The authors acknowledge funding sources responsible for this work: 5K12HD055929 (HHR), 5R01NS080180-02 (DDF).

הערה: כל נהלי בעלי החיים בפרוטוקול זה מתבצע באישור אוניברסיטת פלורידה המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) ועומדת ב&#39;המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה &quot;. 1. יסוד הניסיון להגדיר לפני המינהל לסירוגין היפוקסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף גורים 12 לתערובות גז השונות באמצעות תאי plethysmograph עכבר כל גוף באותה הצורה כמו מכרסמים מבוגרים למטרות ניסיוניות אחרות 5,13,14. יש התאים בקוטר 4 אינץ &#39;(נפח = 450 מיליליטר), אשר הוא בגודל מספיק כדי להכיל 3-4 גורי עכבר או 1-2 גורי חולדה. הנה, פרוטוקולי AIH מועברים לילודים בגילים 1-8 יום הלידה (P1-P8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במכלי גז באוויר דחוס כדי לספק 21% גז &quot;בסיס&quot;, ששומר על תא חמצון על 21%. כדי להשיג &quot;היפוקסיה יחסית&quot;, להשתמש ב/ 90% טנק 10% חמצן גז חנקן. לאE: צינורות פלסטיק (קוטר 3/16 &quot;) מחברת את מיכלי גז לזרימת מטר. לפיכך, קלט מד הזרימה מורכב מצינור אחד לכל בסיס וזרימת אוויר היפוקסיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צינורות הגז כדלקמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל צינורות פלסטיק (קוטר 1/8 &quot;) ממד הזרימה לזרימת הטיה רגולטור, המאפשר תזרים של 1 ליטר / דקה לכל תא (כלומר, 4 L / min אם 4 תאים משמשים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל צינורות פלסטיק (קוטר 1/8 &quot;) מזרימת ההטיה הרגולטור לתאי plethysmography. זרימת אוויר בL 1 / דקה לכל תא הוא קצב זרימה קבוע מראש שבחילוף גזים נחשב להיות לבעלי החיים המבוססים על תצפיות פיסיולוגיות והתנהגותיות שאינו-גרימת לחץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את כל חיבורים שאינם בשימוש ומן זרימת ההטיה היחידה וכל פתחים שאינם בשימוש לתאי עם כובעים כדי שלא זרימת גז בורחת לתאי אחרים שאינו בשימוש, או מחוץ לתאי plethysmography במהלך הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר (ים) לחממה לפני לשים בעלי חיים בתא כדי לאפשר איזון עד 37 מעלות צלזיוס, או טמפרטורת גוף. </li></ol> 2. כיול של המחזור טיימס ללסירוגין היפוקסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את כל צינורות, בין מיכלי אוויר ומד זרימה, זרימת יחידת מטר וזרימת ההטיה יחידה, וזרימת הטיה וקאמרית plethysmography (ים) לחיבורים נכונים. החיבורים מוגדרים כמתואר בשלב 1. בדוק את החיבור על ידי בדיקת צעד חכם של כל הקווים והסגרים תיארו: למשל, בדיקת קווים שאינם בשימוש מחוץ לזרם ההטיה היחידה וכל פתחי תא אינו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר חיישן O 2 סביבה עם מד O 2 שנערך ביד ולאחר מכן לצרף את החיישן למכסה תא plethysmography. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את שני מיכלי הגז ולצרף זוג אחד של hemostats כירורגית, ידית ארוכה מבודד עם צינורות פלסטיק כדי לצבוט את הזרימה מחוץ למעגל הגז. בדרך זו, מיכל הדלק רק אחד בכל פעם הוא מספק L 1 / זרימת גז דקות לקאמרית. הצמד את התערובת &quot;קו הבסיס&quot; גז תוך שילוב &quot;חוסר חמצן&quot; הגז מועבר לתא, ולהיפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הזמן הנדרש לתא O 2 כדי להגיע לרמות היעד של 10% ולחזור ל -21%. לנצל את הזמנים שנרשמו למסירת פרוטוקול שלאחר מכן. </li></ol> 3. מינהל אקוטי לסירוגין היפוקסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את כל צינורות וחיבורים כמתואר בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח ילודים בתא plethysmography (ים) ולשכן את המכסים קאמריים plethysmography לבסיס קאמרי. לאשר חותם ראוי לחותם O-הטבעת היא כמו גם סגירת כל חיבורי תא שאינו בשימוש. צעדים אלה הם קריטיים על מנת להבטיח ההספקה המתאימה של תערובות גז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים מחזיקים את הגורים שיתייחסו אל 37 ° C החממה וסגור את הדלת. לאפשר קאמרי לאזן ל -37 מעלות צלזיוס לפני תחילת הפרוטוקול. לשמור על חיות שליטה על 37 מעלות צלזיוס בincubatאו בחמצון אוויר חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את שני מיכלי הגז ולהשתמש בזוג אחד של hemostats כירורגית, ידית ארוכה מבודד עם צינורות פלסטיק כדי לצבוט את הזרימה מחוץ למעגל הגז. בדרך זו, מיכל הדלק רק אחד בכל פעם הוא מספק L 1 / זרימת גז דקות לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטיימר כף יד למחזורים בדיוק זמן וכדי לציין את הזמן לעבור hemostats בין צינורות, ובכך וכתוצאה מכך לסירוגין של זרימת גז לתאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את השלמת כל מחזור באמצעות יומן טיפול כמו זה הניתן באיור 1 כדי לסמן את כל השלבים ב2-הצעד, 20 פרוטוקול המחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטר את הטמפרטורה בחממה בכל שינוי מחזור כדי להבטיח בעלי חיים נשמרים בטווח המיועד (33-35 מעלות צלזיוס, המהווה את ההגדרה בחממה שגורמת 37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרוב לעקוב אחר פעילות גור בכל הפרוטוקול, כדי להבטיח שבעלי חיים סובלים מחזורים ללא מצוקה גלויה כגון קולות, רמת שינה שלפעילות איבר או מתגלגל. </li></ol> 4. בידוד ותרבות של גזע / תאי אב מאזור Subventricular הערה: השינוי במבנה neurosphere הבא AIH השוואה לקבוצת ביקורת היא דוגמא לנקודת סיום שמדגים את היעילות של פרוטוקול זה כדי לעורר שינויים דקיקים וברמה-תאית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד neurospheres להרכיב תאים, להסיר גורי עכבר או עכברוש מהתא מייד לאחר AIH הושלם. להקריב בעלי החיים על פי פרוטוקולי IACUC בתוך 30 דקות של סיום פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את רקמת SVZ, מקום לתרבות neurosphere ולנהל מעבר והרחבת neurospheres הנגזר סטנדרטיים, כפי שפורסם בעבר בפרקי 15,16 ושיטות פרוטוקול וידאו נפרד 8. </li></ol>

<ol>
	<li>Studer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proliferation,+survival,+and+dopaminergic+differentiation+of+CNS+precursors+in+lowered+oxygen.">Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen.</a> J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).</li><li>Chen, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+regulates+survival+and+fate+of+mouse+central+nervous+system+precursors+at+multiple+levels.">Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels.</a> Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).</li><li>Ling, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+intermittent+hypoxia+elicits+serotonin-dependent+plasticity+in+the+central+neural+control+of+breathing.">Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing.</a> J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).</li><li>Mitchell, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+Intermittent+hypoxia+and+respiratory+plasticity.">Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity.</a> J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).</li><li>Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+long-term+facilitation+requires+5-HT+receptor+activation+during+but+not+following+episodic+hypoxia.">Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).</li><li>Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pathways+to+phrenic+motoneurons+are+enhanced+by+chronic+intermittent+hypoxia+after+cervical+spinal+cord+injury.">Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury.</a> J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).</li><li>Baker-Herman, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+is+necessary+and+sufficient+for+spinal+respiratory+plasticity+following+intermittent+hypoxia.">BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia.</a> Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).</li><li>Zhu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+rat+brain+after+intermittent+hypoxia.">Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia.</a> Brain Res. 1055, 1-6 (2005).</li><li>Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+exposure+to+intermittent+hypoxia+enhances+mice+performance+in+water+maze+and+8-arm+radial+maze+tasks.">Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks.</a> Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).</li><li>Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypoxia+on+the+proliferation+and+differentiation+of+NSCs.">Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs.</a> Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).</li><li>Ross, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intermittent+hypoxia+elicits+enhanced+expansion+and+neuronal+differentiation+in+cultured+neural+progenitors.">In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors.</a> Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).</li><li>Fuller, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+recovery+of+hypoxic+phrenic+responses+in+adult+rats+exposed+to+hyperoxia+for+the+first+month+of+life.">Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life.</a> J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).</li><li>Fuller, D. D., Fregosi, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatiguing+contractions+of+tongue+protrudor+and+retractor+muscles:+influence+of+systemic+hypoxia.">Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia.</a> J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).</li><li>Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+plasticity:+differential+actions+of+continuous+and+episodic+hypoxia+and+hypercapnia.">Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia.</a> Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).</li><li>Marshall, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+neurospheres+from+CNS+tissue.">Production of neurospheres from CNS tissue.</a> Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph...

מטרתה של שיטה זו היא reproducibly וביעילות כדי לספק התקפים לסירוגין של חמצן סביבה הורידה מערכתי למכרסמים בילוד. הרציונל לשימוש בהיפוקסיה לסירוגין (IH) כדי לתפעל ביולוגיה של תא גזע מקורו בניסויים בתרביות תאים במבחנה שבי O 2 תוכן של תקשורת הצמיחה משתנה. באופן ספציפי, בהשוואה לתנאים &quot;רגילים&quot; של 20% O 2, תרבות המורחבת של תאי אוכלוסיות תאי גזע / אב ב2 תוצאות O 3% בהתפשטות מוגברת, ירידה באפופטוזיס וגדל 1,2 תשואה עצבי. קבוצה זו יש לו ניסיון משמעותי עם הממשל של IH המערכתי, ובצעה מחקרים מקיפים על עצם את התפקיד של IH בפלסטיות הנשימה 3-7. עבודה זו, והממצא האחרון שIH הכרוני מוגבר neurogenesis במכרסמים במערכת העצבים המרכזית 8-10, מהווים את הבסיס לחקירה של חריף in vivoהיפוקסיה כגירוי נפשית מראש (כלומר., לפני קציר רקמות) על התרבות הבאה של תאי גזע עצביים / אב (NPCs) 11. למרבה הפלא, כאשר גורי עכבר נחשפו לתקופה (&lt;1 שעה) של היפוקסיה לסירוגין חריפה (AIH) קצרה, תאים שנקצרו מאזור subventricular (SVZ) שגדלו באופן משמעותי את היכולת להרחבה כneurospheres או תאי monolayer חסיד. פרוטוקול AIH היה קשור גם עם ביטוי מוגבר של גורם &quot;גורל עצבי&quot; שעתוק (Pax6). בהתאם לכך, בvivo פרוטוקולי AIH עשויים לספק אמצעים לNPCs לפני &quot;ראש&quot; התרבות. לדוגמא, יישומים לגישה זו יכולים לכלול הרחבת אוכלוסיות תאים לפני ההשתלה לתוך מערכת העצבים המרכזית נפצעה, או פשוט להגדיל את הבידול העצבי של תאים בתרבית לפני ניסויים במבחנה. יתר על כן, בגלל זה הוא משלוח מערכתי, כלאיבר, רקמה או תא הוא מועמד למחקר דומה. לכן, כפי שנכתב בפרוטוקול הוא פוטנציאל ישים למגוון רחב של מחקרים על מניפולציה חמצן לסירוגין ביונקים קטנים. ישנם יתרונות מסוימים לגישה זו. בעבודה שפורסמה אחרת, טופלו ילודים כהמלטה עם הסכר בתאי hypobaric, המאפשר למינון כרוני, פחות טיפול לפני הטיפול, ושמרו על קשר אימהי במהלך טיפול 9. הגישה הנוכחית עוקפת טיפולים חוזרים ונשנים לנקבת רבייה, או שימוש בסכר שונה עבור כל ניסוי. פרוטוקול זה גם מאפשר מחקר של ילודים בהתאמה המלטה וגיל בהתאמה מדויקים. נציגי נתונים להפגין את כוח עיקרי נוסף של פרוטוקול זה, כלומר המהירות שבה AIH, כפי שנמסר, מעורר תגובה ביולוגית חזקה ועקבית בביולוגיה של תא גזע עצבי. זה קובע תקדים לפרוטוקול זה כדי לעורר Biologi הדקיק וברמה-הסלולריתשינויי קאל שמשנים ביולוגיה של תא. דו&quot;ח זה מתאר את הנהלים מפורטים המשמשים לחשיפת גורי מכרסמים לAIH כמו גם ניתוח האוכלוסייה של תאי SVZ גדל כמו neurospheres.

<table><tbody><tr><td>Mouse plethysmography chambers</td><td>Buxco</td><td>PLY4211</td><td></td></tr><tr><td>Flow meter&amp;nbsp;</td><td>Porter</td><td>F150</td><td></td></tr><tr><td>Bias flow unit</td><td>AFPS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baseline Gas Mix</td><td>Airgas</td><td>AIZ300</td><td>Compressed Air</td></tr><tr><td>Hypoxic Gas Mix</td><td>Airgas</td><td>X03NI72C2000189</td><td>10% Oxygen, balance nitrogen</td></tr><tr><td>Oxygen Meter</td><td>Teledyne</td><td>AX-300</td><td></td></tr></tbody></table>

delivery of in vivo acute intermittent hypoxia in neonatal rodents to prime subventricular zone-derived neural progenitor cell cultures

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo &#8220;pre-conditioning&#8221; stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.

הניסויים הראשוניים, המבוססים על נתונים היסטוריים, נערכו באמצעות אורכי מחזור 1 דקות. בהתבסס על הכיולים הבאים מבוצעים בשלב 2 לעיל, נקבע כי O 2 הרמה בתא הייתה 13% בשטיפה לאחר היפוקסיה 1 דקות ו, שזה לקח זמן דומה כדי לחזור לנקודת ההתחלה של 21%. עם זאת, מחזור 2 דקות היה מספיק ל...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures at JoVE.com

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לניהול תקופות קצרות של היפוקסיה לסירוגין לגורי עכבר או עכברוש לאחר לידה היום 1-8. גישה זו ביעילות מעוררת רמה חזקה רקמה &quot;תחול השפעה&quot; על תאים עצביים בתרבית שנקצרים בתוך 30 דקות של חשיפת היפוקסיה.

משלוח<em&gt; In vivo</em&gt; חריפה לסירוגין היפוקסיה בילוד מכרסמים לתא תרבויות עצבית אב נגזרות אזור ראש Subventricular

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

delivery-vivo-acute-intermittent-hypoxia-neonatal-rodents-to-prime

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

7.2K Views.  University of Florida.  מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לניהול תקופות קצרות של היפוקסיה לסירוגין לגורי עכבר או עכברוש לאחר לידה היום 1-8. גישה זו ביעילות מעוררת רמה חזקה רקמה "תחול השפעה" על תאים עצביים בתרבית שנקצרים בתוך 30 דקות של חשיפת היפוקסיה. 

Video: Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Genetics

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe and permanent neuropsychological sequelae, including mental retardation, cerebral palsy, and epilepsy. The outcomes of HIE are devastating and permanent, making it critical to identify and develop therapeutic strategies to reduce brain injury in newborns with HIE. To that end, the neonatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury has been developed to model this human condition. The HIE model was first validated by Vannucci et al 1 and has since been extensively used to identify mechanisms of brain injury resulting from perinatal hypoxia-ischemia 2 and to test potential therapeutic interventions 3,4. The HIE model is a two step process and involves the ligation of the left common carotid artery followed by exposure to a hypoxic environment. Cerebral blood flow (CBF) in the hemisphere ipsilateral to the ligated carotid artery does not decrease because of the collateral blood flow via the circle of Willis; however with lower oxygen tension, the CBF in the ipsilateral hemisphere decreases significantly and results in unilateral ischemic injury. The use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to stain and identify ischemic brain tissue was originally developed for adult models of rodent cerebral ischemia 5, and is used to evaluate the extent of cerebral infarctin at early time points up to 72 hours after the ischemic event 6. In this video, we demonstrate the hypoxic-ischemic injury model in postnatal rat brain and the evaluation of the infarct size using TTC staining.

The postnatal rat model for hypoxic-ischemic brain injury is a well-established model of human neonatal hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). In this article, we describe the model of HIE in post-natal rat pups.

מודל hypoxic אנצפלופתיה איסכמי של איסכמיה הלידה

Hypoxic-Ischemic Encephalopathy (HIE) is the consequence of systemic asphyxia occurring at birth. Twenty five percent of neonates with HIE develop severe ...

Biology

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Electroporation האזור Subventricular ילודים

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Neurobehavioral הערכות במודל של עכברים של פגיעה מוחית לפציעה Hypoxic-איסכמי Neonatal

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia (BPD). In premature infants, BPD is a major complication despite early use of surfactant therapy, optimal ventilation strategies, and noninvasive positive pressure ventilation. Because pulmonary inflammation plays a crucial role in the pathogenesis of BPD, corticosteroid use is one potential treatment to prevent it. Nevertheless, systemic corticosteroid treatment is not usually recommended for preterm infants due to long-term adverse effects. Preclinical studies and human phase I clinical trials demonstrated that use of mesenchymal stromal cells (MSCs) in hyperoxia-induced lung injuries and in preterm infants is safe and feasible. Intratracheal and intravenous MSC transplantation has been shown to protect against neonatal hyperoxic lung injury. Therefore, intratracheal administration of stem cells and combined surfactant and glucocorticoid treatment has emerged as a new strategy to treat newborns with respiratory disorders. The developmental stage of rat lungs at birth is equivalent to that in human lungs at 26&#8722;28 week of gestation. Hence, newborn rats are appropriate for studying intratracheal administration to preterm infants with respiratory distress to evaluate its efficacy. This intratracheal instillation technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into the lungs.

Described is a protocol for performing intratracheal transplantation of mesenchymal stromal cells (MSCs) through intratracheal injection in term neonatal rats. This technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into neonatal rat lungs to evaluate their efficacy.

בלתי מתאים של תאי גזע בתוך מונח של חולדות הנוטרסית

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...

Medicine

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

A Minimally Invasive Method for Intratracheal Instillation of Drugs in Neonatal Rodents to Treat Lung Disease

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered drug. This has direct translational impact because surfactant and drugs are administered locally into the lungs. Though the literature has many publications describing minimally invasive transoral intubation of adult mice and rats in therapeutic experiments, this approach in neonatal rat pups is lacking. The small size of orotracheal region/pharynx in the pups makes visualization of laryngeal lumen (vocal cords) difficult, contributing to the variable success rate of intratracheal drug delivery. We hereby demonstrate effective oral intubation of neonatal rat pup - a technique that is non-traumatic and minimally-invasive, so that it can be used for serial administration of drugs. We used an operating otoscope with an illumination system and a magnifying lens to visualize the tracheal opening of the rat neonates. The drug is then instilled using a 1 mL syringe connected to a pipette tip. The accuracy of the delivery method was demonstrated using Evans blue dye administration. This method is easy to get trained in and could serve as an effective way to instill drugs into trachea. This method could also be used for administration of inoculum or agents to simulate disease conditions in animals and, also, for cell-based treatment strategies for various lung diseases.

This technique of instilling drugs directly into the trachea of neonatal rodents is important in studying the impact of locally administered drugs or biologicals on neonatal lung diseases. Additionally, this method can also be used for inducing lung injury in animal models.

שיטה זעיר פולשנית להחדרת תרופות תוך-רחמיות במכרסמים יילודים לטיפול במחלות ריאה

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered ...

חולדה "חליבה מוחית" לבידוד תאי גזע עצבי ואוליגודנדרוציטים

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new neurons and glia. One such niche is the subependymal zone (SEZ; also called the ventricular-subventricular zone), which is located across the lateral walls of the lateral ventricles, adjacent to the ependymal cell layer. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are abundantly distributed throughout the central nervous system, constituting a pool of proliferative progenitor cells that can generate oligodendrocytes.
Both NSCs and OPCs exhibit self-renewal potential and quiescence/activation cycles. Due to their location, the isolation and experimental investigation of these cells is performed postmortem. Here, we describe in detail &#34;brain milking&#34;, a method for the isolation of NSCs and OPCs, amongst other cells, from live animals. This is a two-step protocol designed for use in rodents and tested in rats. First, cells are &#34;released&#34; from the tissue via stereotaxic intracerebroventricular (i.c.v.) injection of a &#34;release cocktail&#34;. The main components are neuraminidase, which targets ependymal cells and induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor-2. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid are performed from the cisterna magna, in anesthetized rats without the need of an incision.
Results presented here show that isolated cells retain their endogenous profile and that NSCs of the SEZ preserve their quiescence. The denudation of the ependymal layer is restricted to the anatomical level of injection and the protocol (release and collection) is tolerated well&#160; by the animals. This novel approach paves the way for performing longitudinal studies of endogenous neurogenesis and gliogenesis in experimental animals.

מחבר זרקור: איסוף תאי גזע עצביים ותאי אב מבעלי חיים באמצעות פרוטוקול חליבה מוחי חדשני 

A method for the isolation of neural stem cells and oligodendrocyte progenitor cells from the brains of live rats is presented here in experimental detail. It allows multiple collections of these cells from the same animals without compromising their well-being.

שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...

משלוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video