Name: Serie: Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00
Duration: 10 min
Description: 15.4K Aufrufe. University of California Davis. Wir zeigen die Herstellung eines Low-Cost-Kryo-Stadium entwickelt, um die meisten Auflichtmikroskope fit. Dieses Labor gebaut kryogenen Stufe ermöglicht eine effiziente und zuverlässige korrelative Bildgebung zwischen Kryo-Licht und Kryo-Elektronenmikroskopie.

Die Autoren möchten sich Brandon J. Zipp und Ken B. Kaplan für den Zugang zu den Hefestamm in dieser Studie verwendeten danken. Die Autoren danken auch Julio Lenin Dominguez-Ramirez für die Unterstützung bei Videoaufnahmen. JEE erkennt NIH finanzieller Unterstützung gewähren Zahl 5RC1GM91755.

1. Fertigung und Montage <ol><li> Setzen Sie die Aluminium-Kühlkörper im Inneren des 22,96 cm (9 &quot;) Kuchenform ca. 2 cm von der Seite der Pfanne, wie in Abbildung 1c gezeigten Mit einem schwarzen Filzstift markieren Löcher für die Aluminium-Kühlkörper Hinweis:.. Wenn das Aluminium Block (gekauft in einem lokalen Schrott-Shop oder online unter <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) nicht mit vorgebohrten Löchern kommen, müssen Sie vereinbaren, dass Löcher gebohrt und die vor dem 1. Schritt, um das Aluminium zu sichern versenkt Block auf die Kuchenform. Wir haben 5 Löcher, um den Block auf die Plattform und 4 extra Löcher zu sichern, damit Stickstoff Gasblasen unter dem Aluminium zu entkommen. </li><li> Legen Sie die Kryo-Gitterbox in der Nähe der Position des Aluminium-Kühlkörper und markieren Sie die Kerbe und jeder Seite. </li><li> Bohren Sie Löcher für jede markierte Position mit einem # 17 Bohrer für die Aluminium-Kühlkörper Löcher und Nr. 35 Bohrer für die Kryo-Gitterbox Löcher. </li><li> Montieren Sie die Aluminium-Kühlkörper mit 5 - Nr. 10, 1,9 cm (4.3 &quot;) flacher Kopf Schlitzschrauben und entsprechenden Muttern sowie 15 - # 10 Scheiben Platz zwei Scheiben unter dem Aluminium-Block und der dritte auf der Rückseite der. Kuchenform für jedes Loch. Hinweis: Ungesicherte Überhänge der Aluminium-Block in der Nähe der Bildfläche kann in Schwingungen, die Möglichkeiten der Bildgebung von der Bühne zu begrenzen Ergebnis Überprüfen Sie, ob alle Schrauben fest angezogen sind.. </li><li> Insert 3 - Nr. 4, 0,95 cm (8.3 &quot;) runden Schlitz Schrauben und entsprechenden Muttern von der Rückseite der Kuchenform als Kryo-Gitterbox montieren zu handeln. </li><li> Tape 4 Stäbchen zusammen in Paaren mit einem Stäbchen auf einer anderen. Band jedes Paar an gegenüberliegenden Rändern der Kuchenform als Abstandshalter fungieren. </li><li> Wet den oberen und unteren Oberfläche des Kuchens und Kuchen Pfannen jeweils mit ddH 2 O. </li><li> Füllen Sie die Kuchenform mit zwei Schichten aus isolierenden Schaum. Benetzung jeder Schicht, bevor Sie zum nächsten Schritt. </li><li> Drücken Sie die Kuchenform in den Schaum. </li><li> Drehen Sie die Pfannen auf den Kopf und drücken Sie auf der Kuchenform, bis die Abstandshalter an die Kuchenform. Legen Sie alle gewichteten Objekt oben auf den Kuchen Pfanne und lassen sich über Nacht zu heilen. </li><li> Mit einem gezackten Messer, schneiden Sie das überschüssige getrocknet isolierende Spritzschaum vom Rand der Pfannen und entfernen Sie die Stäbchen. </li><li> Entfernen Sie die Kuchenform aus der Kuchenform. Die Kuchenform mit Aluminium-Kühlkörper ist nun isoliert und wird als &quot;Kryo-Bühne&quot; (Abb. 1a) bezeichnet werden. </li><li> Legen Sie eine transparente Kunststoff Zwischenablage (jeder Farbe und größer als 3 mm dick) über die Oberseite der kryogenen Bühne. Mark mit einem schwarzen Marker die Lage der Kryo-Gitterbox Montage durch Zeichnen eines Kreises ungefähr 1,5 fache des Durchmessers einer einzigen Runde Kryo-Gitterbox. Cut-out-Bohrloch mit einem 1,9 cm (4.3 &quot;) Loch sah. Diese Zwischenablage wird als die bezeichnet werden&quot; loading screen &quot;(Abb. 1b). </li><li> Legen Sie eine neue transparente Ablage oben auf der kryogenen Bühne und Platz auf dem Mikroskop mit dem Kühlkörper direkt unter dem Objektiv. Mit einem schwarzen Marker, markieren Sie den Pfad der Ziele, wie sie zu drehen. </li><li> Schneiden Sie entlang der markierten Linie das Entfernen eines Halbkreises vom Rand in die Zwischenablage. Dies kann mit einer Stichsäge oder mit einem 7,62 cm (3 &quot;) Lochsäge mehrmals wie im Video gezeigt, erreicht werden. </li><li> Schließlich schnitt ein 1,9 cm (4.3 &quot;) Loch weg von der Halbkreis, aber immer noch innerhalb des Bereichs der Schale. Dies wird den Hafen werden zum Nachfüllen flüssigem Stickstoff (LN 2), wenn Ebenen sinken, während Bildgebung. Diese Zwischenablage bezeichnet wird als &quot;Anzeige-Bildschirm&quot; (Abb. 1c). </li></ol> 2. Probenvorbereitung <ol><li> Verdünnen Sie log-Phase Hefezellen in synthetische vollständige (SC) Medien auf eine geeignete Konzentration von 1x10 6 Zellen / ml in Wasser gewachsen. </li><li> 2 mL der verdünnten Hefe sind auf einem R2 / 1 400 mesh löchrigen Kohlenstoff beschichtete Kupfer-Kryo-EM-Gitter (SPI Supplies, West Chester, PA) pipettiert und konnten zu adsorbieren für 15 Sekunden. </li><li> Blot entfernt überschüssige Flüssigkeit aus dem Netz Oberfläche durch Berühren der Rückseite des Gitters durch ein Stück weiches Gewebe Zellulose (Kimwipe) für 2 Sekunden. </li><li> Falls erforderlich, kann das Netz mit 3 ul Tropfen Wasser (1-3 mal), und abtransportiert wie in Schritt 3 durch Blotten von hinten gewaschen werden. </li><li> Vor dem letzten Waschschritt wird die Probe in die pneumatische stürzen Gefrierschrank geladen und die hängenden Gitter ist wie in Schritt 2.4 gewaschen. Nach dem Blotten des Gitters mit zerrissenen Seidenpapier (Kimwipe), um den größten Teil des Wassers von der Oberfläche entfernen, wird das Gitter in LN 2 stürzte gekühlt flüssigem Ethan und in ein Kryo-Gitterbox für die Lagerung 1 Hinweis:. Ist es wichtig, hinterlassen Sie eine Schicht aus flüssigem so dünn wie möglich an der Oberfläche zu halten die Probe hydratisiert. Unsachgemäße Blotting entweder Austrocknen der Probe oder verlassen Eis, das undurchlässig für den Elektronenstrahl. </li></ol> 3. Cryo-Light Microscopy <ol><li> Füllen Sie den kryogenen Stufe mitLN 2 und schnell mit dem Ladebildschirm (Kunststoff Klemmbrett mit einzelnen 1,9 cm (4.3 &quot;) Loch) zu decken. </li><li> Sobald das Metall erreicht LN 2 Temperatur, übertragen Sie die Kryo-Gitterbox durch die 1,9 cm (4.3 &quot;) Loch der Ladebildschirm und in der Übertragung Montage durch die 3 Schrauben in Teil A5 beschrieben erstellt. Lösen Sie die Kryo-Gitterbox aus der Halterung und entfernen Sie die Halterung für einen verbesserten Zugang. Bewahren Sie die Kryo-Raster-Halter unter lN 2 in einem separaten Dewar bis Schritt 3.10. Die Kryo-Gitterbox sollte auch unter LN 2 gehalten werden, um Probe Raster Erwärmung zu verhindern. </li><li> . Refill lN 2 in der kryogenen Stufe bis knapp unterhalb der Spitze des Aluminium-Kühlkörper Hinweis: lN 2 Ebenen muss regelmäßig überprüft und neu befüllt werden während der bildgebenden Verfahren, um sicherzustellen, LN 2 wird kontinuierlich in Kontakt mit dem Kühlkörper. In der Regel erfolgt das Nachfüllen alle 10 Minuten durch die Einfüllöffnung in den Bildschirm. </li><li> Pre-cool der Pinzette Spitze in lN 2, dann überweisen Sie Ihre Raster (s) auf die flache Oberfläche des Aluminium-Kühlkörper mit einer Pinzette, mit der 1,9 cm (4.3 &quot;) Loch der Ladebildschirm. </li><li> Bringen Sie den Kryo-Bühne, um unter dem Auflichtmikroskop Ziel Öffnungen. </li><li> Setzen Sie die transparente Anzeige-Bildschirm oben auf dem Ladebildschirm. Dann langsam entfernen Sie die Lade-Bildschirm, indem Sie ihn unter den Bildschirm. Hinweis: An dieser Stelle wird die Probe am meisten gefährdeten. Alle Luftströmungen um das Mikroskop minimiert werden sollte, unter anderem: Atmung, einem nahe gelegenen Türöffnung, die Menschen vorbeigehen, etc. Wir empfehlen das Tragen einer Gesichtsmaske oder hängend eine transparente Gesichtsschutz unter dem Mikroskop Okulare als Vorsichtsmaßnahme. </li><li> Drehen Sie die Objektive in den kalten Stickstoff Umfeld der Kryo-Bühne und-Scan für die Probe auf dem flachen Kühlkörper Bildfläche. Mit Standard-Hellfeld Lichtmikroskopie Techniken konzentrieren sich auf die Gitter mit geringer Vergrößerung Ziel, die Mitte zu finden und nehmen Sie eine Übersicht Bild. Spezifikationen für die Lichtmikroskopie Objektive für dieses Experiment verwendet werden in die Experimentelle Werkstoffmechanik Abschnitt aufgeführt. Hinweis: lN 2 nicht in Kontakt mit den Objektiven kommen und wir haben noch eine Verschlechterung der Bilder oder der Beschädigung der Linsen vor den Auswirkungen der Abkühlung sehen . </li><li> Focus in starker Vergrößerung auf einer Fläche von Zinsen und Erfassung von Daten mit Hellfeld, Dunkelfeld, polarisiertes Licht oder Fluoreszenz-Bildgebung. Achten Sie darauf, die Lage des Gebietes von Interesse auf die geringe Vergrößerung Hellfeldbild für zukünftige Korrelation aufnehmen. Wenn alle Vorsichtsmaßnahmen oben zum Nachfüllen der LN 2 aufgeführt, gefolgt sind, dann ist die positive Druck der verdampfenden Stickstoff ausreicht, um eine Kontamination Umgebung (unabhängig von der Raumfeuchte) für die Dauer der Bildgebung zu erhalten. </li><li> Sobald Sie fertig sind, ersetzen Sie den Ladebildschirm, indem Sie sie über die Oberseite der den Bildschirm. Entfernen Sie den Bildschirm durch Verlangsamung Schiebe es unter dem Ladebildschirm. </li><li> Entfernen Sie die Cryostage aus dem Mikroskop und mit vorgekühlten Pinzette, übertragen das Netz zurück an den Kryo-Gitterbox. Schrauben Sie die Kryo-Raster-Halter in Kryo-Gitterbox, um gegen die Umgebung abzudichten und den Transfer der Inhaber einer LN2 Dewar für die Lagerung und Zukunft Bildgebung. </li></ol> 4. Cryo-Elektronenmikroskopie <ol><li> Nach Standard-und etablierter Techniken, laden Sie die Probe Gitter in eine Kryo-EM-Übertragung Halter, während die Probe bei der Temperatur flüssigen Stickstoffs zu allen Zeiten. </li><li> Legen Sie die Cryo-Halter mit der Probe Gitter in einem Transmissions-Elektronenmikroskop. </li><li> In einem geeigneten geringer Vergrößerung ansehen (50-500x nominal Vergrößerung), finden Sie die Mitte der Probe Netz. </li><li> Verwenden Sie die zuvor gesammelten geringer Vergrößerung Kryo-LM Daten aus Schritt 3,7 bis die relative Orientierung des Gitters zentrale Kupfer-Tabs (wie in Abbildung 2 beschrieben) zu ermitteln und zu identifizieren genauen Bereiche von Interesse für die Korrelation. </li><li> Fahren Sie mit dem Mikroskop Ausrichtung, low-dose Kryo-EM-Imaging-und Datenerfassung. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die Kryo-Stufe (Abb. 1a) ist ein effektiver Weg zur Kryo-LM-Daten für Kryo-Fluoreszenzmikroskopie und korrelative cryo-LM/cryo-EM Analyse zu sammeln. Abbildung 2 zeigt, wie die Kombination aus niedrigen und hohen Vergrößerungen Kryo-LM Bilder, die Sie zum Verweis Karten, die Sie auf bestimmte Bereiche in Kryo-EM direkten erstellen können. Die daraus resultierende Kryo-LM Referenzkarte (Abb. 2b) wurde während Kryo-EM-Datenerfassung genutzt werden, um genaue Regionen in Abbildung 3 dargestellt zu finden. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Cryogenic Bühne. A) Das Layout der kryogenen Stufe besteht aus einem Kryo-Gitterbox Transfer montieren angegeben wit einem weißen Pfeil und einem Aluminium-Kühlkörper. Grids sind unter lN 2 aus dem Kryo-Gitterbox überführt und direkt auf dem Kühlkörper Sichtfeld der durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet. B) Bild der Darstellung der Kryo-Bühne mit Ladebildschirm. Das Loch in der Ladebildschirm wird direkt über die Kryo-Gitterbox montiert und wirkt platziert als Hafen Proben Transfer vom und zum Verschieben Proben aus dem Kryo-Gitterbox auf die Probe Sichtbereich auf dem Kühlkörper mit einer Pinzette. C) Die kryogene Bühne in Position unter den Objektiven mit den Bildschirm statt. Die spezielle Aussparung an den Bildschirm ermöglicht die Objektive leicht in Position schwingen, ohne die Kryo-Bühne. Das Loch in den Bildschirm vom Probenraum wirkt wie ein LN 2 Einfüllöffnung für LN 2 zu tanken, wenn nötig. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Navigieren in Kryo-LM für die korrelative Studien. A) Niedrige Vergrößerung Kryo-LM Ansicht von Hefezellen auf eine Probe Raster eingehalten werden. B) Das gleiche Bild in (a) mit einer hohen Vergrößerung Fluoreszenzbild einer Fläche von Interesse überlagert und mit einem gefüllten orangefarbenen Polygon Markierung der Mitte der Probe Netz. Das Zentrum besteht aus einer Gruppe von vier Quadraten, drei mit einem extra Metall Register und die vierte offen. Für die drei Plätze mit einem zusätzlichen Metall Register teilen sich zwei Paare den Reiter über den langen und kurzen Achsen bilden ein asymmetrisches Zentrum. Diese asymmetrische Zentrum kann in der linken oberen Ecke zu sehen und wurde verwendet, um den Drehwinkel und die Händigkeit des Rasters zwischen Kryo-LM und Kryo-EM zeigen. Von einem niedrigen Vergrößerung Bild, das viele Bereiche von Interesse können markiert und als Referenz Karte, um identische Bereiche in Kryo-EM suchen. C) Eine vergrößerte Fluoreszenz Kryo-LM Image der Region von Interesse in (b). HTA1-CFP, eine C-terminale GFP-Histon-Marker können als grüne punktförmige Struktur Kennzeichnung der Lage des Kerns zu sehen. D) Ein Kryo-EM-Bild des entsprechenden Bereichs in (c). Scale-Balken repräsentieren 50 Mikron. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Correlation der Kryo-LM und Kryo-EM. Zwei Felder der Ansicht, die identisch Hefezellen mit Kryo-Hellfeld (a, d), Kryo-Fluoreszenz (b, e) und Kryo-EM korreliert (c, f ). Scale-Balken stellen 5 Mikron.

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	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

<p class="jove_content"&gt; Mit unserem Tieftemperatur-Phase und die Probenvorbereitung, korrelative Studien zwischen Kryo-LM und Kryo-EM weisen einige Vorteile gegenüber traditionellen Raumtemperatur Ansätzen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: schnelle Fixierung<sup&gt; 1,2</sup&gt; Reduzierte photobleaching<sup&gt; 3</sup&gt; Und das Scannen der Probe Integrität vor Kryo-EM<sup&gt; 4,5</sup&gt; Oder chemische Fixierung / Einbetten<sup&gt; 6</sup&gt;. Einer der Engpässe für Kryo-EM-Datensammlung ist die Zeit für beide Übertragung der Probe in eine TEM-und Scan-Netz zu geeigneten Regionen zu Bild zu finden benötigt. Mit Cryo-LM ist eine schnelle Datenerfassung<sup&gt; 5</sup&gt;, Kann die Zeit damit verbracht, gute Zellen stark reduziert werden. So können wir sparen Zeit und Geld und mindern diesen Engpass durch die Scan-und Mapping-Bereiche von Interesse in Kryo-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Teurer oder komplexe kryogene Stufen erlauben auch höhere Auflösung Kryo-LM Bildgebung. Allerdings ist die Bühne fabriziert hier mehr als ausreichend für viele Anwendungen. Wenn Kryo-LM Bildgebung und Probe Netz überträgt mit Vorsicht, da in den Text und Video beschrieben durchgeführt werden, können vollständig frei von Verunreinigungen Bildgebung durchgeführt werden. Diese Methode ermöglicht eine direkte Korrelation von Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie Daten der gleichen Zelle, Organellen oder makromolekularen Komplex verteilt auf die Kohlenstoff-Support oder in ihr eine dünne Gewebeschnitte<sup&gt; 7</sup&gt;. Anzumerken ist, dass der Wert dieser kryogenen Stufe jenseits cryo-LM/cryo-EM korrelative Studien erstreckt sich auch auf dem Gebiet der Lichtmikroskopie als Ganzes sein. Das Kryo-Bühne ist gut für beide empfindliche Proben und Fluorophor Farbstoffe / Flecken geeignet<sup&gt; 8</sup&gt;, Quantum Dots oder fluoreszierend markierter Proteine<sup&gt; 9</sup&gt; Dass möglicherweise instabil während Raumtemperatur chemische Fixierung und Einbettung mit Glutaraldehyd und Paraformaldehyd. Als Folge hoffen wir, dass dieser kryogenen Stufe wird einen besseren Zugang zu den in Kryo-LM, die zuvor durch Kosten-und unzureichenden Zugang abschrecken interessiert sind.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Troubleshooting Cryo-Light Microscopy</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1 ist. Probenadsorption:</em&gt; Verschiedene Proben können variable Adsorption Eigenschaften der Kohlenstoff-Unterstützung aufweisen. Sie finden es vielleicht notwendig, um andere Arten von Unterstützung Netze wie kontinuierliche Kohlenstoff, löchrigen Kohlenstoff oder Formvar Roste für Probenträger zu verwenden. Außerdem, wenn die Probe die Bindung an den Kupferschienen des Netzes und nicht die Carbon-Oberfläche ist, kann es notwendig sein, die Kohlenstoff Oberflächenchemie durch Inkubation des Gitters mit einem Netzmittel oder durch Glühen Entladen vor Zugabe der Probe einstellen.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. Stufe Stabilität:</em&gt; Wenn Sie Vibrationen bemerken, ist es wahrscheinlich aufgrund der Probenbühne wird mit dem Gewicht als das Sprudeln des LN2 überlastet. Das zusätzliche Gewicht der kryogenen Stufe kann manchmal dazu führen, niederfrequenten Schwingungen entlang der Standard-3-Achse Mikroskoptisch übertragen und beeinträchtigen Bildgebung mittels Unschärfe. Dies kann leicht durch die Unterstützung des Mikroskops reisen Bühne von unten entweder mit einem verstellbaren Mini-Lift oder einer einstellbaren Adapter mit Dual-Schraube Arme, wie in dem Video gezeigt, korrigiert werden. Beide einstellbare Unterstützung Mechanismen interagieren mit einem nicht-beweglichen Teil der Reise entwickelt und daher immer noch erlaubt X und Y-Achse Übersetzung als für die Bildgebung erforderlich.</p

Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte: <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Catalog # </th><th> Kommentare </th><th> Kosten </th></tr><tr><td> 1 bis 22,86 cm (9 &quot;) Kuchenform mit schrägem Rand </td><td> Guter Koch </td><td></td><td> Lokalen Lebensmittelgeschäft </td><td> $ 4,39 </td></tr><tr><td> 1 bis 22,86 cm (9 &quot;) Kuchenform </td><td> Guter Koch </td><td></td><td> Lokalen Lebensmittelgeschäft </td><td> $ 4,93 </td></tr><tr><td> 4 Paar Essstäbchen </td><td></td><td></td><td> Lokalen Lebensmittelgeschäft </td><td> $ 0,50 </td></tr><tr><td> 1 - Great Stuff Spritzschaum </td><td> Great Stuff </td><td></td><td> Örtlichen Baumarkt </td><td> $ 5,98 </td></tr><tr><td> 1 - 4 cm x8cm x1cm Block aus Aluminium </td><td></td><td></td><td> Örtlichen Baumarkt oder Metall Schrottplatz </td><td> $ 10,00 </td></tr><tr><td> 5 - Nr. 10 1,91 cm (4.3 &quot;) Flachkopfschrauben w / Muttern geschlitzt </td><td></td><td></td><td> Örtlichen Baumarkt </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 3 - Nr. 4 0.95 cm (8.3 &quot;) runden Schlitzschrauben w / Muttern </td><td></td><td></td><td> Örtlichen Baumarkt </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 15 - # 10 Scheiben </td><td></td><td></td><td> Örtlichen Baumarkt </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 2 - transparente Kunststoff Zwischenablagen </td><td></td><td></td><td> Örtliches Büro speichern </td><td> $ 6,84 </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM Gitterbox Halter </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM Gitterbox Umgang mit Stab </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 löchrigen Kohleschicht, 400-Mesh-Kupfer-Kryo-EM Stützgitter </td><td> SPI Supplies </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Experimentelle Materialien <ol><li> Hefestamm: Hta1-CFP:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP: KanMX6 aus dem Kaplan-Labor an der UC Davis). </li><li> Cryo-Light Microscopy: Cryo-Licht-Mikroskopie-Aufnahmen wurden an einem Leica DM4000M reflektieren Mikroskop mit einer Leica DFC310 FX CCD-Kamera aufgenommen. Hellfeld, Dunkelfeld und Fluoreszenz Bilder wurden entweder mit einem HCX PL Fluotar 5x 0,15 NA Luft Ziel, eine HCX PL Fluotar 10x 0,30 NA Luft Ziel, eine PL Fluotar 50x 0,55 NA Luft Ziel oder eine NPLAN 100x 0,75 NA Luft Ziel. Hellfeld-und Dunkelfeld-Bildern verwendet eine 12V 100W Wolfram-Lampe als Lichtquelle. Filter Cube für Fluoreszenz, war ein EL6000 UV-Lampe Quelle in Verbindung mit einem Leica JC1 (:: BP 480/30, DM LP 505, SF BP 535/40 &amp; LP 580 Ex.F.) verwendet. </li><li> Cryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie: Cryo-EM-Bilder wurden an einem JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Japan) bei 200 KeV erworben Verwendung eines Gatan 626 Kryo-Transfer-Halter (Gatan, USA). Aufnahmen wurden bei nominaler Vergrößerungen von 50, 200, 1.200 und 4.000 X auf einem 4.096 x 4.096 Pixel Tietz CCD-Kamera (TVIPS, Gauting, Deutschland) aufgezeichnet. </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

Die Kopplung der Kryo-Lichtmikroskopie (Kryo-LM) und Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) stellt eine Reihe von Vorteilen für das Verständnis der zellulären Dynamik und Ultrastruktur. Erstens können Zellen in einer natürlichen Umgebung in der Nähe für beide Techniken abgebildet werden. Zweitens durch die Verglasung Prozess, werden die Proben durch schnelle physikalische Immobilisierung statt langsamen chemischen Fixierung erhalten. Drittens Bildgebung der gleichen Probe mit beiden Kryo-LM und Kryo-EM bietet Korrelation von Daten aus einer einzigen Zelle, sondern als ein Vergleich von &quot;repräsentativen Stichproben&quot;. Während diese Vorteile auch aus früheren Studien bekannt sind, begrenzt die weit verbreitete Nutzung von korrelativen Kryo-LM und Kryo-EM bleibt aufgrund der Kosten und Komplexität der Kauf oder Bau eines geeigneten kryogenen Lichtmikroskopie Bühne. Hier zeigen wir die Montage und Verwendung eines kostengünstigen kryogenen Bühne, die in jedem Labor für weniger als $ 40 mit Teilen auf lokaler Hard-und Lebensmittelgeschäfte hergestellt werden können. Das Kryo-LM Bühne ist für den Einsatz mit Auflichtmikroskope, die mit großem Arbeitsabstand Luft Zielen ausgestattet ausgelegt sind. Für korrelative Kryo-LM und Kryo-EM-Untersuchungen, passen wir den Einsatz von Carbon beschichtet Standard-3-mm Kryo-EM-Grids als Muster unterstützt. Nach Adsorption der Probe an das Netz sind bereits etablierten Protokollen zur Verglasung der Probe und die Übertragung / Umgang mit dem Netz gefolgt, um multi-Technik Bildgebung ermöglichen. Als Folge können diese Einstellung jedes Labor mit einem Auflichtmikroskop, den Zugang zu direkten korrelativen Bildgebung von gefrorenen hydratisierten Proben haben.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Wir zeigen die Herstellung eines Low-Cost-Kryo-Stadium entwickelt, um die meisten Auflichtmikroskope fit. Dieses Labor gebaut kryogenen Stufe ermöglicht eine effiziente und zuverlässige korrelative Bildgebung zwischen Kryo-Licht und Kryo-Elektronenmikroskopie.

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Bühne Fabrication für Correlated Light / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Aufrufe.  University of California Davis. Wir zeigen die Herstellung eines Low-Cost-Kryo-Stadium entwickelt, um die meisten Auflichtmikroskope fit. Dieses Labor gebaut kryogenen Stufe ermöglicht eine effiziente und zuverlässige korrelative Bildgebung zwischen Kryo-Licht und Kryo-Elektronenmikroskopie.

Serie: Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Forschung

Biotechnik

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Video-rate konfokalen Mikroskopie und Mikroendoskopiesysteme

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Schnelle und Low-Cost-Prototyping für Medizinische Geräte mit 3D Printed Formen für Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) für die Verfolgung und Imaging virales Protein verbundenen Strukturen in den Cryo-immobilisierten Zellen

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

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