות ברור, בכל מקום. (בר = 100μm) (ב).

<ol>
	<li>Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allotransplantation+of+the+pancreas+and+duodenum+along+with+the+kidney+in+diabetic+nephropathy.">Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy.</a> Surgery. 61, 827-837 (1967).</li><li>Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+trial+of+the+Edmonton+Protocol+for+islet+transplantation.">International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation.</a> N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).</li><li>Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+microencapsulated+islet+cells+as+a+bioartificial+pancreas.">Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas.</a> Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).</li><li>Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+microencapsulated+islets+in+agarose+gel+as+bioartificial+pancreas+by+studies+of+hormone+secretion+in+culture+and+by+xenotransplantation.">Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation.</a> Diabetes. 39, 224-225 (1989).</li><li>Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purity+of+alginate+affects+the+viability+and+fibrotic+overgrowth+of+encapsulated+porcine+iselt+xenografts.">Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts.</a> Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).</li><li>Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+PEG+dimethacrylates+and+their+hydrogels.">Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels.</a> Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).</li><li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+&#x03B2;-cell+microenvironments.">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled &#x03B2;-cell microenvironments.</a> Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).</li><li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function.">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).</li><li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+properties+influence+ECM+production+by+chondrocyte+photoencapsulated+in+poly(ethylene+glycol)+hydrogels.">Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).</li><li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH/3T3+fibroblasts+in+vitro.">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).</li><li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oxygen+on+isolated+pancreatic+tissue.">Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue.</a> Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).</li><li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hypoxia+on+insulin+secretion+by+isolated+rat+and+canine+islets+of+Langerhans.">Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42, 12-21 (1993).</li><li>De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+encapsulated+rat+pancreatic+islets+to+hypoxia.">Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia.</a> Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).</li><li>Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S, J. O., Blanchette, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+hypoxia+with+insulin+secretion+using+a+fluorescent+hypoxia+detection+system.">Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).</li><li>Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. y. p. o. x. i. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hypoxia-inducible+factors+(HIF),+HIF+hydroxylases+and+oxygen+sensing.">hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing.</a> Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המוצגת כאן מציעה שיטה מהירה ופשוטה אנקפסולציה תא הידרוג PEG עם שימוש מינימלי ללא תנאים פיזיולוגיים. PEG מהווה חומר אנקפסולציה מאוד שימושי עבור biocompatibility שלה וקלות שינוי. וריאציה פשוטה של ​​אחוז PEG בפתרון photoactive, למשל, ניתן להשתמש כדי להתאים את תכונות מכניות, כגון מודולוס דחיסה, ומאפיינים הובלה באמצעות גודל הנקבוביות. כמו כן, PEG הוא לשנות בקלות על ידי תוספת של שרשראות צד. הידרוג PEG, אם כן, מייצגים הן מכשיר קליני מבטיח פלטפורמה גמישה עבור במבחנה מחקר שיטה למעקב אחר היפוקסיה ב-PEG הגלום בתאים יש גם הציג. שיטה זו שימושית עבור הפשטות של זיהוי היפוקסיה ועל נמנע הצורך להקריב את התאים של עניין. הטכניקה ניתן ליישם במגוון רחב של סוגי תאים מגוון רחב של מצבים שהופך אותנו שלהefulness רחב. למשל, היפוקסיה כרמז על התמיינות בתאי גזע עשוי להיות במעקב בתא תרבויות גזע micromass. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת רק כדי לפזר מערכות תא או מערכת שבה פזורים תאים מצטבר מאוחר יותר. כמו כן, זיהוי של אות ניאון עלול להיות קשה ברקמות גדול יותר או צפופים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות (אופציונלי </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 309,028, 500 גרם </td><td></td></tr><tr><td> Methacrylic אנהידריד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276,685, 100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוגל </td><td> אמרסון </td><td> MW8784SB </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> תעשיות מדע </td><td> Si-A236 </td><td></td></tr><tr><td> מתילן כלוריד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D65100-1L </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl Ether </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 346136-1L </td><td></td></tr><tr><td> דיאליזה Tubing </td><td> ספקטרום </td><td> 132640 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> מעבדות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מקפיא </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7670521 </td><td></td></tr><tr><td> משאבת ואקום </td><td> וולש </td><td> 8917Z-01 </td><td></td></tr><tr><td> Irgacure 2959 </td><td> Ciba-Geigy </td><td> 029891301PS04 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Mediatech </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> מזרק Filter </td><td> VWR </td><td> 28145-477 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> * </td><td> * מנהג ניסוח </td></tr><tr><td> FBS </td><td> PAA מעבדות </td><td> ת 15-351 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Mediatech </td><td> 30-003-CF </td><td></td></tr><tr><td> מדגרה </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3597 </td><td> NAPCO סדרה 8000 WJ w / O2 דיכוי </td></tr><tr><td> טריפסין EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-052-CI </td><td></td></tr><tr><td> Orbital שאכר</td><td> VWR </td><td> 12620-926 </td><td></td></tr><tr><td> מנורת UV </td><td> Sanyo Denri </td><td> FLR40SBLB / M </td><td> מחזיק בשתי 40W, 365nm כחול blacklight נורות UV </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Eppendorf </td><td> 5811 000.010 * </td><td> * סדר מספר. דגם R 5810 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> TI-ND6-PFS </td><td> עם filterset עבור עירור 556nm / פליטה 586nm </td></tr></table>

tracking hypoxic signaling within encapsulated cell aggregates

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.
Biologically-derived materials, such as alginate3 and agarose4, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth5 which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue10. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.
An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact &beta;-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated14. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling15. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously15. The virus is stored in 10% glycerol at -80&deg; C as many 150 &mu;L aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 1010 pfu/mL. 
Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion15. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1&alpha; for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates at JoVE.com

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

שיטה אנקפסולציה, צילום של תאים הידרוג PEG crosslinked מתואר. איתות hypoxic בתוך insulinoma Murine במארז (MIN6) אגרגטים הוא מעקב באמצעות מערכת סמן פלואורסצנטי. מערכת זו מאפשרת בחינה סדרתי של תאים בתוך הידרוג הפיגום המתאם של איתות hypoxic עם שינויים פנוטיפ התא.

איתות hypoxic מעקב בתוך תא מצרפי Encapsulated

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

tracking-hypoxic-signaling-within-encapsulated-cell-aggregates

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.6K Views.  University of South Carolina. שיטה אנקפסולציה, צילום של תאים הידרוג PEG crosslinked מתואר. איתות hypoxic בתוך insulinoma Murine במארז (MIN6) אגרגטים הוא מעקב באמצעות מערכת סמן פלואורסצנטי. מערכת זו מאפשרת בחינה סדרתי של תאים בתוך הידרוג הפיגום המתאם של איתות hypoxic עם שינויים פנוטיפ התא.

Video: Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as cyclodextrin nanosponges (CDNSEDTA). Two different preparations are described with 1:4 and 1:8 CD-EDTA molar ratios. The corresponding cross-linked polymers were contacted with 0.27 M aqueous solution of ibuprofen sodium salt (IP) leading to homogeneous, colorless, drug loaded hydrogels.
The systems were characterized by high resolution magic angle spinning (HR-MAS) NMR spectroscopy. Pulsed field gradient spin echo (PGSE) NMR spectroscopy was used to determine the mean square displacement (MSD) of IP inside the polymeric gel at different observation times td. The data were further processed in order to study the time dependence of MSD: MSD = f(td). The proposed methodology is useful to characterize the different diffusion regimes that, in principle, the solute may experience inside the hydrogel, namely normal or anomalous diffusion. The full protocols including the polymer preparation and purification, the obtainment of drug-loaded hydrogels, the NMR sample preparation, the measurement of MSD by HR-MAS NMR spectroscopy and the final data processing to achieve the time dependence of MSD are here reported and discussed. The presented experiments represent a paradigmatic case and the data are discussed in terms of innovative approach to the characterization of the transport properties of an encapsulated guest within a polymeric host of potential application for drug delivery.

The motion regimes of ibuprofen encapsulated in &#946;-cyclodextrin nanosponges polymer network are investigated using pulsed-field-gradient spin-echo (PGSE) NMR technique. Synthesis, purification, drug loading, implementation of the NMR pulse sequence and data analysis to work out the mean square displacement of the drug at several observation times are described in detail.

מאפיינים התחבורה של איבופרופן הגלום Cyclodextrin Nanosponge הידרוג: מחקר ספקטרוסקופיה Proton HR-MAS NMR

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

משלוח הממברנה ממוקד על Encapsulated מטענים הידרופובי בנושאת Nanoparticle קריסטל נוזלת

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...