저자는 본 연구에서 사용되는 효모 변형에 대한 액세스를 제공하는 브랜든 J. Zipp와 켄 B. 카플란 감사하고 싶습니다. 저자는 또한 찍고와 지원을 훌리오 레닌 도밍게즈 - 라미레즈 감사합니다. 말씀 그랜트 번호 5RC1GM91755에서 NIH 자금 지원을 인정한다.

1. 제작 및 조립 <ol><li> .. 그림 1C에 표시된 22.96 cm (9 &quot;) 파이 냄비 냄비의 측면에서 약 2cm, 검은색 마커 펜, 알루미늄 방열판에 대한 마크 구멍 참고를 사용하여 내부의 알루미늄 방열판을 장소 : 경우 알루미늄 블록이 (에서 지역 고철 가게 또는 온라인에서 구입 <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) 사전 뚫고 구멍이 ​​오지 않습니다, 당신은 구멍이 몰락하고 알루미늄을 확보하기 위해 1 단계로 이전 접시하도록 주선해야합니다 파이 이동 차단. 우리는 질소 가스의 거품이 알루미늄 아래에서 탈출 수 있도록 플랫폼을 4 추가 구멍에 블록을 확보 5 구멍을 사용합니다. </li><li> 알루미늄 방열판의 위치 근처 cryo - 격자 상자를 놓고 노치와 각 측면을 표시합니다. </li><li> 알루미늄 방열판 구멍에 대한 # 17 드릴 비트 및 cryo - 격자 상자 구멍에 # 35 드릴 비트를 사용하여 각 표시된 위치에 대한 파일럿 구멍을 드릴. </li><li> 5를 사용하고 알루미늄 방열판을 마운트 - # 10, 1.9 cm (3 / 4 &quot;) 민머리 홈 붙이 볼트와 해당 너트뿐만 아니라 15 - # 10 와셔 두 개 알루미늄 블록 아래 세탁기와 뒷면에 세 번째. . 각 구멍 참고를위한 파이 팬 :보기 영역 근처의 알루미늄 블록의 보안되지 overhangs는 무대의 이미징 기능을 제한 진동이 발생할 수있는 모든 마운팅 볼트가 확고하게 강화되어 있는지 확인합니다.. </li><li> 삽입 3 - # 4 0.95 cm (3 / 8 &quot;) cryo - 격자 상자 마운트 역할을 파이 팬 뒷면의 홈 붙이 볼트와 너트를 해당 라운드. </li><li> 또 꼭대기에 한 젓가락과 쌍 4 젓가락 함께 테이프. 스페이서 역할을하는 케이크 냄비의 맞은편 가장자리에 테이프 각 쌍을. </li><li> 케이크와 파이의 젖은 위쪽과 아래쪽 표면 ddH 2 O.로 각각 냄비 </li><li> 스프레이 거품 절연 두 레이어 케이크 팬을 채우십시오. 다음 단계로 진행하기 전에 각각의 레이어를 젖음. </li><li> 거품에 파이 팬을 누르십시오. </li><li> 거꾸로 팬 플립과 스페이서가 파이 팬에 문의 때까지 케이크 팬에을 누르십시오. 케이크 팬 위에 어떤 가중치 물체를 놓고 치료 밤새 앉아 보자. </li><li> 톱니 모양의 나이프로, 초과는 냄비의 가장자리에서 스프레이 거품 절연 건조 버려야하고 젓가락을 제거합니다. </li><li> 파이 팬의 케이크 팬을 제거합니다. 알루미늄 방열판과 파이 팬은 현재 단열재이며, &quot;극저온 무대&quot;(그림 1A)이라고합니다. </li><li> 극저온 무대의 맨 위에 투명한 플라스틱 클립 보드 (모든 색상과 두께 이상 3mm) 장소. 검은 표지 약 1.5 배 하나의 둥근 cryo - 격자 상자의 직경 동그라미를 그림으로써 cryo - 격자 상자 마운트의 위치를​​ 표시합니다. 1.9 cm (3 / 4 &quot;)로 구멍을 잘라 구멍을 보았다.이 클립 보드에이라고도한다&quot;로딩 화면 &quot;(그림의 1B). </li><li> 극저온 무대와 직접 목적 렌즈 아래에있는 방열판과 함께 현미경에 장소 위에 새로운 투명한 클립 보드에 넣고. 그들은 회전으로 ​​검은색 마커와 목표의 경로를 표시합니다. </li><li> 클립 보드의 가장자리에서 반 동그라미를 제거 표시된 선을 따라 잘라. 이것은 퍼즐이나 동영상과 같이 구멍을 여러 번 보았다 7.62 cm (3 &quot;)를 이용하여 수행할 수 있습니다. </li><li> 마지막으로 접시의 영역 내에서 하프 서클에서하지만, 여전히 1.9 cm (3 / 4 &quot;) 구멍을 뚫고.이 포트 될 수준 드롭하는 경우 이미징.이 클립 보드에이 언급되지만 액체 질소 (lN 2) 충진을위한 &quot;보는 화면&quot;(그림 1C)로. </li></ol> 2. 샘플 준비 <ol><li> 1x10 6 셀 / 물에 ML의 적절한 농도로 합성 전체 (SC) 미디어 재배 로그 위상 효모 세포를 희석. </li><li> 희석 효모 2 ML은 R2 / 1 400 메쉬 홀리 탄소 코팅 구리 cryo - EM 그리드 (SPI 용품, 웨스트 체스터, PA)에 pipetted 15 초 동안 adsorb 수 있습니다. </li><li> 2 초 부드러운 셀룰로오스 조직의 찢어진 조각 (Kimwipe)에 그리드의 뒷면을 만져 격자 표면 가까이 초과 액체를 얼룩. </li><li> 필요한 경우, 격자 3 μL의 물을 방울 (1-3 회)하고, 악한 거리에 3 단계에서와 같이 뒤쪽에서 모래 바닥에서 함께 세탁하실 수 있습니다. </li><li> 최종 세척하기 전에 샘플 공압 플런지 냉동고에로드되고 매달려 그리드는 2.4 단계로 세탁합니다. 표면에서 물의 대부분을 제거하는 찢어진 티슈 (Kimwipe)로 격자를 모래 바닥 후, 격자는 액체 에탄을 냉각 lN이 속으로 뛰어들하고 저장 1 참고를위한 cryo - 격자 상자로 전송 :. 그것은 중요합니다 샘플 수산화 유지하기 위해 표면에 가능한 얇은 같은 액체의 레이어를 두십시오. 부적 절한 모래 바닥도 샘플을 건조 또는 전자빔을 불투​​명 얼음을 떠날 것입니다. </li></ol> 3. Cryo - 라이트 현미경 <ol><li> 극저온 무대로 채워lN 2는 빠르게 로딩 화면 (싱글 1.9 cm (3 / 4 &quot;) 구멍이있는 플라스틱 클립 보드)를 커버. </li><li> 일단 금속 부분 A5에서 설명하는 3 개의 나사에 의해 만들어진 마운트 1.9 cm (3 / 4 &quot;) 로딩 화면의 구멍을 통하여 전송에 cryo - 격자 상자를 전송, lN이 온도에 도달합니다. 돌려서 cryo - 격자 상자 의 홀더에서합니다. 향상 액세스를위한 홀더를 제거 단계를 3.10까지 별도의 듀어에 lN이 아래 cryo - 격자 상자 홀더 보관하십시오. cryo - 격자 상자도 샘플 그리드 온난 화를 방지하기 위해 lN 2 조에 보관해야합니다. </li><li> . 단 알루미늄 방열판의 상단에 아래의 극저온 단계에 리필 lN 2 주 : lN이 수준을 정기적으로 체크하고 lN 2 방열판과 접촉 지속되도록 이미징 과정 리필해야합니다. 일반적으로 충진이 보는 화면에서 입력 포트를 통해 10 분마다 발생합니다. </li><li> lN 2 미리 시원한 트위터 팁 다음 1.9 cm (3 / 4 &quot;) 로딩 화면의 구멍을 사용하여 핀셋으로 알루미늄 방열판의 평면 볼 표면에 귀하의 격자 (들)을 전송합니다. </li><li> 조심스럽게 반사 조명 현미경의 목표 apertures 아래에 cryo 단계로 이동합니다. </li><li> 로딩 화면 위에 투명한보기 화면을 놓습니다. . 그런 다음 천천히 보는 화면 참고 아래를 슬라이딩하여 로딩 화면을 제거합니다이 시점에서, 샘플은 가장 취약합니다. 현미경 주위에 모든 공기 흐름이 포함 최소화한다 : 가까운 문이 ​​열린 사람들은 과거의 산책, 호흡 등 우리는 안면을 입고하거나 예방책으로 현미경 eyepieces 아래 투명한 얼굴 방패를 달아 좋습니다. </li><li> cryo 단계 및 평면 방열판보기 영역에있는 샘플에 대한 검사의 차가운 질소 가스 환경에 목적 렌즈를 회전합니다. 센터를 찾아 개요 이미지을 위해 낮은 배율 목적으로 그리드에 대한 표준 명시야 조명 현미경 기술의 초점을 사용합니다. 본 실험에 사용된 조명 현미경 렌즈에 관한 스펙은 실험 자료 섹션에 나열되어 있습니다 참고 :. lN 2 목적 렌즈와 접촉하지 않고 우리는 냉각의 영향에서 이미지 또는 렌즈 손상의 저하를 볼 아직 . </li><li> 관심 지역에 높은 배율에서 초점 명시야, 암시야, 편광 또는 형광 이미징 데이터를 취득. 미래의 상관 관계에 대한 낮은 배율 명시야 이미지에 관심 영역의 위치를​​ 기록해야합니다. lN 2 충진을 위해 위에 나열된 모든 예방 조치가 뒤에있다면 증발 질소의 긍정적인 압력이 영상의 기간 동안 무료로 환경을 오염 (객실 습도 독립) 유지하기 위해 충분합니다. </li><li> 끝나면보기 화면 상단을 통해 그것을 슬라이딩하여 로딩 화면을 바꿉니다. 로딩 화면 아래를 슬라이딩 둔화하여보기 화면을 제거합니다. </li><li> 현미경에서 cryo 단계를 제거하고 미리 냉각 핀셋으로 cryo - 격자 상자에 다시 격자를 전송합니다. 환경에 대한 봉인 및 스토리지와 미래의 이미지에 대한 lN2 듀어에 홀더를 전송하는 cryo - 그리드 상자에 cryo - 격자 상자 홀더 나사. </li></ol> 4. Cryo - 전자 현미경 <ol><li> 항상 액체 질소 온도에서 표본을 유지하면서 표준 및 구축 기법에 따라, cryo - EM 전송 홀더에 샘플 격자를로드합니다. </li><li> 전송 전자 현미경에 샘플 격자와 cryo - 홀더를 삽입합니다. </li><li> 적합한 낮은 배율보기 (50 - 500x 공칭 배율)에서 샘플 격자의 중심을 찾으십시오. </li><li> 그리드의 중앙 구리 탭의 상​​대적 방향을 (그림 2에서 설명) 확인하고 상관 관계에 대한 관심의 정확한 지역을 식별하는 단계 3.7에서 이전에 수집된 낮은 배율 cryo - LM 데이터를 사용합니다. </li><li> 현미경 정렬, 낮은 복용량 cryo - EM 영상과 데이터 수집을 진행. </li></ol> 5. 대표 결과 극저온 단계 (그림 1A)는 cryo - 형광 현미경과 상호 cryo-LM/cryo-EM 분석을 위해 cryo - LM 데이터를 수집하는 효과적인 방법입니다. 그림 2는 낮은 높은 배율 cryo - LM 이미지의 조합이 당신이 cryo - EM의 특정 영역에 대한 직접 참조지도를 만들 수 있도록하는 방법을 보여줍니다. 결과 cryo - LM 참조지도 (그림 2B)는 그림 3에 표시된 정확한 지역을 찾을 수 cryo - EM 데이터 수집 동안 이용되었다. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 극저온 무대.) 극저온 단계의 레이아웃은 마운트가 w를 표명 cryo - 격자 상자를 전송로 구성되어 있습니다ith 흰색 화살표와 알루미늄 방열판. 격자는 cryo - 격자 상자에서 lN 2 조에 전송과 검정색 화살표로 방열판의보기 영역에 직접 배치. B) 이미지 화면 로딩과 함께 극저온 단계를 묘사하고 있습니다. 포트 샘플을 전송하고 핀셋으로 방열판에 샘플보기 영역에 cryo - 격자 상자에서 샘플을 이동하십시오. C) 극저온에로 로딩 화면에 구멍이 cryo - 격자 상자를 탑재하고 행동을 통해 직접 배치됩니다 장소에 보는 화면과 목적에 따라 렌즈 위치에 무대. 보기 화면에서 특별 컷아웃은 객관적 렌즈가 쉽게 극저온 무대를 이동하지 않고 위치로 스윙 할 수 있습니다. 멀리 샘플 영역에서 보는 화면의 구멍이 필요한 경우 lN이 수준을 보충하기 위해 포트를 채울 lN이 역할을합니다. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 상호 연구 cryo - LM의 탐색은. 효모 세포의) 낮은 배율 cryo - LM보기 샘플 모눈을 준수. B)에 동일한 이미지가 (A) 관심 지역의 높은 배율 형광 이미지를 중첩 그리고 채워진 다각형 오렌지와 샘플 격자의 중심을 표시. 센터는 별도의 금속 탭을 앞으로 오픈하는 데 사 사각형, 세 그룹으로 구성되어 있습니다. 추가 금속 탭을와 세번에 대한 두 쌍은 비대칭 중심을 형성 장기 및 단기 축에 대한 탭을 공유할 수 있습니다. 이 비대칭 센터는 왼쪽 상단에서 볼 수 있으며, cryo - LM 및 cryo - EM 사이의 격자의 회전 각도와 handedness를 표시하는 데 사용되었다. 관심 중 하나가 낮은 배율 이미지 여러 지역에서 표시 할 수 있습니다 cryo - EM에서 동일한 영역을 찾을 참조지도로 사용. (B)에 대한 관심의 영역 C) 확대 형광 cryo - LM 이미지. HTA1 - CFP, C - 터미널 CFP 히스톤 마커가, 핵의 위치를 라벨 녹색 작은 반점이있는 구조로 볼 수 있습니다.에서는 해당 지역의 D) cryo - EM 이미지 (C). 스케일 바가 50 미크론을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. cryo - LM 및 cryo - EM의 상관 관계. 동일한 효모 세포를 묘사 볼 두 가지 분야가 (C, F cryo - 명시야 (A, D), cryo - 형광 (B, E), 그리고 cryo - EM과 상관 ). 스케일 바는 5 미크론을 나타냅니다.

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	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

저자는 경쟁 금융 이익을 선언하지 않습니다.

<p class="jove_content"&gt; 우리의 극저온 무대와 샘플 준비 기술, cryo - LM 및 cryo - EM 사이의 상호 연구를 사용하면 포함하며 이에 제한되지 않음 방식 전통적인 실내 온도를 통해 여러 가지 혜택을 전시 : 빠른 고정을<sup&gt; 1,2</sup&gt; photobleaching 감소<sup&gt; 3</sup&gt;, 그리고 cryo - EM하기 전에 샘플 무결성 검사<sup&gt; 4,5</sup&gt; 또는 화학적 고정 / 퍼가기<sup&gt; 6</sup&gt;. cryo - EM 데이터 수집에 대한 병목 현상 중 하나는 TEM에 샘플을 전송 및 이미지에 맞는 지역을 찾을 수있는 격자를 스캔 모두에 필요한 시간입니다. cryo - LM의 신속한 데이터 수집과 함께<sup&gt; 5</sup&gt; 시간이 좋은 세포를 찾는 지출을 획기적으로 줄일 수 있습니다. 따라서, 우리는 시간과 비용을 모두 저장하고 사전 검사 및 cryo - LM의 관심 분야를 매핑하여이 병목 현상을 완화 수 있습니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 더 비싼이나 복잡한 극저온 단계 높은 해상도 cryo - LM 영상을 허용할 수 있습니다. 그러나, 여기에 가공 무대는 많은 애플 리케이션에 적합한 이상입니다. cryo - LM 이미징 및 샘플 그리드 전송이로 텍스트와 비디오에 설명된주의 수행하는 경우에는 완전히 오염 무료로 영상을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 동일한 세포, organelle 또는 macromolecular 복합 형광 및 전자 현미경 데이터의 직접적인 상관 관계가 탄소 지원에 분산 또는 얇은 조직 섹션에 포함된 수<sup&gt; 7</sup&gt;. 그것이 극저온 단계의 값이 전반적으로 가벼운 현미경 분야에 cryo-LM/cryo-EM 상호 연구 초월해 것을인지해야합니다. 이 극저온 단계는 물론 섬세한 샘플 및 형광단의 염료 / 얼룩 모두에 적합합니다<sup&gt; 8</sup&gt;, 양자 점, 또는 찬란 태그 단백질<sup&gt; 9</sup&gt; 글루 타 알데히드와 paraformaldehyde로 실온 화학 고정 및 삽입하는 동안 불안정하게 될 수 있습니다. 결과적으로, 우리는이 극저온 단계 이전 비용과 부족한 액세스를 통해 범인되었습니다 cryo - LM, 관심들에게 큰 액세스를 제공할 수 있기를 바랍니다.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 문제 해결 Cryo - 라이트 현미경</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. 샘플 흡착 :</em&gt; 다른 샘플은 탄소 지원하기 위해 변수를 흡착 특성을 전시하실 수 있습니다. 당신은 지속적인 탄소, 홀리 탄소, 또는 샘플 지원 formvar 코팅 격자로 지원 격자의 다른 유형을 사용하는 것이 필요 찾을 수 있습니다. 또한 예제에서는 모눈 아니라 탄소 표면의 구리 막대에 바인딩하는 경우, 그것은 젖음 요원으로 격자를 잠복기하거나 글로는 샘플 추가하기 전에 방전에 의해 탄소 표면 화학을 조정해야 할 수도 있습니다.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. 스테이지 안정성 :</em&gt;는 진동을 통지하는 경우, 그것은 가능성이 체중보다는 lN2의 버블링과 과부하가되는 샘플 단계에 의한 것입니다. 극저온 무대의 추가 무게는 때로는 낮은 주파수 진동은 표준 3 축 여행 현미경 스테이지를 따라 전송하는 원인, 그리고 부정적인 흐리게 통해 이미지에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 쉽게 동영상과 같이, 이중 나사 무기로 조절 미니 리프트 또는 조절 어댑터 중 하나와 함께 아래에서 현미경의 여행 무대를 지원함으로써 해결할 수 있습니다. 이러한 조정 지원 메커니즘을 모두 여행 스테이지의 비 움직일 수있는 부분과 상호 작용하기 때문에 영상이 필요로 여전히 X와 Y 축 변환을 허용합니다.</p

특정 시약 및 장비의 테이블 : <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 # </th><th> 댓글 </th><th> 비용 </th></tr><tr><td> 1-22.86 cm (9 &quot;) sloped 가장자리로 파이 팬 </td><td> 좋은 쿡 </td><td></td><td> 현지 식료품점 </td><td> $ 4.39 </td></tr><tr><td> 1-22.86 cm (9 &quot;) 케이크 팬 </td><td> 좋은 쿡 </td><td></td><td> 현지 식료품점 </td><td> $ 4.93 </td></tr><tr><td> 젓가락 4쌍 </td><td></td><td></td><td> 현지 식료품점 </td><td> $ 0.50 </td></tr><tr><td> 1 - 그레이트 콘텐츠 스프레이 폼 </td><td> 좋은 음식 </td><td></td><td> 지역 철물점 </td><td> $ 5.98 </td></tr><tr><td> 1 - 알루미늄 4cm x8cm x1cm 블록 </td><td></td><td></td><td> 현지 철물점 또는 금속 스크랩 야드 </td><td> $ 10.00 </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1.91 cm (3 / 4 &quot;) 평면 머리 볼트 W / 너트 그거 나올 </td><td></td><td></td><td> 지역 철물점 </td><td> $ 0.98 </td></tr><tr><td> 3 - # 4 0.95 cm (3 / 8 &quot;) 홈 붙이 둥근 볼트 W / 너트 </td><td></td><td></td><td> 지역 철물점 </td><td> $ 0.98 </td></tr><tr><td> 15 - # 10 와셔 </td><td></td><td></td><td> 지역 철물점 </td><td> $ 0.98 </td></tr><tr><td> 2 - 투명 플라스틱 clipboards </td><td></td><td></td><td> 지역 사무실 가게 </td><td> $ 6.84 </td></tr><tr><td> 1 - Cryo - EM 격자 상자 홀더 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo - EM 그리드 상자 처리 막대 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 홀리 탄소 필름, 400 메쉬 구리 cryo - EM 지원 그리드 </td><td> SPI 용품 </td><td> 4340C - XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> 실험 재료 <ol><li> 효모 변형 : Hta1 - CFP : 카플란 실험실에서 KanMX6 : 칸 (KSC - 3382 : 마타, ura3 - 52, lys2 - 801, ade2 - 101, trp1 - Δ63, his3 - Δ200, leu2 - Δ1, Hta1 - CFP : UC 데이비스). </li><li> Cryo - 라이트 현미경 : Cryo - 가벼운 현미경 이미지는 Leica DFC310 FX CCD 카메라와 Leica DM4000M 반사 현미경에서 찍은. 명시야, 암시야 및 형광 이미지는 중 HCX PL FLUOTAR 배 0.15 NA 공기 목적, HCX PL FLUOTAR 10X 0.30 NA 공기 목적, PL FLUOTAR 50x 0.55 NA 공기 목적 또는 NPLAN 100x 0.75 NA 공기 목표를 사용하여 인수했다. 브라이트 필드와 다크 필드 이미지 광원으로 12V 100W 텅스텐 램프를 사용했습니다. 필터 큐브 형광 들어, EL6000 UV 램프 소스는 Leica JC1 (: BP 30분의 480, DM LP 505, BP SF 40분의 535 &amp; LP 580 Ex.F.)와 함께 사용되었다. </li><li> Cryo - 전송 전자 현미경 : Cryo - EM 이미지는 Gatan 626 cryo 전송 홀더 (Gatan, 미국) 이용 200 케빈에서 JEM - 2100 - FEG 전송 전자 현미경 (JEOL, 일본) 운영에 인수했다. Micrographs는 4096 X 4096 픽셀 Tietz CCD 카메라 (TVIPS, Gauting, 독일) 50, 200, 1,200 및 4,000 X의 공칭 배율로 기록되었다. </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

cryo - 가벼운 현미경 (cryo - LM)과 cryo - 전자 현미경의 결합 (cryo - EM)은 세포 역학과 ultrastructure을 이해하는 장점 번호를 포즈. 첫째, 전지는 두 기술에 대한 거의 원시 환경에서 몇 군데 있습니다. vitrification 과정으로 인해, 둘째로, 샘플은 빠른 물리적 고정보다는 느린 화학적 고정에 의해 보존되어 있습니다. 셋째, 이미지는 cryo - LM 및 cryo - EM 모두 같은 예제는 하나의 세포가 아닌 &quot;대표 샘플&quot;의 비교에서 데이터의 상관 관계를 제공합니다. 이러한 혜택을 잘 이전 연구에서 알려져 있지만, 상호 cryo - LM 및 cryo - EM 유해 널리 사용은 적합한 극저온 가벼운 현미경 단계를 사거나 건물의 비용과 복잡으로 인해 제한. 여기서 우리는 조립을 설명하고, 지역의 하드웨어와 식료품점에서 발견된 부품 달러 미만 40 어떤 실험실에서 조작된 수있는 저렴한 극저온 단계 중 하나를 사용하십시오. 이 cryo - LM 단계는 긴 작동 거리 공기 목표 장착되어 아르 반사광 현미경과 함께 사용하도록 설계되었습니다. 상호 cryo - LM 및 cryo - EM 연구, 우리는 표본의 지원으로 탄소 코팅 표준 3 - mm cryo - EM의 격자의 사용을 개작. 그리드에 샘플을 adsorbing 후 샘플을 vitrifying 및 전송 / 격자를 처리 이전에 설립된 프로토콜은 다중 기술 이미징을 허용하기 위해 다음 있습니다. 따라서,이 설치 프로그램은 반사광 현미경있는 모든 무기를 냉동 수산화 샘플의 직접적인 상호 이미지에 액세스할 수 있습니다.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

우리는 대부분의 빛을 반사 현미경에 맞게 설계된 저가의 극저온 단계의 제조를 보여줍니다. 이 연구소 - 건설 극저온 단계 cryo - 빛과 cryo - 전자 현미경 사이에 효율적이고 신뢰할 수있는 상호 이미지 수 있습니다.

상관 라이트 / 전자 현미경을위한 저가의 Cryo - 라이트 현미경 스테이지 제작

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K 조회수.  University of California Davis. 우리는 대부분의 빛을 반사 현미경에 맞게 설계된 저가의 극저온 단계의 제조를 보여줍니다. 이 연구소 - 건설 극저온 단계 cryo - 빛과 cryo - 전자 현미경 사이에 효율적이고 신뢰할 수있는 상호 이미지 수 있습니다.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

높은 처리량 마이크로 유체 신속하고 저렴한 비용으로 프로토 타입 포장 방법

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

액상 사출 성형을위한 3D 인쇄 금형을 사용하여 의료 기기의 신속하고 저렴한 프로토 타이핑

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...