העבודה במעבדה שלנו הוא נתמך על ידי מענקים מ-NIH, המכון הלאומי של משרד החקלאות המזון והחקלאות, NSF, בארד, DOE, ו BSF ל VC

1. הביטוי החילוץ של החלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיפרנציאלי לתייג את החלבונים להיבדק לגילוי שלהם. לייבל החלבון להיות משותקת על הממברנה (ProIM) עם תג בגודל גדול יותר (למשל, GST), ואת תג unfused יכול לשמש מלאה שלילי משותקת (ProIMnc). לייבל החלבון לשמש בדיקה מסיסים (ProSOL) עם או גדול או תג קטן. נתיך אותו תג לחלבון בקרה המתאימים שלילי מסיסים (ProSOLnc) ו לכלול assay את האינטראקציה כדי לאשר את הספציפיות של הכריכה זוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ביטוי חלבון מערכת להביע את החלבונים המתויגים, כלומר, א coli, baculovirus, וכו &#39;, בהתאם לדרישת שינויים שלאחר פוטנציאל התשואות translational של החלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ProIM ו ProIM nc מן האורגניזם של בחירה (שלב 1.2) באמצעות SDS-PAGE חיץ טעינה (גליצרול 20%, 4% SDS, 20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH6.8) המכילה קוקטייל מעכב proteinase. השאירו את ההשעיה תא בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, להוסיף 0.5% mercaptoethanol-2 ו להרתיח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ProSOL ו ProSOL nc מן האורגניזם של בחירה (שלב 1.2) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 16. חלבונים אלה צריכים להיות מסיסים בקלות למאגר מחייב (140 mM NaCl, 10 מ&quot;מ, טריס-HCl pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 מ&quot;מ DTT, BSA 1%, 0.1% Tween 20) משמש בשלב 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז החלבונים רקומביננטי בשיטה סטנדרטית, כגון ערכת Bio-Rad assay חלבון. כגון ערכת Bio-Rad assay חלבון. אם לחלץ גולמי, ולא מטוהרים חלבון, המשמש assay, להעריך את ריכוז החלבון של עניין תמצית זו על ידי סריקת צפיפות של הלהקה המתאים מוכתם SDS-polyacrylamide ג&#39;ל עם Coomassie מבריק כחול R-250 ושימוש ידוע ריכוזי BSA כנקודת התייחסות. </li></ol> 2. Immobilization של ProIM ו ProIMnc על הממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון שתי סדרות של תמציות, שכל אחד מהם מכיל 1 מיקרוגרם של ProIM ו ProIM nc על ג&#39;ל SDS-polyacrylamide לפי הפרוטוקול הסטנדרטי 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אלקטרופורזה, במקום להעביר את הג&#39;ל אל על 100 מ&quot;ל של חיץ להעביר (60 mM גליצין, 10 mM טריס, 0.0006% SDS, MeOH 20%) דגירה עם תסיסה עדינה 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrotransfer החלבונים הכלול הג&#39;ל על קרום nitrocellulose לפי הפרוטוקול הסטנדרטי 16. </li></ol> 3. Re-קיפול של הממברנה הנכנס חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electrotransfer, דגירה הממברנה במשך 15 דקות ב 15 מ&quot;ל של החיץ (30 mM טריס-HCl pH7.4, 0.05% Tween 20) עם תסיסה עדינה להסיר SDS שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש בזהירות, כדי להעביר את הממברנה 25 מ&quot;ל של חיץ denaturation (7 מ hydrochloride guanidine, 2 mM EDTA, 50 מ&quot;מ DTT, 50 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.3). ו דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. (הערה: קרום nitrocellulose הופך אטום כאשר מודגרות במאגר denaturation). ו דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הממברנה כדי 25 מ&quot;ל של כפות (10 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) ו דגירה עם תסיסה עדינה 5 דקות (הערה: במהלך שלב זה, הממברנה חוזר הצבע הלבן המקורי שלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הממברנה כדי 25 מ&quot;ל של חיץ מחייב (ראה שלב 1.2) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה הלילה. </li></ol> 4. חיטוט ProIM ידי ProSOL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקרום לשתי רצועות, הן ProIM המכיל ProIM nc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרונות הכלאה ProSOL ו ProSOLnc על ידי דילול הכנה עם 10-10 מיקרוגרם של ProSOL או ProSOLnc ב 10 מ&quot;ל של חיץ מחייב טריים. העברת כל הממברנה לתוך הפתרון הכלאה ProSOL או ProSOLnc ו דגירה עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרומים של פתרונות הכלאה ולשטוף שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד TBS. </li></ol> 5. חזותי חלבונים אינטראקציה ידי immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה עם חלב רזה 2.5% ב TBST (10 mM טריס-HCl, 140 mM NaCl, 0.05 Tween 20%, pH 7.4) עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר. לדלל את הנוגדן הראשוני (אנטי strepII נוגדן ארנבת polyclonal) ב חלב רזה 0.5% ב TBST בריכוז המומלץ על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקרומים חסום בפתרון נוגדן, וטופחו על h 1 בטמפרטורת החדר או את הלילה בבית 4 ° C עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את ממברנות ב TBST 20 מ&quot;ל במשך 15 דקות, ופעמיים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדן משני (אנטי נוגדנים IgG ארנבת) מצומדות עם peroxidase סוס צנון (HRP) ב חלב רזה 0.5% ב TBST בריכוז המומלץ על ידי היצרן. מניחים את הקרומים של נוגדן המשניפתרון דגירה עבור h 1 בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את ממברנות ב TBST 20 מ&quot;ל במשך 15 דקות, ופעמיים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. לאחר השטיפה הסופית ב TBS, לחזות את האינטראקציה בין חלבונים באמצעות מצע chemiluminescence HRP (לדוגמה, Millipore Immobilon המערבי המצע chemiluminescent HRP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה הממברנות אותו עם הנוגדן העיקרי עבור התג התמזגו ProIM, ואחריו נוגדן המשני המתאים כמתואר צעדים 5.1-5.4. דמיינו ProIM ו ProIMnc כמתואר צעד 5.5 כדי לאמת את זהותו של להקות שהושגו assay שכבת קרום חלבון (שלב 5.5). ברוב המקרים, הפשטת אין צורך, כי את האות המתקבל בשלב זה הוא הרבה יותר חזק האות המתקבל שיורית צעד 5.5. </li></ol> 6. נציג תוצאות: האינטראקציה ANK-MP נצפתה על ידי BiFC בתאי טבק אפידרמיס (איור 1A). מכיוון MP הוא חלבון מסיס ביותר כאשר הביע בחיידקים או בצמחים, קרום חלבון assay כיסוי אומצה כדי לאמת את זה האינטראקציה במבחנה (איור 1B). תמציות חלבון המכיל 1 מיקרוגרם של GST-MP (ProIM) או unfused GST (ProIM nc) נפתרו על ידי אלקטרופורזה בג&#39;ל SDS-polyacrylamide, ואחריו electrotransfer אל קרום nitrocellulose. כאשר אלה ProIMs נבדקו עם מסיסים ANK-strepII (ProSOL), GST-MP, אבל GST לא unfused, הציג מחייב (איור 1B, מסלולים 1, 2, להשוות 5 נתיבים, 6). יתר על כן, כאשר את אותו סט של ProIMs נבדקו עם ProSOLnc שאינו קשור, כלומר NADH ארבידופסיס קינאז cytoplasmic מתויג strepII (NADH3-strepII), לא מחייב לא נצפתה, נוסף הממחיש את הספציפיות של אינטראקציה ANK-MP (איור 1B, נתיבים 3, 4). <img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. מחייב ספציפיות של טבק ANK כדי TMV MP in vivo ו in vitro. (א) ANK-MP האינטראקציה בתאים חיים טבק אפידרמיס זוהה על ידי BiFC. סטרונג אות YFP שוחזר כאשר הפרלמנט ANK, התמזגו בטרמינל C-N-מסוף חצאי YFP, בהתאמה, היו coexpressed באפידרמיס טבק הבאים microbombardment של הגנים המקודדים שלהם. זה אות BiFC שנצבר puncta בשולי התא, אשר אבחון של plasmodesmata 15. (ב) ANK-MP אינטראקציה במבחנה מזוהה על ידי חלבון הממברנה assay כיסוי. תמציות חלבון המכיל 1 מיקרוגרם של GST-MP (ProIM) או unfused GST (ProIMnc) נפתרו על ג&#39;ל SDS-polyacrylamide 15%, ואחריו electrotransfer על קרום nitrocellulose. GST-MPProIM ו GSTProIMnc הודגרו עם 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של ANK-strepII (ProSOL), ו ANK מחייב זוהה על ידי חיטוט הממברנה עם נוגדן אנטי strepII ארנב polyclonal, ואחריו נגד ארנב נוגדנים IgG M + משני מצומדות כדי HRP (מסלולים 1 ו -2). לא GST-MPProIM GSTProIMnc ולא תיקשר עם חלבון שאינו קשור, kinase ארבידופסיס cytoplasmic NADH, התמזגו תג strepII (ProSOLnc, נתיבים 3 ו 4). זהותו של הלהקה נצפתה assay זו אושרה על ידי חיטוט הממברנה עם נוגדן אנטי GST (נתיבי 5 ו - 6). כאשר קרום טופלה חיץ denaturation מבלי לשטוף עם חיץ, מחייב של GST-MP כדי ANK הולך לאיבוד, בעוד חלבונים מזוהה הכלול GST-MP ותמציות GST חלבון contining הגיבו ANK-strepII, הממחיש את חשיבות השלב 3.1 לפני תהליך denaturation (נתיבי 7 ו - 8).

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis.">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li><li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells.">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li><li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein.">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li><li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton.">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li><li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus.">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li><li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants.">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li><li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus:+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication.">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li><li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit.">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li><li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability.">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li><li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANK,+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein,+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata.">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li><li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T., Taylor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2011).</li><li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP1,+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2,+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity.">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li><li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement.">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

גישה זו מתאימה בדיקות חלבונים אינטראקציות בין שילובים של חלבונים, כאשר לפחות אחד מהם החלבונים הוא מסיס בקלות למאגר מחייב, והוא מיושם בהצלחה שילוב של חלבונים אחרים 17,18. IInteractions בין חלבונים כי הן מסיס בתנאים אלה לא ניתן לבדוק על ידי פרוטוקול זה. <p class="jove_content" style="...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Assay חלבון ערכת </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Proteinase קוקטייל מעכב </td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td> ה-Mini-פושט צורה ולובש צורה מערכת </td><td> ביו רד </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td> חצי יבש המערבי סופג SD מערכת electrotransfer </td><td> ביו רד </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td> נגד ארנב IgG מצומדות עם peroxidase צנון סוס נוגדן </td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td> Anti-GST ארנב polyclonal נוגדן </td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td> Anti-strepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> BioTrace, העברת NT קרום nitrocellulose </td><td> מל מדעי </td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td> Immobilon המערבי chemiluminescent המצע HRP </td><td> Millipore </td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

protein membrane overlay assay: a protocol to test interaction between soluble and insoluble proteins in vitro

אינטראקציות בין חלבונים שונים לאישור חיוני לחקירה של פונקציות הביולוגיים ברמה המולקולרית. ישנן מספר שיטות, הן במבחנה in vivo, כדי להעריך מחייב חלבון, לפחות שתי שיטות המשלימות את החסרונות של כל אחד אחר צריך להתנהל כדי להשיג תובנות אמין. עבור assay ב vivo, השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) assay מייצג את הגישה הפופולרית ביותר פולשנית לפחות המאפשרת לזהות חלבונים אינטראקציה בתוך תאים חיים, כמו גם לזהות את לוקליזציה תאיים של 1,2 החלבונים אינטראקציה. ב assay זה, אי - ניאון N-ו-C-מסוף חצאים של ה-GFP או גירסאותיה הם התמזגו חלבונים נבדק, וכאשר שני חלבונים היתוך הם הביאו יחד בשל אינטראקציות החלבונים &quot;נבדק, האות ניאון הוא מחדש 3-6 . בגלל האות שלו ניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence או confocal, BiFC התפתחה ככלי רב עוצמה של בחירה בין ביולוגים התא ללימוד על חלבונים אינטראקציות בתאים חיים 3. Assay עם זאת, לפעמים יכול להניב תוצאות חיוביות כוזבות. לדוגמה, האות ניאון ניתן מחדש על ידי שני שברים GFP מסודרים ככל 7 ננומטר אחד מהשני בגלל קרוב אריזה בתא subcellular קטן, אלא כי בשל אינטראקציות ספציפיות 7. בשל מגבלות אלה, התוצאות שהתקבלו טכנולוגיות הדמיה תא חי חייבת להיות מאושרת על ידי גישה עצמאית מבוססת על עיקרון שונה לאיתור אינטראקציות חלבון. Co-immunoprecipitation (Co-IP) או גלוטתיון transferase (GST) הנפתח מבחני מייצגים שיטות חלופיות כאלה משמשים בדרך כלל כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים במבחנה. עם זאת, אלה מבחני iIn, לעומת זאת, חלבונים נבדק חייב להיות מסיס בקלות למאגר כי supportsused עבור התגובה מחייב. לכן, אינטראקציות ספציפיות הקשורות חלבון מסיס לא ניתן להעריך על ידי טכניקות אלה. כאן, אנו ממחישים את פרוטוקול עבור assay שכבת קרום חלבון מחייב, אשר עוקף את הקושי הזה. בטכניקה זו, האינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים ניתן לבדוק באופן מהימן כי אחד החלבונים היא משותקת על מטריצה ​​הממברנה. שיטה זו, בשילוב עם בניסויים vivo, כגון BiFC, מספק גישה אמינה לחקור ולאפיין בנאמנות אינטראקציות בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. במאמר זה, מחייב בין נגיף פסיפס הטבק (TMV) חלבון תנועה (MP), אשר מפעילה פונקציות מרובות במהלך ההובלה התא אל התא ויראלי 8-14, וכן interactor צמח זיהו לאחרונה הסלולר, טבק ankyrin לחזור המכילים חלבון (ANK ) 15, מודגמת באמצעות טכניקה זו.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro at JoVE.com

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו מציגים<em&gt; במבחנה</em&gt; חלבונים assay מחייב בדיקה קרום משותקת חלבון עם חלבון מסיס. Assay זה מספק שיטה אמינה לבדיקת האינטראקציה בין חלבון מסיס לבין חלבון בתמיסה.

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

protein-membrane-overlay-assay-protocol-to-test-interaction-between

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

22.0K Views.  State University of New York. חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו מציגים במבחנה חלבונים assay מחייב בדיקה קרום משותקת חלבון עם חלבון מסיס. Assay זה מספק שיטה אמינה לבדיקת האינטראקציה בין חלבון מסיס לבין חלבון בתמיסה.

Video: Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

קביעת אינטראקציה משולשת בין שני מונומרים של גורם שעתוק של קופסת MADS וחלבון חיישן סידן על ידי BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

ייצור והדמיה של שלפוחיות רקומביננטיות מלאות חלבון מאי-קולי

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an effective solution to a range of problems associated with bacterial recombinant protein expression. These recombinant vesicles compartmentalise proteins within a micro-environment that facilitates the production of otherwise challenging, toxic, insoluble, or disulfide-bond containing proteins from bacteria. Protein yield is increased considerably when compared to typical bacterial expression in the absence of the vesicle-nucleating peptide tag. The release of vesicle-packaged proteins supports isolation from the culture medium&#160;and permits long-term active protein storage. This technology gives rise to increased yields of vesicle-packaged, functional proteins for simplified downstream processing for a diverse range of applications from applied biotechnology to discovery science and medicine. In the present article and the associated video, a detailed protocol of the method is provided, which highlights key steps in the methodology to maximize recombinant protein-filled vesicle production.

מחבר זרקור: ייצור חלבונים רקומביננטיים 

The present protocol describes a detailed method for the bacterial production of recombinant proteins, including typically insoluble or disulfide-bond containing proteins, packaged inside extracellular membrane-bound vesicles. This has the potential to be applied to versatile areas of scientific research, including applied biotechnology and medicine.