저자는 본 연구에서 사용되는 효모 변형에 대한 액세스를 제공하는 브랜든 J. Zipp와 켄 B. 카플란 감사하고 싶습니다. 저자는 또한 찍고와 지원을 훌리오 레닌 도밍게즈 - 라미레즈 감사합니다. 말씀 그랜트 번호 5RC1GM91755에서 NIH 자금 지원을 인정한다.

1. 제작 및 조립 <ol><li> .. 그림 1C에 표시된 22.96 cm (9 &quot;) 파이 냄비 냄비의 측면에서 약 2cm, 검은색 마커 펜, 알루미늄 방열판에 대한 마크 구멍 참고를 사용하여 내부의 알루미늄 방열판을 장소 : 경우 알루미늄 블록이 (에서 지역 고철 가게 또는 온라인에서 구입 <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) 사전 뚫고 구멍이 ​​오지 않습니다, 당신은 구멍이 몰락하고 알루미늄을 확보하기 위해 1 단계로 이전 접시하도록 주선해야합니다 파이 이동 차단. 우리는 질소 가스의 거품이 알루미늄 아래에서 탈출 수 있도록 플랫폼을 4 추가 구멍에 블록을 확보 5 구멍을 사용합니다. </li><li> 알루미늄 방열판의 위치 근처 cryo - 격자 상자를 놓고 노치와 각 측면을 표시합니다. </li><li> 알루미늄 방열판 구멍에 대한 # 17 드릴 비트 및 cryo - 격자 상자 구멍에 # 35 드릴 비트를 사용하여 각 표시된 위치에 대한 파일럿 구멍을 드릴. </li><li> 5를 사용하고 알루미늄 방열판을 마운트 - # 10, 1.9 cm (3 / 4 &quot;) 민머리 홈 붙이 볼트와 해당 너트뿐만 아니라 15 - # 10 와셔 두 개 알루미늄 블록 아래 세탁기와 뒷면에 세 번째. . 각 구멍 참고를위한 파이 팬 :보기 영역 근처의 알루미늄 블록의 보안되지 overhangs는 무대의 이미징 기능을 제한 진동이 발생할 수있는 모든 마운팅 볼트가 확고하게 강화되어 있는지 확인합니다.. </li><li> 삽입 3 - # 4 0.95 cm (3 / 8 &quot;) cryo - 격자 상자 마운트 역할을 파이 팬 뒷면의 홈 붙이 볼트와 너트를 해당 라운드. </li><li> 또 꼭대기에 한 젓가락과 쌍 4 젓가락 함께 테이프. 스페이서 역할을하는 케이크 냄비의 맞은편 가장자리에 테이프 각 쌍을. </li><li> 케이크와 파이의 젖은 위쪽과 아래쪽 표면 ddH 2 O.로 각각 냄비 </li><li> 스프레이 거품 절연 두 레이어 케이크 팬을 채우십시오. 다음 단계로 진행하기 전에 각각의 레이어를 젖음. </li><li> 거품에 파이 팬을 누르십시오. </li><li> 거꾸로 팬 플립과 스페이서가 파이 팬에 문의 때까지 케이크 팬에을 누르십시오. 케이크 팬 위에 어떤 가중치 물체를 놓고 치료 밤새 앉아 보자. </li><li> 톱니 모양의 나이프로, 초과는 냄비의 가장자리에서 스프레이 거품 절연 건조 버려야하고 젓가락을 제거합니다. </li><li> 파이 팬의 케이크 팬을 제거합니다. 알루미늄 방열판과 파이 팬은 현재 단열재이며, &quot;극저온 무대&quot;(그림 1A)이라고합니다. </li><li> 극저온 무대의 맨 위에 투명한 플라스틱 클립 보드 (모든 색상과 두께 이상 3mm) 장소. 검은 표지 약 1.5 배 하나의 둥근 cryo - 격자 상자의 직경 동그라미를 그림으로써 cryo - 격자 상자 마운트의 위치를​​ 표시합니다. 1.9 cm (3 / 4 &quot;)로 구멍을 잘라 구멍을 보았다.이 클립 보드에이라고도한다&quot;로딩 화면 &quot;(그림의 1B). </li><li> 극저온 무대와 직접 목적 렌즈 아래에있는 방열판과 함께 현미경에 장소 위에 새로운 투명한 클립 보드에 넣고. 그들은 회전으로 ​​검은색 마커와 목표의 경로를 표시합니다. </li><li> 클립 보드의 가장자리에서 반 동그라미를 제거 표시된 선을 따라 잘라. 이것은 퍼즐이나 동영상과 같이 구멍을 여러 번 보았다 7.62 cm (3 &quot;)를 이용하여 수행할 수 있습니다. </li><li> 마지막으로 접시의 영역 내에서 하프 서클에서하지만, 여전히 1.9 cm (3 / 4 &quot;) 구멍을 뚫고.이 포트 될 수준 드롭하는 경우 이미징.이 클립 보드에이 언급되지만 액체 질소 (lN 2) 충진을위한 &quot;보는 화면&quot;(그림 1C)로. </li></ol> 2. 샘플 준비 <ol><li> 1x10 6 셀 / 물에 ML의 적절한 농도로 합성 전체 (SC) 미디어 재배 로그 위상 효모 세포를 희석. </li><li> 희석 효모 2 ML은 R2 / 1 400 메쉬 홀리 탄소 코팅 구리 cryo - EM 그리드 (SPI 용품, 웨스트 체스터, PA)에 pipetted 15 초 동안 adsorb 수 있습니다. </li><li> 2 초 부드러운 셀룰로오스 조직의 찢어진 조각 (Kimwipe)에 그리드의 뒷면을 만져 격자 표면 가까이 초과 액체를 얼룩. </li><li> 필요한 경우, 격자 3 μL의 물을 방울 (1-3 회)하고, 악한 거리에 3 단계에서와 같이 뒤쪽에서 모래 바닥에서 함께 세탁하실 수 있습니다. </li><li> 최종 세척하기 전에 샘플 공압 플런지 냉동고에로드되고 매달려 그리드는 2.4 단계로 세탁합니다. 표면에서 물의 대부분을 제거하는 찢어진 티슈 (Kimwipe)로 격자를 모래 바닥 후, 격자는 액체 에탄을 냉각 lN이 속으로 뛰어들하고 저장 1 참고를위한 cryo - 격자 상자로 전송 :. 그것은 중요합니다 샘플 수산화 유지하기 위해 표면에 가능한 얇은 같은 액체의 레이어를 두십시오. 부적 절한 모래 바닥도 샘플을 건조 또는 전자빔을 불투​​명 얼음을 떠날 것입니다. </li></ol> 3. Cryo - 라이트 현미경 <ol><li> 극저온 무대로 채워lN 2는 빠르게 로딩 화면 (싱글 1.9 cm (3 / 4 &quot;) 구멍이있는 플라스틱 클립 보드)를 커버. </li><li> 일단 금속 부분 A5에서 설명하는 3 개의 나사에 의해 만들어진 마운트 1.9 cm (3 / 4 &quot;) 로딩 화면의 구멍을 통하여 전송에 cryo - 격자 상자를 전송, lN이 온도에 도달합니다. 돌려서 cryo - 격자 상자 의 홀더에서합니다. 향상 액세스를위한 홀더를 제거 단계를 3.10까지 별도의 듀어에 lN이 아래 cryo - 격자 상자 홀더 보관하십시오. cryo - 격자 상자도 샘플 그리드 온난 화를 방지하기 위해 lN 2 조에 보관해야합니다. </li><li> . 단 알루미늄 방열판의 상단에 아래의 극저온 단계에 리필 lN 2 주 : lN이 수준을 정기적으로 체크하고 lN 2 방열판과 접촉 지속되도록 이미징 과정 리필해야합니다. 일반적으로 충진이 보는 화면에서 입력 포트를 통해 10 분마다 발생합니다. </li><li> lN 2 미리 시원한 트위터 팁 다음 1.9 cm (3 / 4 &quot;) 로딩 화면의 구멍을 사용하여 핀셋으로 알루미늄 방열판의 평면 볼 표면에 귀하의 격자 (들)을 전송합니다. </li><li> 조심스럽게 반사 조명 현미경의 목표 apertures 아래에 cryo 단계로 이동합니다. </li><li> 로딩 화면 위에 투명한보기 화면을 놓습니다. . 그런 다음 천천히 보는 화면 참고 아래를 슬라이딩하여 로딩 화면을 제거합니다이 시점에서, 샘플은 가장 취약합니다. 현미경 주위에 모든 공기 흐름이 포함 최소화한다 : 가까운 문이 ​​열린 사람들은 과거의 산책, 호흡 등 우리는 안면을 입고하거나 예방책으로 현미경 eyepieces 아래 투명한 얼굴 방패를 달아 좋습니다. </li><li> cryo 단계 및 평면 방열판보기 영역에있는 샘플에 대한 검사의 차가운 질소 가스 환경에 목적 렌즈를 회전합니다. 센터를 찾아 개요 이미지을 위해 낮은 배율 목적으로 그리드에 대한 표준 명시야 조명 현미경 기술의 초점을 사용합니다. 본 실험에 사용된 조명 현미경 렌즈에 관한 스펙은 실험 자료 섹션에 나열되어 있습니다 참고 :. lN 2 목적 렌즈와 접촉하지 않고 우리는 냉각의 영향에서 이미지 또는 렌즈 손상의 저하를 볼 아직 . </li><li> 관심 지역에 높은 배율에서 초점 명시야, 암시야, 편광 또는 형광 이미징 데이터를 취득. 미래의 상관 관계에 대한 낮은 배율 명시야 이미지에 관심 영역의 위치를​​ 기록해야합니다. lN 2 충진을 위해 위에 나열된 모든 예방 조치가 뒤에있다면 증발 질소의 긍정적인 압력이 영상의 기간 동안 무료로 환경을 오염 (객실 습도 독립) 유지하기 위해 충분합니다. </li><li> 끝나면보기 화면 상단을 통해 그것을 슬라이딩하여 로딩 화면을 바꿉니다. 로딩 화면 아래를 슬라이딩 둔화하여보기 화면을 제거합니다. </li><li> 현미경에서 cryo 단계를 제거하고 미리 냉각 핀셋으로 cryo - 격자 상자에 다시 격자를 전송합니다. 환경에 대한 봉인 및 스토리지와 미래의 이미지에 대한 lN2 듀어에 홀더를 전송하는 cryo - 그리드 상자에 cryo - 격자 상자 홀더 나사. </li></ol> 4. Cryo - 전자 현미경 <ol><li> 항상 액체 질소 온도에서 표본을 유지하면서 표준 및 구축 기법에 따라, cryo - EM 전송 홀더에 샘플 격자를로드합니다. </li><li> 전송 전자 현미경에 샘플 격자와 cryo - 홀더를 삽입합니다. </li><li> 적합한 낮은 배율보기 (50 - 500x 공칭 배율)에서 샘플 격자의 중심을 찾으십시오. </li><li> 그리드의 중앙 구리 탭의 상​​대적 방향을 (그림 2에서 설명) 확인하고 상관 관계에 대한 관심의 정확한 지역을 식별하는 단계 3.7에서 이전에 수집된 낮은 배율 cryo - LM 데이터를 사용합니다. </li><li> 현미경 정렬, 낮은 복용량 cryo - EM 영상과 데이터 수집을 진행. </li></ol> 5. 대표 결과 극저온 단계 (그림 1A)는 cryo - 형광 현미경과 상호 cryo-LM/cryo-EM 분석을 위해 cryo - LM 데이터를 수집하는 효과적인 방법입니다. 그림 2는 낮은 높은 배율 cryo - LM 이미지의 조합이 당신이 cryo - EM의 특정 영역에 대한 직접 참조지도를 만들 수 있도록하는 방법을 보여줍니다. 결과 cryo - LM 참조지도 (그림 2B)는 그림 3에 표시된 정확한 지역을 찾을 수 cryo - EM 데이터 수집 동안 이용되었다. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 극저온 무대.) 극저온 단계의 레이아웃은 마운트가 w를 표명 cryo - 격자 상자를 전송로 구성되어 있습니다ith 흰색 화살표와 알루미늄 방열판. 격자는 cryo - 격자 상자에서 lN 2 조에 전송과 검정색 화살표로 방열판의보기 영역에 직접 배치. B) 이미지 화면 로딩과 함께 극저온 단계를 묘사하고 있습니다. 포트 샘플을 전송하고 핀셋으로 방열판에 샘플보기 영역에 cryo - 격자 상자에서 샘플을 이동하십시오. C) 극저온에로 로딩 화면에 구멍이 cryo - 격자 상자를 탑재하고 행동을 통해 직접 배치됩니다 장소에 보는 화면과 목적에 따라 렌즈 위치에 무대. 보기 화면에서 특별 컷아웃은 객관적 렌즈가 쉽게 극저온 무대를 이동하지 않고 위치로 스윙 할 수 있습니다. 멀리 샘플 영역에서 보는 화면의 구멍이 필요한 경우 lN이 수준을 보충하기 위해 포트를 채울 lN이 역할을합니다. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 상호 연구 cryo - LM의 탐색은. 효모 세포의) 낮은 배율 cryo - LM보기 샘플 모눈을 준수. B)에 동일한 이미지가 (A) 관심 지역의 높은 배율 형광 이미지를 중첩 그리고 채워진 다각형 오렌지와 샘플 격자의 중심을 표시. 센터는 별도의 금속 탭을 앞으로 오픈하는 데 사 사각형, 세 그룹으로 구성되어 있습니다. 추가 금속 탭을와 세번에 대한 두 쌍은 비대칭 중심을 형성 장기 및 단기 축에 대한 탭을 공유할 수 있습니다. 이 비대칭 센터는 왼쪽 상단에서 볼 수 있으며, cryo - LM 및 cryo - EM 사이의 격자의 회전 각도와 handedness를 표시하는 데 사용되었다. 관심 중 하나가 낮은 배율 이미지 여러 지역에서 표시 할 수 있습니다 cryo - EM에서 동일한 영역을 찾을 참조지도로 사용. (B)에 대한 관심의 영역 C) 확대 형광 cryo - LM 이미지. HTA1 - CFP, C - 터미널 CFP 히스톤 마커가, 핵의 위치를 라벨 녹색 작은 반점이있는 구조로 볼 수 있습니다.에서는 해당 지역의 D) cryo - EM 이미지 (C). 스케일 바가 50 미크론을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. cryo - LM 및 cryo - EM의 상관 관계. 동일한 효모 세포를 묘사 볼 두 가지 분야가 (C, F cryo - 명시야 (A, D), cryo - 형광 (B, E), 그리고 cryo - EM과 상관 ). 스케일 바는 5 미크론을 나타냅니다.

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	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

저자는 경쟁 금융 이익을 선언하지 않습니다.

<p class="jove_content"&gt; 우리의 극저온 무대와 샘플 준비 기술, cryo - LM 및 cryo - EM 사이의 상호 연구를 사용하면 포함하며 이에 제한되지 않음 방식 전통적인 실내 온도를 통해 여러 가지 혜택을 전시 : 빠른 고정을<sup&gt; 1,2</sup&gt; photobleaching 감소<sup&gt; 3</sup&gt;, 그리고 cryo - EM하기 전에 샘플 무결성 검사<sup&gt; 4,5</sup&gt; 또는 화학적 고정 / 퍼가기<sup&gt; 6</sup&gt;. cryo - EM 데이터 수집에 대한 병목 현상 중 하나는 TEM에 샘플을 전송 및 이미지에 맞는 지역을 찾을 수있는 격자를 스캔 모두에 필요한 시간입니다. cryo - LM의 신속한 데이터 수집과 함께<sup&gt; 5</sup&gt; 시간이 좋은 세포를 찾는 지출을 획기적으로 줄일 수 있습니다. 따라서, 우리는 시간과 비용을 모두 저장하고 사전 검사 및 cryo - LM의 관심 분야를 매핑하여이 병목 현상을 완화 수 있습니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 더 비싼이나 복잡한 극저온 단계 높은 해상도 cryo - LM 영상을 허용할 수 있습니다. 그러나, 여기에 가공 무대는 많은 애플 리케이션에 적합한 이상입니다. cryo - LM 이미징 및 샘플 그리드 전송이로 텍스트와 비디오에 설명된주의 수행하는 경우에는 완전히 오염 무료로 영상을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 동일한 세포, organelle 또는 macromolecular 복합 형광 및 전자 현미경 데이터의 직접적인 상관 관계가 탄소 지원에 분산 또는 얇은 조직 섹션에 포함된 수<sup&gt; 7</sup&gt;. 그것이 극저온 단계의 값이 전반적으로 가벼운 현미경 분야에 cryo-LM/cryo-EM 상호 연구 초월해 것을인지해야합니다. 이 극저온 단계는 물론 섬세한 샘플 및 형광단의 염료 / 얼룩 모두에 적합합니다<sup&gt; 8</sup&gt;, 양자 점, 또는 찬란 태그 단백질<sup&gt; 9</sup&gt; 글루 타 알데히드와 paraformaldehyde로 실온 화학 고정 및 삽입하는 동안 불안정하게 될 수 있습니다. 결과적으로, 우리는이 극저온 단계 이전 비용과 부족한 액세스를 통해 범인되었습니다 cryo - LM, 관심들에게 큰 액세스를 제공할 수 있기를 바랍니다.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 문제 해결 Cryo - 라이트 현미경</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. 샘플 흡착 :</em&gt; 다른 샘플은 탄소 지원하기 위해 변수를 흡착 특성을 전시하실 수 있습니다. 당신은 지속적인 탄소, 홀리 탄소, 또는 샘플 지원 formvar 코팅 격자로 지원 격자의 다른 유형을 사용하는 것이 필요 찾을 수 있습니다. 또한 예제에서는 모눈 아니라 탄소 표면의 구리 막대에 바인딩하는 경우, 그것은 젖음 요원으로 격자를 잠복기하거나 글로는 샘플 추가하기 전에 방전에 의해 탄소 표면 화학을 조정해야 할 수도 있습니다.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. 스테이지 안정성 :</em&gt;는 진동을 통지하는 경우, 그것은 가능성이 체중보다는 lN2의 버블링과 과부하가되는 샘플 단계에 의한 것입니다. 극저온 무대의 추가 무게는 때로는 낮은 주파수 진동은 표준 3 축 여행 현미경 스테이지를 따라 전송하는 원인, 그리고 부정적인 흐리게 통해 이미지에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 쉽게 동영상과 같이, 이중 나사 무기로 조절 미니 리프트 또는 조절 어댑터 중 하나와 함께 아래에서 현미경의 여행 무대를 지원함으로써 해결할 수 있습니다. 이러한 조정 지원 메커니즘을 모두 여행 스테이지의 비 움직일 수있는 부분과 상호 작용하기 때문에 영상이 필요로 여전히 X와 Y 축 변환을 허용합니다.</p

특정 시약 및 장비의 테이블 : <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 # </th><th> 댓글 </th><th> 비용 </th></tr><tr><td> 1-22.86 cm (9 &quot;) sloped 가장자리로 파이 팬 </td><td> 좋은 쿡 </td><td></td><td> 현지 식료품점 </td><td> $ 4.39 </td></tr><tr><td> 1-22.86 cm (9 &quot;) 케이크 팬 </td><td> 좋은 쿡 </td><td></td><td> 현지 식료품점 </td><td> $ 4.93 </td></tr><tr><td> 젓가락 4쌍 </td><td></td><td></td><td> 현지 식료품점 </td><td> $ 0.50 </td></tr><tr><td> 1 - 그레이트 콘텐츠 스프레이 폼 </td><td> 좋은 음식 </td><td></td><td> 지역 철물점 </td><td> $ 5.98 </td></tr><tr><td> 1 - 알루미늄 4cm x8cm x1cm 블록 </td><td></td><td></td><td> 현지 철물점 또는 금속 스크랩 야드 </td><td> $ 10.00 </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1.91 cm (3 / 4 &quot;) 평면 머리 볼트 W / 너트 그거 나올 </td><td></td><td></td><td> 지역 철물점 </td><td> $ 0.98 </td></tr><tr><td> 3 - # 4 0.95 cm (3 / 8 &quot;) 홈 붙이 둥근 볼트 W / 너트 </td><td></td><td></td><td> 지역 철물점 </td><td> $ 0.98 </td></tr><tr><td> 15 - # 10 와셔 </td><td></td><td></td><td> 지역 철물점 </td><td> $ 0.98 </td></tr><tr><td> 2 - 투명 플라스틱 clipboards </td><td></td><td></td><td> 지역 사무실 가게 </td><td> $ 6.84 </td></tr><tr><td> 1 - Cryo - EM 격자 상자 홀더 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo - EM 그리드 상자 처리 막대 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 홀리 탄소 필름, 400 메쉬 구리 cryo - EM 지원 그리드 </td><td> SPI 용품 </td><td> 4340C - XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> 실험 재료 <ol><li> 효모 변형 : Hta1 - CFP : 카플란 실험실에서 KanMX6 : 칸 (KSC - 3382 : 마타, ura3 - 52, lys2 - 801, ade2 - 101, trp1 - Δ63, his3 - Δ200, leu2 - Δ1, Hta1 - CFP : UC 데이비스). </li><li> Cryo - 라이트 현미경 : Cryo - 가벼운 현미경 이미지는 Leica DFC310 FX CCD 카메라와 Leica DM4000M 반사 현미경에서 찍은. 명시야, 암시야 및 형광 이미지는 중 HCX PL FLUOTAR 배 0.15 NA 공기 목적, HCX PL FLUOTAR 10X 0.30 NA 공기 목적, PL FLUOTAR 50x 0.55 NA 공기 목적 또는 NPLAN 100x 0.75 NA 공기 목표를 사용하여 인수했다. 브라이트 필드와 다크 필드 이미지 광원으로 12V 100W 텅스텐 램프를 사용했습니다. 필터 큐브 형광 들어, EL6000 UV 램프 소스는 Leica JC1 (: BP 30분의 480, DM LP 505, BP SF 40분의 535 &amp; LP 580 Ex.F.)와 함께 사용되었다. </li><li> Cryo - 전송 전자 현미경 : Cryo - EM 이미지는 Gatan 626 cryo 전송 홀더 (Gatan, 미국) 이용 200 케빈에서 JEM - 2100 - FEG 전송 전자 현미경 (JEOL, 일본) 운영에 인수했다. Micrographs는 4096 X 4096 픽셀 Tietz CCD 카메라 (TVIPS, Gauting, 독일) 50, 200, 1,200 및 4,000 X의 공칭 배율로 기록되었다. </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

cryo - 가벼운 현미경 (cryo - LM)과 cryo - 전자 현미경의 결합 (cryo - EM)은 세포 역학과 ultrastructure을 이해하는 장점 번호를 포즈. 첫째, 전지는 두 기술에 대한 거의 원시 환경에서 몇 군데 있습니다. vitrification 과정으로 인해, 둘째로, 샘플은 빠른 물리적 고정보다는 느린 화학적 고정에 의해 보존되어 있습니다. 셋째, 이미지는 cryo - LM 및 cryo - EM 모두 같은 예제는 하나의 세포가 아닌 &quot;대표 샘플&quot;의 비교에서 데이터의 상관 관계를 제공합니다. 이러한 혜택을 잘 이전 연구에서 알려져 있지만, 상호 cryo - LM 및 cryo - EM 유해 널리 사용은 적합한 극저온 가벼운 현미경 단계를 사거나 건물의 비용과 복잡으로 인해 제한. 여기서 우리는 조립을 설명하고, 지역의 하드웨어와 식료품점에서 발견된 부품 달러 미만 40 어떤 실험실에서 조작된 수있는 저렴한 극저온 단계 중 하나를 사용하십시오. 이 cryo - LM 단계는 긴 작동 거리 공기 목표 장착되어 아르 반사광 현미경과 함께 사용하도록 설계되었습니다. 상호 cryo - LM 및 cryo - EM 연구, 우리는 표본의 지원으로 탄소 코팅 표준 3 - mm cryo - EM의 격자의 사용을 개작. 그리드에 샘플을 adsorbing 후 샘플을 vitrifying 및 전송 / 격자를 처리 이전에 설립된 프로토콜은 다중 기술 이미징을 허용하기 위해 다음 있습니다. 따라서,이 설치 프로그램은 반사광 현미경있는 모든 무기를 냉동 수산화 샘플의 직접적인 상호 이미지에 액세스할 수 있습니다.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

우리는 대부분의 빛을 반사 현미경에 맞게 설계된 저가의 극저온 단계의 제조를 보여줍니다. 이 연구소 - 건설 극저온 단계 cryo - 빛과 cryo - 전자 현미경 사이에 효율적이고 신뢰할 수있는 상호 이미지 수 있습니다.

상관 라이트 / 전자 현미경을위한 저가의 Cryo - 라이트 현미경 스테이지 제작

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K 조회수.  University of California Davis. 우리는 대부분의 빛을 반사 현미경에 맞게 설계된 저가의 극저온 단계의 제조를 보여줍니다. 이 연구소 - 건설 극저온 단계 cryo - 빛과 cryo - 전자 현미경 사이에 효율적이고 신뢰할 수있는 상호 이미지 수 있습니다.

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

연구

생체공학

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

생화학

Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function

Samples are usually placed onto a horizontal microscope stage for microscopic observation. However, to observe the influence of gravity on a sample or study afloat behavior, it is necessary to make the microscope stage vertical. To accomplish this, a sideways inverted microscope tilted by 90&#176; has been devised. To observe samples with this microscope, sample containers such as Petri dishes or glass slides must be secured to the stage vertically. A device that can secure sample containers in place on a vertical microscope stage has been developed and is described here. Attachment of this device to the stage allows observation of sample dynamics in the vertical plane. The ability to regulate temperature using a silicone rubber heater also permits observation of temperature-dependent sample behaviors. Furthermore, the temperature data is transferred to an internet server. Temperature settings and log monitoring can be controlled remotely from a PC or smartphone.

Presented here is a protocol using a temperature-controlled microscope stage that allows a sample container to be mounted on a vertical microscope.

온도 제어 기능을 갖춘 수직 관찰을 위한 현미경 단계 제작

Samples are usually placed onto a horizontal microscope stage for microscopic observation. However, to observe the influence of gravity on a sample or ...

공학

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could easily be adapted for other biological samples. The basic principles for preparing samples, milling, and viewing lamellae are common to all instruments and the protocol can be followed as a general guide to on-grid cryo-lamella preparation for cryo-electron microscopy (cryoEM) and cryo-electron tomography (cryoET). Electron microscopy grids supporting the cells are plunge-frozen into liquid nitrogen-cooled liquid ethane using a manual or automated plunge freezer, then screened on a light microscope equipped with a cryo-stage. Frozen grids are transferred into a cryo-scanning electron microscope equipped with a focused ion beam (cryoFIB-SEM). Grids are routinely sputter coated prior to milling, which aids dispersal of charge build-up during milling. Alternatively, an e-beam rotary coater can be used to apply a layer of carbon-platinum to the grids, the exact thickness of which can be more precisely controlled. Once inside the cryoFIB-SEM an additional coating of an organoplatinum compound is applied to the surface of the grid via a gas injection system (GIS). This layer protects the front edge of the lamella as it is milled, the integrity of which is critical for achieving uniformly thin lamellae. Regions of interest are identified via SEM and milling is carried out in a step-wise fashion, reducing the current of the ion beam as the lamella reaches electron transparency, in order to avoid excessive heat generation. A grid with multiple lamellae is then transferred to a transmission electron microscope (TEM) under cryogenic conditions for tilt-series acquisition. A robust and contamination-free workflow for lamella preparation is an essential step for downstream techniques, including cellular cryoEM, cryoET, and sub-tomogram averaging. Development of these techniques, especially for lift-out and milling of high-pressure frozen samples, is of high-priority in the field.

Using focused ion beam milling to produce vitreous on-grid lamellae from plunge frozen biological samples for cryo-electron tomography.

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure determination by SPA relies upon obtaining multiple distinct views of a macromolecular object vitrified within a thin layer of ice. Ideally, a collection of uniformly distributed random projection orientations would amount to all possible views of the object, giving rise to reconstructions characterized by isotropic directional resolution. However, in reality, many samples suffer from preferentially oriented particles adhering to the air-water interface. This leads to non-uniform angular orientation distributions in the dataset and inhomogeneous Fourier-space sampling in the reconstruction, translating into maps characterized by anisotropic resolution. Tilting the specimen stage provides a generalizable solution to overcoming resolution anisotropy by virtue of improving the uniformity of orientation distributions, and thus the isotropy of Fourier space sampling. The present protocol describes a tilted-stage automated data collection strategy using Leginon, a software for automated image acquisition. The procedure is simple to implement, does not require any additional equipment or software, and is compatible with most standard transmission electron microscopes (TEMs) used for imaging biological macromolecules.

The present protocol describes a generalized and easy-to-implement scheme for tilted single-particle data collection in cryo-EM experiments. Such a procedure is especially useful for obtaining a high-quality EM map for samples suffering from preferential orientation bias due to adherence to the air-water interface.

Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

VSFG 현미경을 사용하여 다중 모드, 신속, 초분광 화학 분석

Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy

Vibrational sum-frequency generation (VSFG), a second-order nonlinear optical signal, has traditionally been used to study molecules at interfaces as a spectroscopy technique with a spatial resolution of ~100 &#181;m. However, the spectroscopy is not sensitive to the heterogeneity of a sample. To study mesoscopically heterogeneous samples, we, along with others, pushed the resolution limit of VSFG spectroscopy down to ~1 &#181;m level and constructed the VSFG microscope. This imaging technique not only can resolve sample morphologies through imaging, but also record a broadband VSFG spectrum at every pixel of the images. Being a second-order nonlinear optical technique, its selection rule enables the visualization of non-centrosymmetric or chiral self-assembled structures commonly found in biology, materials science, and bioengineering, among others. In this article, the audience will be guided through an inverted transmission design that allows for imaging unfixed samples. This work also showcases that VSFG microscopy can resolve chemical-specific geometric information of individual self-assembled sheets by combining it with a neural network function solver. Lastly, the images obtained under brightfield, SHG, and VSFG configurations of various samples briefly discuss the unique information revealed by VSFG imaging.

저자 스포트라이트: Mesoscopically Heterogeneous Self-Assembled Structures 연구에서 VSFG 현미경의 잠재력 공개 

A multimodal, rapid hyperspectral imaging framework was developed to obtain broadband vibrational sum-frequency generation (VSFG) images, along with brightfield, second harmonic generation (SHG) imaging modalities. Due to the infrared frequency being resonant with molecular vibrations, microscopic structural and mesoscopic morphology knowledge is revealed of symmetry-allowed samples.

라인 스캐닝 진동 합계-주파수 생성 현미경을 사용한 다중 모드 비선형 초분광 화학 이미징

Vibrational sum-frequency generation (VSFG), a second-order nonlinear optical signal, has traditionally been used to study molecules at interfaces as a ...

화학

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

높은 경사 구축 가이드 확장 된 시야의 단일 분자 이미징 타일 현미경을 휩 쓸

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

상관 라이트 / 전자 현미경을위한 저가의 Cryo - 라이트 현미경 스테이지 제작

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동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

온도 제어 기능을 갖춘 수직 관찰을 위한 현미경 단계 제작

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집

라인 스캐닝 진동 합계-주파수 생성 현미경을 사용한 다중 모드 비선형 초분광 화학 이미징

라인 스캐닝 진동 합계-주파수 생성 현미경을 사용한 다중 모드 비선형 초분광 화학 이미징

라인 스캐닝 진동 합계-주파수 생성 현미경을 사용한 다중 모드 비선형 초분광 화학 이미징

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

높은 경사 구축 가이드 확장 된 시야의 단일 분자 이미징 타일 현미경을 휩 쓸