המחברים מבקשים להודות ברנדון ג&#39;הרוכסן וקן ב &#39;קפלן עבור מתן גישה זן שמרים השתמשו במחקר זה. המחברים מודים גם חוליו לנין דומינגז-רמירז לסיוע עם צילום וידיאו. JEE מודה תמיכה NIH למימון מענק 5RC1GM91755 מספר.

1. ייצור והרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מפזר החום אלומיניום בתוך 22.96 ס&quot;מ (9 &quot;) במחבת העוגה כ 2 ס&quot;מ מהצד של המחבת, כפי שמוצג באיור 1c שימוש בטוש שחור, חורים סימן עבור מפזר החום אלומיניום הערה:.. אם אלומיניום בלוק (לרכוש חנות גרוטאות מתכת המקומית או באינטרנט <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) לא מגיע עם טרום קדח חורים, תצטרך לארגן יש חורים שנקדחו ו המשוקעים לפני שלב 1 כדי לאבטח את אלומיניום לחסום למחבת את העוגה. השתמשנו 5 חורים כדי לאבטח את גוש לפלטפורמת ו 4 חורים נוספים כדי לאפשר גז בועות חנקן לברוח תחת האלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תיבת cryo-רשת ליד המיקום של מפזר החום אלומיניום לסמן את החריץ ואת כל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חורים טייס לכל תפקיד מסומן באמצעות קצת # 17 לקדוח חורים החום אלומיניום כיור קצת # 35 לקדוח חורים cryo-רשת התיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר חום אלומיניום כיור באמצעות 5 - # 10, 1.9 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) ראש שטוח מחוררת ברגים ואומים המקביל כמו גם 15 - # 10 מנקי מניחים שתי דיסקיות מתחת לבלוק אלומיניום השלישי על הישבן של. פשטידת מחבת של כל חור הערה:. המסוכך בחו&quot;ל של גוש אלומיניום בסמוך לאזור הצפייה עלולה לגרום לתנודות המגבילים יכולות הדמיה של הבמה בדוק כדי לוודא שכל הברגים הרכבה הם הידקו בחוזקה.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס 3 - # 4, 0.95 ס&quot;מ (3 / 8 &quot;) בסיבוב ברגים מחוררת ואגוזים המקביל מהישבן של פאן פאי לשמש cryo-רשת התיבה הר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת 4 מקלות אכילה יחד בזוגות עם המקל על גבי מחילות. כל זוג Tape לקצוות מרוחקים של המחבת עוגת לשמש מפרידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח רטוב העליון ובחלק התחתון של העוגה עוגת מחבתות בהתאמה עם DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המחבת עוגה עם שתי שכבות של ספריי קצף בידוד. הרטבת כל שכבה לפני שהולכים לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את התבנית לתוך הקצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהפכו את מחבתות הפוך ולחץ על מחבת את העוגה עד מפרידי הקשר את התבנית. מניחים חפץ משוקלל על גבי מחבת את העוגה ולתת לשבת לילה לרפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת סכין משוננת, לחתוך עודף יבשים ספריי קצף בידוד מקצה מחבתות והסר את מקלות אכילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורידים את הסיר העוגה מהתבנית את העוגה. במחבת עם גוף הקירור העוגה אלומיניום מבודד עכשיו יהיה המכונה &quot;שלב קריוגני&quot; (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לוח פלסטיק שקוף (כל צבע יותר מאשר 3 מ&quot;מ עובי) מעל הבמה קריוגני. סמן בטוש שחור את מיקומו של הר cryo-רשת התיבה על ידי ציור עיגול כ -1.5 פעמים הקוטר של עגול אחד cryo-רשת התיבה. לגזור חור עם 1.9 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) ראה חור. הלוח זה יהיה המכונה&quot; מסך הטעינה &quot;(איור 1b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים ללוח שקוף חדש מעל הבמה קריוגני ומניחים על מיקרוסקופ עם מפזר החום ישירות תחת עדשות אובייקטיבי. בטוש שחור, סימן את הנתיב של היעדים כפי שהם לסובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לאורך הקו המסומן הסרת חצי מעגל מקצה הלוח. ניתן להשיג זאת עם פאזל או בעזרת 7.62 ס&quot;מ (3 &quot;) חור ראיתי מספר פעמים כפי שמוצג בסרטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף לחתוך חור 1.9 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) במרחק חצי העיגול, אבל עדיין בתוך השטח של המנה. זה יהיה נמל למילוי חנקן נוזלי (באעכליה 2) אם תוך ירידה ברמות הדמיה. הלוח הזה יופנה בשם &quot;מסך הצפייה&quot; (איור 1 ג&#39;). </li></ol> 2. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל שלב יומן שמרים תאים שגודלו סינתטי (SC) התקשורת מלאה הריכוז המתאים של 1x10 6 תאים / מ&quot;ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;ל של השמרים בדילול הם pipetted על R2 / 1 400 רשת המחוררת פחמן מצופה נחושת cryo-EM רשת (ספקי SPI, במערב צ&#39;סטר, פנסילבניה) וכן מותר לספוג למשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם משם נוזל עודף מפני השטח לרשת על ידי נגיעה בחלק האחורי של הרשת לפיסת קרוע של רקמה רכה תאית (Kimwipe) למשך 2 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, הרשת ניתן לכבס עם 3 טיפות μL של מים (1-3 פעמים), ואת הרשעים משם כמו בשלב 3 של סופג מאחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לפני הגמר, המדגם הוא נטען לתוך המקפיא לצלול פנאומטי והרשת תלוי נשטף כמו בשלב 2.4. לאחר סופג את הרשת עם נייר קרוע (Kimwipe) כדי להסיר את רוב המים מפני השטח, הרשת הוא צלל לתוך באעכליה 2 מקורר אתאן נוזלי והועברו תיבת cryo-רשת אחסון עבור הערה: 1. חשוב להשאיר שכבה של נוזל דק ככל האפשר על פני השטח כדי למנוע התייבשות המדגם. לא נכון יהיה גם סופג לייבש את המדגם או לעזוב קרח אטומה האלקטרון הקורה. </li></ol> 3. Cryo-Light מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הבמה עם קריוגניבאעכליה 2 במהירות לכסות עם מסך הטעינה (לוח פלסטיק עם 1.9 ס&quot;מ בודד (3 / 4 &quot;) חור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מתכת מגיע באעכליה 2 טמפרטורה, להעביר את תיבת cryo-רשת דרך 1.9 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) חור של המסך טעינה לתוך להעביר את הר שנוצר על ידי 3 ברגים המתואר A5 חלק. הברג החוצה את תיבת cryo-רשת מבעל שלה להסיר את בעל גישה משופרת. שמור בעל cryo-רשת בתיבה תחת באעכליה 2 בתוך דיואר נפרדת עד שלב 3.10. תיבת cryo-רשת צריך גם להיות כל הזמן תחת באעכליה 2 רשת כדי למנוע התחממות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . דיו באעכליה 2 בשלב קריוגני ממש מתחת העליון של מפזר החום אלומיניום הערה: באעכליה 2 רמות יש לבדוק מעת לעת ומילא בתהליך הדמיה כדי להבטיח באעכליה 2 הוא ברציפות במגע עם גוף הקירור. באופן כללי, מילוי מתרחשת כל 10 דקות דרך נמל למלא את המסך לצפייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מגניב קצה פינצטה ב באעכליה 2, ולאחר מכן להעביר לרשת שלך (ים) על גבי משטח שטוח הצפייה של הכיור אלומיניום חום עם פינצטה, באמצעות 1.9 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) חור של מסך הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להזיז את cryo-הבמה מתחת פתחים המטרה של מיקרוסקופ אור משתקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את מסך הצפייה שקוף על גבי מסך הטעינה. ואז לאט לאט להסיר את מסך הטעינה על ידי הזזה זה מתחת הערה צפייה במסך:. בשלב זה, המדגם הוא הפגיע ביותר. כל זרמי אוויר סביב המיקרוסקופ צריך להיות ממוזער, ביניהם: נשימה, פתח את הדלת הסמוכה, אנשים חולפים, וכו &#39;אנו ממליצים לובש facemask או תלוי מגן פנים שקוף מתחת למיקרוסקופ מהעיניות כאמצעי זהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העדשות אובייקטיבית לתוך הסביבה גז קר חנקן של הבמה cryo ולסרוק למדגם על שטח חום שטוחה כיור הצפייה. באמצעות אור רגיל בהיר בשדה מיקרוסקופיה להתמקד טכניקות על רשת עם מטרה בהגדלה נמוכה כדי למצוא את מרכז ולקחת תמונה כללית. מפרט לגבי עדשות מיקרוסקופ אור משמש לצורך הניסוי הזה המפורטים בסעיף חומרים ניסויית. הערה: באעכליה 2 לא בא במגע עם עדשות אובייקטיבי יש לנו עדיין לראות את ההשפלה של תמונות או נזק עדשות מהשפעות קירור . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בהגדלה גבוהה על שטח של עניין לרכוש נתונים עם שדה בהיר, שדה חשוך, אור מקוטב או דימות פלואורסצנטי. הקפד לרשום את המיקום של אזור הריבית על התמונה שדה נמוך בהיר הגדלה עבור מתאם בעתיד. אם כל אמצעי הזהירות המפורטים לעיל עבור מילוי באעכליה 2 הם אחריו, ולאחר מכן לחץ חיובי החנקן מתאדים מספיקה כדי לשמור על הסביבה זיהום חופשי (עצמאי של החדר לחות) למשך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם סיים, להחליף את מסך הטעינה על ידי הזזה זה מעל מסך התצוגה. הסר את המסך לצפייה על ידי האטת מחליק אותו מתחת למסך הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבמה cryo מן מיקרוסקופ עם פינצטה מקורר מראש, להעביר את הרשת בחזרה אל תיבת cryo-לרשת. בורג בעל cryo-רשת התיבה לתוך תיבת cryo-רשת לאטום נגד הסביבה ולהעביר את המחזיק ל דיואר LN2 לאחסון הדמיה בעתיד. </li></ol> 4. מיקרוסקופית אלקטרונים cryo- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טכניקות סטנדרטיות והקים, לטעון את רשת מדגם לתוך המחזק cryo-EM העברה תוך שמירה על הדגימה בטמפרטורת חנקן נוזלי בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את cryo-מחזיק עם רשת מדגם לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאור הגדלה מתאים נמוכה (50-500x הגדלה נומינלית), למצוא את המרכז של הרשת המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שנאספו בעבר נמוך cryo-LM הגדלה נתונים צעד 3.7 כדי לקבוע את הכיוון היחסי של כרטיסיות המרכזי של רשת נחושת (כמתואר באיור 2), לזהות אזורים המדויק של עניין המתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך יישור מיקרוסקופ, במינון נמוך cryo-EM הדמיה איסוף הנתונים. </li></ol> 5. נציג תוצאות השלב קריוגני (איור 1 א) היא דרך יעילה לאיסוף cryo-LM נתונים עבור מיקרוסקופיה cryo-פלואורסצנציה וניתוח cryo-LM/cryo-EM גומל. איור 2 מראה כיצד שילוב של תמונות נמוך וגבוה cryo-LM ההגדלה מאפשר לך לבנות מפות התייחסות לכוון אותך לאזורים ספציפיים cryo-EM. כתוצאה cryo-LM התייחסות המפה (איור 2b) נוצל במהלך רכישת נתונים cryo-EM לאתר אזורים המדויק שמוצג באיור 3. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. שלב קריוגני. א) הפריסה של השלב קריוגני מורכב העברת cryo-רשת תיבה הר הצביעו wהחץ ith לבן מפזר החום אלומיניום. רשתות מועברים תחת באעכליה 2 מתוך תיבת cryo-לרשת והניח ישירות על אזור התצוגה הכיור של חום, כמצוין על ידי החץ השחור. ב) תמונה המתארת ​​את השלב קריוגני עם טעינת מסך. חור במסך הטעינה ממוקם ישירות מעל cryo-רשת התיבה הר משמש ליציאת להעביר דגימות להעברת דגימות תיבת cryo-הרשת לאזור מדגם צפייה על מפזר החום עם פינצטה. ג) קריוגני בשלב בעמדה תחת עדשות אובייקטיבי עם מסך צפייה במקום. נתק מיוחד על המסך מאפשר צפייה עדשות אובייקטיבי הנדנדה בקלות למצב מבלי להזיז את הבמה קריוגני. חור במסך הצפייה הרחק מאזור מדגם משמש באעכליה 2 למלא נמל לחדש באעכליה 2 רמות במידת הצורך. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ניווט LM-cryo ללימודי גומל.) בהגדלה נמוכה cryo-LM נוף של תאים שמרים דבק רשת מדגם. ב) אותה תמונה ב (א) ועליהן תמונה בהגדלה גבוהה הקרינה בשטח של עניין עם מצולע כתום מלא לציון מרכז של רשת המדגם. המרכז מורכב מקבוצה של ארבעה ריבועים, שלושה שיש לשונית מתכת נוספת הפתוח הלאה. במשך שלושה ריבועים עם לשונית מתכת נוספת, שני זוגות חולקים על הכרטיסייה על צירים ארוכים וקצרים להרכיב מרכז אסימטרי. מרכז זה אסימטרית ניתן לראות בפינה השמאלית העליונה שימשה כדי לציין את זווית סיבוב handedness של הרשת בין cryo-LM ו cryo-EM. מאחד נמוך התמונה הגדלה באזורים רבים של עניין ניתן לסמן ושימש המפה התייחסות לאתר אזורים זהים cryo-EM. ג) מוגדל הקרינה cryo-LM תמונה של האזור של עניין (ב). HTA1-CFP, סמן בטרמינל C-CFP היסטון, ניתן לראות מבנה punctate ירוק תיוג את מיקומו של הגרעין. ד) תמונה cryo-EM של האזור המקביל ב (ג). ברים סולם מייצגים 50 מיקרון. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. מתאם של cryo-LM ו cryo-EM. שני שדות הראייה המתארת ​​שמרים תאים זהים בקורלציה עם שדה cryo-בהיר (א, ד), cryo-פלואורסצנטי (ב, ה), ו cryo-EM (ג, ו ). ברים סולם מייצגים 5 מיקרון.

<ol>
	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

<p class="jove_content"&gt; שימוש הבמה קריוגני שלנו הכנת המדגם טכניקות, מחקרים המתאם בין cryo-LM ו cryo-EM התערוכה מספר יתרונות על פני הגישות המסורתיות בטמפרטורת החדר, כולל אך לא מוגבל ל: קיבוע מהיר<sup&gt; 1,2</sup&gt;, הקטינה photobleaching<sup&gt; 3</sup&gt;, וסריקה של שלמות המדגם לפני cryo-EM<sup&gt; 4,5</sup&gt; או כימי קיבעון / הטבעה<sup&gt; 6</sup&gt;. אחד צווארי בקבוק עבור cryo-EM איסוף נתונים הוא הזמן הנדרש הן העברת מדגם לתוך TEM ו לסרוק את הרשת כדי למצוא אזורים מתאימים לתמונה. עם רכישת נתונים מהירה של cryo-LM<sup&gt; 5</sup&gt;, הזמן המוקדש למציאת תאים טוב יכול להיות מופחת במידה ניכרת. לפיכך, אנו יכולים לחסוך זמן וכסף ולצמצם את צוואר הבקבוק על ידי מראש סריקת מיפוי תחומי עניין cryo-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; שלבי קריוגני יקר יותר או מורכבים עשוי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה cryo-LM. עם זאת, בשלב מפוברק כאן היא יותר ממספקת עבור יישומים רבים. אם cryo-LM הדמיה רשת העברות מדגם מבוצעות בזהירות כפי שמתואר בטקסט ווידאו, הדמיה מלאה זיהום חופשי יכול להיות מושלם. שיטה זו מאפשרת קשר ישיר של נתונים מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אלקטרון באותו תא, אברון או מורכב macromolecular מפוזרים על התמיכה פחמן או בתוך קטע רקמה דקה<sup&gt; 7</sup&gt;. יש לציין כי ערך בשלב זה קריוגני חורג מחקרים המצטרף cryo-LM/cryo-EM לתחום במיקרוסקופ אור כולה. שלב זה קריוגני הוא גם מתאים הן דוגמאות וצבעים עדינים fluorophore / כתמים<sup&gt; 8</sup&gt;, נקודות קוונטיות, או החלבונים המתויגים fluorescently<sup&gt; 9</sup&gt; זה עשוי להיות לא יציב במהלך קיבוע כימי בטמפרטורה בחדר והטבעה עם glutaraldehyde ו paraformaldehyde. כתוצאה מכך, אנו מקווים כי זה שלב קריוגני תספק גישה גדולה יותר למעוניינים cryo-LM, שהיו בעבר נרתע גישה העלות מספקת.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; פתרון בעיות cryo-Light מיקרוסקופית</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. לדוגמה ספיחה:</em&gt; מדגמים שונים יכולים להפגין משתנה מאפיינים ספיחה לתמוך פחמן. אתה עלול למצוא לנכון להשתמש בסוגים אחרים של רשתות תמיכה כגון פחמן רציפה, פחמן המחוררת, או רשתות מצופה formvar לתמיכה המדגם. בנוסף, אם המדגם הוא מחייב את הסורגים נחושת של הרשת ולא משטח הפחמן, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כימיה של פני השטח הפחמן על ידי דוגרים את הרשת עם סוכן הרטבה או על ידי זוהר ופריקה לפני כן המדגם.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. שלב יציבות:</em&gt; אם אתה מבחין הרטט, סביר להניח עקב הבמה מדגם להיות עמוסה עם משקל ולא המבעבע של LN2. המשקל הנוסף של שלב קריוגני, יכול לפעמים לגרום לתנודות בתדירות נמוכה לשדר לאורך הבמה מיקרוסקופ רגיל 3-ציר הנסיעה, להשפיע לרעה על דימות באמצעות טשטוש. זה יכול בקלות להיות מתוקן על ידי תמיכה לשלב נסיעה של מיקרוסקופ מלמטה עם או להרים מיני מתכווננת או מתאם מתכווננת עם בורג כפול נשק, כפי שמוצג בסרטון. שני אלה במנגנוני תמיכה מתכווננת אינטראקציה עם החלק הלא ניד של הבמה לנסוע ולכן עדיין היתרי X ו-Y ציר תרגום כנדרש הדמיה.</p

טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th><th> עלות </th></tr><tr><td> 1-22.86 ס&quot;מ (9 &quot;) פשטידת מחבת עם קצה משופע </td><td> טוב קוק </td><td></td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td> 4.39 $ </td></tr><tr><td> 1-22.86 ס&quot;מ (9 &quot;) עוגת מחבת </td><td> טוב קוק </td><td></td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td> 4.93 $ </td></tr><tr><td> 4 זוגות של מקלות אכילה </td><td></td><td></td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td> 0.50 $ </td></tr><tr><td> 1 - ספריי קצף הגדול Stuff </td><td> Great Stuff </td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 5.98 $ </td></tr><tr><td> 1 - 4cm x8cm לחסום x1cm של אלומיניום </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי או חצר גרוטאות מתכת </td><td> 10.00 $ </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1.91 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) ראש שטוח מחוררת ברגים w / אגוזים </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 0.98 $ </td></tr><tr><td> 3 - 4 0.95 ס&quot;מ (3 / 8 &quot;) עגול מחוררת ברגים w / אגוזים </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 0.98 $ </td></tr><tr><td> 15 - # 10 מנקי </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 0.98 $ </td></tr><tr><td> 2 - פלסטיק שקוף כתיבה </td><td></td><td></td><td> משרד מקומי חנות </td><td> 6.84 $ </td></tr><tr><td> 1 - cryo-EM רשת בעל תיבת </td><td> טד פלה </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - cryo-EM תיבת לרשת מוט טיפול </td><td> טד פלה </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 הסרט המחוררת פחמן, 400-רשת cryo-EM נחושת רשת תמיכה </td><td> SPI ספקי </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> ניסיוני חומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן שמרים: Hta1-CFP: קן (נכ&quot;ק-3382: מאטה, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP: KanMX6 ממעבדת קפלן ב UC Davis). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryo-Light מיקרוסקופית: cryo-מיקרוסקופ אור תמונות צולמו על מיקרוסקופ הלייקה DM4000M המשקף עם DFC310 לייקה FX מצלמת CCD. שדה מוארת, שדה כהה ותמונות Fluorescence נרכשו או באמצעות PL HCX FLUOTAR 5x 0.15 NA אובייקטיבי אוויר, PL HCX FLUOTAR אובייקטיבי 10x 0.30 NA אוויר, FLUOTAR PL 50x 0.55 אובייקטיבי NA אוויר או 100x NPLAN 0.75 אובייקטיבי NA האוויר. שדה מוארת ותמונות שדה כהה משמש מנורה 12V 100W טונגסטן כמקור אור. עבור פלואורסצנטי, EL6000 מנורת UV שימש מקור בשיתוף עם JC1 לייקה (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 &amp; LP 580) Cube סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryo-Transmission מיקרוסקופית אלקטרונים: cryo-EM התמונות נרכשו על מיקרוסקופ Jem-2100-FEG אלקטרונים הילוכים (JEOL, יפן) הפעלה ב 200 קו ניצול 626 Gatan cryo-להעביר לבעל (Gatan, ארה&quot;ב). Micrographs נרשמו בהגדלה הנומינלי של X 50, 200, 1200 ו - 4000 על 4096 x 4096 פיקסלים טיץ מצלמת CCD (TVIPS, גאוטינג, גרמניה). </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

צימוד של מיקרוסקופיה cryo-אור (cryo-LM) ו במיקרוסקופ אלקטרונים cryo-(cryo-EM) מהווה מספר יתרונות להבנת הדינמיקה הסלולר ultrastructure. ראשית, תאים ניתן הדמיה בסביבה יליד ליד טכניקות שניהם. שנית, בשל תהליך vitrification, דגימות נשמרים על ידי immobilization פיזי מהיר יותר מאשר קיבוע כימי איטי. שלישית, הדמיה מדגם זהה עם שני cryo-LM ו cryo-EM מספק המתאם של נתונים מתא בודד, ולא השוואה של &quot;מדגמים מייצגים&quot;. למרות היתרונות הללו ידועים ממחקרים קודמים, השימוש הנרחב המצטרף cryo-LM ו cryo-EM נשאר מוגבל בשל חשבון והמורכבות של רכישת או בניית מיקרוסקופ מתאים קריוגני שלב אור. כאן אנו מדגימים את הרכבה, ושימוש בשלב קריוגני יקר זה יכול להיות מפוברק במעבדה כל פחות מ 40 $ עם חלקים למצוא בכתובת חומרה מקומיים וחנויות מכולת. שלב זה cryo-LM מיועד לשימוש עם מיקרוסקופים האור המוחזר כי מצוידים זמן האוויר מטרות עבודה מרחוק. עבור המצטרף cryo-LM ו cryo-EM מחקרים, אנו להתאים את השימוש של פחמן סטנדרטי מצופה 3 מ&quot;מ cryo-EM רשתות כמו תומך הדגימה. לאחר adsorbing המדגם לרשת, פרוטוקולים הוקמה בעבר עבור vitrifying המדגם והעברת / טיפול לרשת הן בעקבות להתיר טכניקה רב הדמיה. כתוצאה מכך, התקנה זו מאפשרת לכל מעבדה עם מיקרוסקופ האור המוחזר כדי לקבל גישה המצטרף הדמיה ישירה של דגימות hydrated קפואים.

Watch this Scientific Journal Video about Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy at JoVE.com

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

אנו מדגימים את ייצור של השלב בעלות נמוכה קריוגני שתוכנן מיקרוסקופים האור המוחזר ביותר. שלב זה במעבדה בנוי קריוגני מאפשרת הדמיה המצטרף יעיל ואמין בין cryo-אור cryo-אלקטרונים מיקרוסקופית.

בעלות נמוכה cryo-Light Stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Views.  University of California Davis. אנו מדגימים את ייצור של השלב בעלות נמוכה קריוגני שתוכנן מיקרוסקופים האור המוחזר ביותר. שלב זה במעבדה בנוי קריוגני מאפשרת הדמיה המצטרף יעיל ואמין בין cryo-אור cryo-אלקטרונים מיקרוסקופית.

Video: Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

דיגום מהיר ועלות נמוכה של מכשירים רפואיים באמצעות 3D מודפס תבניות להזרקת נוזלים

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

עיצוב של מקור פתוח, ביודיו בעלות נמוכה ומזון נמס ההבלטה מדפסת תלת-ממד

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...