עבודה זו נתמכה על ידי הבריטים Heart Foundation מלגות כדי SZ (FS / 08/063 ו FS / 15/30/31494).

<ol>
	<li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor.">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li><li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-terminus+oligomerisation+is+conserved+in+intracellular+calcium+release+channels.">Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels.</a> Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).</li><li>Zissimopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminus+oligomerization+regulates+the+function+of+cardiac+ryanodine+receptors.">N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).</li><li>Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+aberrant+N-terminus+inter-subunit+interactions+in+mutant+pro-arrhythmic+cardiac+ryanodine+receptors.">Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors.</a> Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).</li><li>Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+tail.">Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail.</a> Biochem J. 376, 795-799 (2003).</li><li>Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interactions:+two+methods+for+assessment+of+the+reliability+of+high+throughput+observations.">Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).</li><li>Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+continued+evolution+of+two-hybrid+screening+approaches+in+yeast:+how+to+outwit+different+preys+with+different+baits.">The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits.</a> Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).</li><li>Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+genetic+in+vivo+methods+for+protein-protein+interaction+studies:+from+the+yeast+two-hybrid+system+to+the+mammalian+split-luciferase+system.">Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).</li><li>Yang, M., Wu, Z., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-peptide+interactions+analyzed+with+the+yeast+two-hybrid+system.">Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system.</a> Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).</li><li>Elion, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8,+Detection+of+protein-protein+interactions+by+coprecipitation.">Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9,+Calcium+phosphate+transfection.">Chapter 9, Calcium phosphate transfection.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2003).</li><li>Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hax-1+identified+as+a+two-pore+channel+(TPC)-binding+protein.">Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein.</a> FEBS letters. , (2013).</li><li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+FKBP12.6+with+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+domain.">Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain.</a> J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).</li><li>Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+binding+of+ryanodine+receptors+carrying+mutations+associated+with+arrhythmogenic+cardiac+disease.">FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease.</a> Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).</li><li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate.">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+the+analysis+of+multiprotein+signaling+complexes.">Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes.</a> Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).</li><li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaraldehyde:+behavior+in+aqueous+solution,+reaction+with+proteins,+and+application+to+enzyme+crosslinking.">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).</li><li>Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+mechanism+and+end+products+of+glutaraldehyde+crosslinking+reaction+by+X-ray+structure+analysis.">Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis.</a> Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).</li><li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+domain+of+the+human+cardiac+muscle+ryanodine+receptor+does+not+mediate+interaction+with+FKBP12.6.">Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6.</a> Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).</li><li>Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+interaction+with+the+SNARE-associated+protein+snapin.">Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin.</a> J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).</li><li>Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+sensitivity+of+the+ryanodine+receptor+interaction+with+FK506-binding+protein.">Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein.</a> J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).</li><li>Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+association+of+the+ryanodine+receptor+and+the+FK506-binding+proteins+in+mammalian+heart.">Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart.</a> J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).</li><li>Ali, M. H., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+oligomerization:+how+and+why.">Protein oligomerization: how and why.</a> Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).</li><li>Hashimoto, K., Panchenko, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+oligomerization,+the+critical+role+of+insertions+and+deletions+in+maintaining+different+oligomeric+states.">Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).</li><li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration:+lessons+from+the+Alzheimer's+amyloid+beta-peptide.">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).</li><li>Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+stability+of+proteins+in+aqueous+solution:+mechanism+and+driving+forces+in+nonnative+protein+aggregation.">Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation.</a> Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).</li><li>Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+quantitation+of+protein+oligomerization.">The detection and quantitation of protein oligomerization.</a> Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).</li><li>Kaczor, A. A., Selent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+G+protein-coupled+receptors:+biochemical+and+biophysical+methods.">Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods.</a> Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).</li></ol>

החוקרים אין להכריז.

ההיווצרות של הומו-oligomers חלבון היא תהליך ביולוגי בסיסי המסדיר את פעילותם של גורמי שעתוק, אנזימים, יון ערוצים קולטני 25,26. חשוב לציין, oligomerization חלבון יש גם השלכות פתולוגיות כולל ניוון מוחיים ומחלות לב arrhythmogenic 4,27. מתודולוגיות המתוארים במאמר זה משמשים לזיהוי אינטראקציות תחום-תחום בתיווך חלבון-שיוך עצמי oligomerization. להלן נבקש להצביע על שלבים קריטיים בתוך כל פרוטוקול, ואנחנו דנים שיקולים, מגבלות חשובות של פתרון בעיות. המערכת Y2H יכול להיות מועסק הראשון למסך שותפים חלבון אינטראקציה פוטנציאל בגלל הקרנת תפוקה גבוהה יחסית, קלות שימוש ותוצאות לשחזור מאוד. נהלי Y2H מתבצעים במעבדה למיקרוביולוגיה עם תקן (צלחת או שתייקרו) חממות ומתקני בלימת חדר. שימוש freshly מוכן תאים מוסמכים (שלב 1.1.8) הם קריטי עבור טרנספורמציה שמרים יעילות גבוהה, ואילו עבור התוצאות הטובות ביותר ב מבחני β-גל, טרי גדלו מושבות שמרים (עד 5 ימים) אמור לשמש (שלב 1.2.3). מערכות מבוססות על גורמי שעתוק מלבד GAL4 ו / או נוספים / גני כתב תחליפיים זמינות, ולכן פיתיון פלסמידים טרף צריך להיות בהתאמה עם זן Y2H המתאים. כמה זנים צריכים להיות תרבותיים בנוכחות 3-אמינו-1,2,4-triazole, מעכב תחרותי של חלבון HIS3, על מנת להרוות את כל ביטוי מכונן של גן כתב HIS3 7,8. ביטוי של חלבוני היתוך פיתיון היעד צריך להיות מאומת על ידי immunoblotting 17. במקרה פיתיון / חלבוני היתוך טרף רעילים שמרים, רמות חלבון נסבלות נמוך יכולות להיות מושגת על ידי שיבוט וקטורים שונים שבם פיתיון / ביטוי טרף הוא מונע על ידי אמרגן שונה. כמו כן, הוא חיוני כדי להבטיח tחלבוני כובע היתוך פיתיון / טרף אינם מציגי פעילות גן הכתב אוטונומי. הפעלת גן כתב אוטונומית יכולה להינצל על ידי שינוי המבנה להסיר באזור האחראי, או על ידי החלפת GAL4 DNA-BD ו התכה לספירה לשני החלבונים נבדקים. יתר על כן, תחומים הטרנסממברני מושמטים טובים יותר מן מבני פיתיון / טרף, כיוון שהם עלולים לגרום misfolding או mislocalization של חלבוני היתוך בתאי קרום תאיים. ואכן, החיסרון העיקרי של מערכת Y2H היא כי חלבונים הפיתיון היעד הם נקודתיים בגרעין שמרים הרחק מיקום subcellular פיזיולוגיים שלהם ואפשרות חסר שלאחר translational שינויים ספציפיים, וכתוצאה מכך אינטראקציות חיוביות שגויות או false-negative 6-9 . מערכות ביטוי Heterologous יונק מתאימות יותר לחקר חלבונים בממברנה אינטגרלי יונקים מבחינת שינויי קונפורמציה, שלאחר translational ולוקליזציה subcellular.אחת השיטות transfection התא הנפוץ ביותר הוא משקעים סידן פוספט, בעיקר בגלל הציוד המינימלי ריאגנטים הנדרש 11,15. שיטות חלופיות, כלומר electroporation, ליפוזומים, שומנים ופולימרים קטיוני, עשויות להניב יעילות transfection גבוהה בהתאם לקו התא לבנות משומש. באופן כללי, הגורמים העיקריים המשפיעים יעיל transfection הם באיכות פלסמיד דנ&quot;א כדאיויות תא בריאות /. התוצאות הטובות ביותר מושגות כאשר פלסמיד דנ&quot;א של הטוהר הגבוה ביותר (יחס ספיגת 260nm / 280nm של ~ 1.8) התאים המתחלקים באופן פעיל משמש. תאים ולכן יש transfected על לא יותר מ 60 - 70% מפגש (שלב 2.1.2), כי את היכולת לקחת את דנ&quot;א זר קשורה שטח הפנים של התא נחשף המדיום 11. בנוסף, הכללת האנטיביוטיקה במדיום התרבות במהלך transfection (שלב 2.1.3) לא מומלצת בשל מוות של תא מוגבר 15. Fאו משקע סידן פוספט בהכנה מסוימת, זהירה וכוונון pH (כדי 7.05 בדיוק) של פתרון 2x HBS (שלב 2.1.1), היווצרות נכונה של DNA פלסמיד / סידן / מתחמי פוספט על ידי ערבוב נמרץ (שלב 2.1.5) הם שלבים קריטיים עבור transfection היעילות גבוהה. בדרך כלל, ביטוי החלבון על ידי פסגות transfection חולף בתוך 24 - 72 שעות. לאחר תאים נקצרים, נהלים עקב חייבים להתבצע ב 4 ° C כדי למזער פעילות הפרוטאז, והוספת מעכבי פרוטאז מומלצת. המגון Cell צריך להיות מלווה צעד צנטריפוגה להסיר גרעינים כי כרומוזומליות DNA עשויה להגדיל את צמיגות פתרון ולשפר את הלא ספציפי מחייב. לפיכך, המגון באמצעים מכניים ב חיץ iso-האוסמוטי הוא העדיף, בדרך כלל (0.3 M) סוכרוז או (150 מ&quot;מ) NaCl. באופן כללי, מאגרים מבוססים סוכרוז ידועים כדי לשפר את יציבות חלבון ולהקטין צבירת חלבון פוטנציאל שאינה ילידי ארץ, אך בשל pהידרציה קשרים על פני החלבון, אינטראקציות חלבון-חלבון אלקטרוסטטית הם העדיפו. לעומת זאת, מאגרים מבוססי מלח להשפיע על מטען נטו של קבוצות צד חומצת אמינו מחויבות על פני החלבון, ובכך שיש הטיה לכיוון יותר אינטראקציות הידרופוביות מבוסס 28. Co-IP הוא assay ביוכימיים המועסק השכיח ביותר להערכת אינטראקציות חלבון-חלבון במיוחד מרקמות ילידים. החיסרון העיקרי שלה הוא הדרישה נוגדנים ספציפיים מאוד תוקף לשימוש IP ו immunoblotting 10,16,18. לפיכך, חלבונים רקומביננטיים לעתים קרובות מתויגים עם epitope הפפטיד, למשל., Hemagglutinin השפעת (YPYDVPDYA) או cMyc אדם (EQKLISEEDL), עבורו נוגדנים ספציפיים גבוהה זיקה זמינות מסחרי. אם תרצה, הנוגדן immunoprecipitating ניתן מצומדות כימית על חלבון-שרף להימנע elution וזיהוי שלה בשלב immunoblotting כי עלול לטשטש את שיתוף זירז protein 16; כדי להשיג זאת, השתמשנו 24 צולבות מקשר כימי בהצלחה 3,3&#39;-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate). זה הכרחי כי חומר ניקוי מתאים כלול למאגר IP ואת החומר המסיס של תאי הומוגני הוסר על ידי צנטריפוגה כדי למזער מחייב ספציפי שאינו (שלב 3.1.3). הבחירה וריכוז חומר הניקוי הם שיקולים חשובים: דטרגנטים חזקים ו / או ריכוזים גבוהים יותר תפחית באופן משמעותי שאינו ספציפי מחייבים אך ייתכן גם לבטל X: אינטראקצית חלבון Y, בעוד ריכוזים נמוכים או דטרגנטים מתונים עשויות לאפשר אינטראקציה חלשה להיות שנצפתה אך רשאית לגרום מחייב מוגזם שאינו ספציפי. דטרגנטים כוח ביניים עדיפים, למשל, טריטון X-100 ב 0.5 -. ריכוז 1%. כדי לצמצם עוד יותר את הלא ספציפית מחייב, חלבון נייטרלי (למשל, אלבומין בסרום שור ב 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) יכול להיכלל במאגר IP, ו / או lysate התא ניתן מראש cleareד עם הדגירה מראש עם שרף חלבון-A לבד. מספר השוטף צריך להיות מותאם עבור X: נבדק זוג Y, בדרך כלל שלושה שוטף של 10 דק &#39;עם חיץ IP (שלב 3.1.9). בכל מקרה, מדגם שיתוף IP עם IgG הלא חיסוני כמו נוגדן immunoprecipitating תמיד צריך להיות מעובד במקביל לשרת מלא שלילי (צעד 3.1.6). היתרון העיקרי של cross-linking כימי הוא שזה מודיע על רכב stoichiometric של-oligomer הומו החלבון. Glutaraldehyde הוא מקשר צולב נפוץ כי זה לא דורש ציוד מיוחד שהוא מייצר תרמית וכימי צולבות קישורים יציבים בין חלבוני אינטראקצית 19,20. תרכובות עם קבוצות אמינו חופשיות להשמיטם מ מאגרי assay (שלב 3.2.1) כי הם להרוות את התגובה הכימית. ריכוז Glutaraldehyde ותגובה הזמן (שלב 3.2.4) צריך להיות מותאם מורכב החלבון oligomeric של עניין. החיסרון העיקרי של שיטה זו, especiברית כאשר היא מבוצעת על הכנות תא כולו, הוא-הסגולי אי התגובה הכימית שיכול להניב אגרגטים חלבון מלאכותיים חסרי משמעות ביולוגית. אלטרנטיבי in vivo (למשל., תהודה העברת אנרגיה פלואורסצנטי, דו-מולקולרי פלואורסצנטי או השלמה הארה) ו בטכניקות חוץ גופית (למשל., כרומטוגרפיה הדרה גודל, ultracentrifugation אנליטית, calorimetry טיטרציה בידוד תרמי) זמינים לאפיון ההתאגדות עצמית חלבון והערכה של oligomerization והרכב 29,30. לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות משלה, והוא עשוי להיות מתאים יותר ללימוד חלבון מסוים תלוי טיהור חלבונים / יציבות וזמינה ציוד / מגיב. שלוש השיטות משלימות שתואר כאן בהרחבה, כלומר Y2H, שיתוף IP ו- cross-linking, שימשו בשילוב לספק הוכחות משכנעות RyR2 הומו-oligomeהיווצרות r בבידוד בתוך תא חי.

התכווצות שרירי השלד ואת הלב מופעלת על ידי הרטיקולום sarcoplasmic Ca 2 + שחרור בתיווך RyR. ישנם שלושה isoforms RyR יונק עם הערוץ הפונקציונלי מורכב מארבעה תת יחידות זהות. כל למקטע RyR מורכב חלק N-terminal רגולטוריות ציטופלסמית גדול חלק C- מסוף קטן המכיל את התחומים הטרנסממברני יוצרים נקבוביים מוליכות גבוהות Ca 2+. תוך חריג ואינטראקציות-למקטע היתר בבסיס תפקוד ערוץ RyR ולגרום תוקפת והפרעות לב 1. זיהוי והאפיון של תחומים ספציפיים המעורבים במבנה RyR: יחסי פונקציה חשוב אם כן להבנת הפתופיזיולוגיה RyR. טכניקות אינטראקציה בין חלבוני ביוכימיים מסורתיות דורשות כמויות ניכרות של חלבונים מטוהרים, לעתים קרובות מיוצרות חיידקים. זה לא ריאלי במקרה של RyR, עמ &#39;קרום גדול מאודrotein מורכב ~ 5000 חומצות אמינו, בעוד שברי רקומביננטי שלה לא מקובל בקלות ביטוי חיידקים וטיהור. לפיכך, מערכות ביטוי חלופיות שמקורם בתאי דם מארח איקריוטיים נדרשות עבור חלבונים בממברנה אינטגרליים יונקים. השתמשנו בעבר Y2H, שיתוף IP מבחני cross-linking להפגין באופן קולקטיבי כי tetramerization N- הסופית היא תכונה מבנית כי נשמרת על פני שלושה יונקים RyR isoforms 2,3. חשוב לציין, מצאנו כי מוטציה נקודתית אחת קשורה למחלות לב arrhythmogenic משבש N הסופית--שיוך עצמי ותוצאות ערוץ RyR מתפקדת 4. גם יש לנו ליישם טכניקות אלה ללימודי oligomerization של זנב C- מסוף ציטופלסמית RyR 5, כמו גם את N- הסופית של ערוץ הגירסות התאי Ca 2 + ההומולוגי, הקולטן אינוזיטול טריפוספט 1,4,5 2. ב assay Y2H, את interactiעל בין שני חלבונים (X ו- Y) נמדדו על ידי הכינון מחדש של גורם שעתוק תפקודי (GAL4) ואת ההפעלה שהתפתחה של גני כתב 6-9. שני וקטורי שיבוט שונים משמשים ליצירת תערובות של שני החלבונים נבדקו עם שני להפרדה פיזית, התחומים העצמאיים של GAL4: DNA מחייבת דומיין (DNA-BD) / חלבון X היתוך (פיתיון) ושם תחום ההפעלה (AD) / חלבון Y היתוך (יעד). Y2H ניתן להשתמש כדי לבדוק אם חלבון אינטראקציה עם עצמו על ידי יצירת GAL4 DNA-BD ו התכה לספירה של אותו חלבון. מהונדסים גנטיים זני Y2H הם GAL4 ו GAL80 לקויים (חלבון GAL80 הוא מדכא של GAL4), כמו גם TRP1 ו LEU2 הלקוי (כדי לספק מבחר תזונתי עבור פלסמידים פיתיון טרף, בהתאמה). בגרעין השמרים, רקומביננטי פפטידים DNA-BD ו AD מובאים לתוך קרבה פיזית קרובה לייצר גורם שעתוק GAL4 היברידי רק דרך &#39;X בשילובים שלהם: int Yeraction. גישה זו מאפשרת סריקה גנטית מהירה לגילוי אינטראקציות בין חלבונים באמצעות הפעלת תעתיק המקבילה של prototrophic (קידוד HIS3 עבור אנזים הכרחי ביוסינתזה היסטידין) ו chromogenic (קידוד LacZ עבור β-galactosidase (β-גל)) גני כתב. היתרון העיקרי של Y2H הוא כי מדובר assay in vivo מאתר אפילו חלשות או חולפות אינטראקציות חלבון-חלבון. יתר על כן, זיהוי כרוך בשימוש הפשוט של מבחר צמיחה (ב היסטידין חסר מדיה) או של colorimetric (β-גל) assay ללא צורך טיהור של חלבוני פיתיון היעד או הדור של נוגדנים ספציפיים. בנוסף, Y2H יכול לשמש מסך אוסף של שיבוטים ידועים אקראיים (שיבוטי ספריית cDNA התמזגו לספירת GAL4) שותפי מחייב רומן של חלבון פיתיון, גם מתן גישה ישירה אל cDNA של חלבון הספרייה. כדי להאריך את התצפיות Y2H, independיכולות להיות מועסקות טכניקות ביוכימיות אף אוזן גרון. Co-IP מבחני cross-linking בשילוב עם immunoblotting שיטות המשמשות לאיתור עמותות חלבון תערובות מדגם מורכבים, למשל., Lysates תא כולו 10. היתרון העיקרי שלהם הוא שהם לדווח על אינטראקציות בין חלבונים מרקמות ילידים, בניגוד לשיטות אחרות שדורשות שימוש חלבונים רקומביננטיים. חלבוני רקומביננטי יכולים לשמש גם, בדרך כלל לידי ביטוי קו תאים יונק, שם הם צפויים להיות שינויי קונפורמציה ופוסט translational הנכונים שלהם, כמו גם לוקליזציה subcellular. עם זאת, מאז שיתוף IP ו- cross-linking נמצאים מבחני חוץ גופית עושה שימוש בתאי הומוגני, יש צורך לאשר אם שני השותפים חלבון שותף מקומי בתא ללא פגע 11. אנו משתמשים באופן שגרתי transfection של HEK293 תאים יונקים להביע קרום נפרד יונקים זמני וחלבונים cytosolic בשיטת משקעים סידן פוספט 2-4,12-14, שתואר כאן בהרחבה. זוהי דרך זולה כדי לספק את ה- DNA פלסמיד ביעילות בתוך התאים אבל זה תלוי בקו תא מסוים בשימוש מפגש התא, כמו גם על טוהר פלסמיד דנ&quot;א 11,15. את assay שיתוף IP כרוך את בידודה של חלבון היליד או רקומביננטי של עניין מ lysates תא בתנאים שאינם denaturing המאפשרים שיתוף הטיהור של שותפי אינטראקציה משוערים 10,16. זה מחייב שימוש של שני נוגדנים עצמאיים, נוגדן immunoprecipitating לבידוד תרמי של החלבון X, ואת נוגדן immunoblotting לגילוי של י &#39;חלבון שותף זה יכול לשמש כדי לבדוק אם חלבון אינטראקציה עם עצמו על ידי יצירת שני בשילובים שונים עם שתי epitope שונה תגים (למשל., HA ו- cMyc). נוגדן immunoprecipitating מאוגד דרך אזור Fc שלה על-חלבון (או חלבון-G, בהתאם למין החיה, כאשר הנוגדן הועלה), אשרהוא מצומדות כדי agarose (או sepharose) שרף. X חלבון הוא זרז ידי הנוגדן: חלבון-שרף הבא דגירה עם lysate התא, כלומר השבר מסיס חומר הניקוי של תאים הומוגני. חיסוני קומפלקסי חלבונים הם eluted עם SDS המכיל חיץ ובהמשך ונותח על ידי SDS-PAGE ו immunoblotting באמצעות נוגדן כדי לזהות הנוכחות של חלבון Y 17. Co-IP צריך להתבצע עם חלבונים מסיסים חומר ניקוי כדי למנוע מחייב הלא ספציפית מוגזם. הבחירה של חומר ניקוי ריכוזו, כמו גם את המספר השוטף, צריכה להיות מותאם לכל X: זוג Y 10,16,18. Cross-linking מועסק כדי לקבוע את stoichiometry של מתחם חלבון oligomeric. היא מבוססת על תגובה כימית כדי ליצור קשרים קוולנטיים בין protomers אינטראקציה הסמוך, ולכן, היא מאפשרת בשימור מצב oligomeric של החלבון במהלך הפרדת SDS-PAGE. ישנם cross-linking רב reagents באורכים וכימיה שונים מיקוד קבוצות תגובתי שונה על חלבונים, בדרך כלל אמינים ראשוניים, קרבוקסיליות או קבוצות תיאול. כאן, אנו מתארים את השימוש של glutaraldehyde (OHC (CH 2) 3 CHO), גידול הומו-דו-תפקודי צולב מקשר עם שתי קבוצות אלדהיד משני לשם כך להגיב עם קבוצות אמינו חופשיות נוכחות שאריות ליזין 19,20. Cross-linking הוא המיושמת באופן הריכוז או שהזמן גרמן וכתוצאה מכך היווצרות adduct. תגובת Glutaraldehyde מופסקת עם הידרזין (H 2 NNH 2) דגימות חלבון מנותחים מכן על ידי SDS-PAGE ו immunoblotting 17 להעריך מדינת oligomerization שלהם. נציין כי cross-linking לא לגרום oligomerization אלא רק יוצר גשרים יציבים בין קומפלקסי חלבונים קיימים. שיקולים חשובים בעת ביצוע ניסויים cross-linking כוללים את הבחירה של מקשר צלב, זמן הריכוז והתגובה שלה 19,20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1190">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; PART 1 yeast two-hybrid</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:472px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate incubator</td>
			<td>Hereaus</td>
			<td>B6120</td>
			<td>Used at 30&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaker incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>INNOVA 4300</td>
			<td>Used at 30&#176;C with shaking at 230-250 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Lambda Bio+</td>
			<td>To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>K1604-1</td>
			<td>Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2&#160; and yeast strain Y190&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0626</td>
			<td>To prepare minimal SD growh medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dropout supplement lacking leucine and tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0750</td>
			<td>To prepare minimal SD growh medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2001</td>
			<td>To prepare minimal SD growh medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring testes carrier DNA&#160;</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>630440</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter paper Grade 5&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1005070</td>
			<td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
			<td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ONPG (o-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1127</td>
			<td>for use in liquid b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">PART 2. Protein expression in a mammalian cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;&#160;CRL-1573&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humidified incubator (5% CO2, 37 &#176;C)</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td>To culture mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td>41966</td>
			<td>To prepare growth medium for mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td>10500</td>
			<td>To prepare growth medium for mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>To homogenise cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle 23G (0.6 x 30mm)</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300700</td>
			<td>To homogenise cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail (Complete)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873508001</td>
			<td>To prevent proteolysis</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">PART 3. In vitro biochemical methods&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU&#160;</td>
			<td>For polyacrylamide gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For electrophoretic transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compact X-ray film processor</td>
			<td>Xograph</td>
			<td>X4</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td>For use in chemical cross-linking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein-A sepharose beads&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5280-01&#160;</td>
			<td>For use in co-IP assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-805</td>
			<td>For use in co-IP assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-immune rabbit IgG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-2027</td>
			<td>For use in co-IP assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-40</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-101P</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyperfilm ECL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28906836</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce (ThermoFisher)</td>
			<td>32106</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

במערכת Y2H, הפיתיון: האינטראקציה טרף נבחנת בתחילה על ידי בחירת צמיחת שמרים במדיום חסר (טריפטופן, לאוצין ו) היסטידין ובהמשך הוערך על ידי מבחני הפעילות האנזימטית β-גל (איור 1). שמרים בתרבית היסטידין בינוני חסר יש שיעור צמיחה איטי כי תלוי בחוזק של פיתיון: אינטראקצית חלבון טרף. את assay β-הגל מתבצע בשמרים (בתרבית בינונית חסרה רק טריפטופן לאוצין) או גובר על תמיכה מוצקה (צלחות אגרו) או בתרבות הנוזלת, עם תוצאות כמותיות המניבים האחרונות. השתמשנו בהצלחה את Y2H לזהות אינטראקציות תחום-תחום בתוך RyR2 כמו גם שותפי חלבון רומן 2-4,12,21,22. לדוגמא, אנחנו הקרנו סדרת חופפי בונה פורשת את אורכו של רצף הפפטיד RyR2 לאינטראקציה עם שבר N- מסוף (AD4L: שאריות RyR2 1 - 906 התמזג עם AD GAL4). 3 מבחני מושבה מתיח מסנן נייר β-גל פיק מושבות שמרים כחולים בצבע חד יחיד עבור BT4L: זוג AD4L (איור 2 א), מראים כי AD4L אינטראקציה עם עצמו, כלומר BT4L לבנות (שאריות RyR2 1 - 906 התמזגה עם GAL4 DNA-BD). מושבות כחולות לבנבן אותרו עבור BT8: זוג AD4L דבר המצביע על עמותה משנית חלשה עם התחום בטרמינל C-הקיצוני (BT8), בעוד שמרים שיתוף הפך עם כל מבנה אחר נשארו לבן ולכן שלילי עבור פיתיון: אינטראקצית חלבון טרף. תוצאות כמותיות, מתקבלות על ידי מבחני β-גל נוזלי (איור 2 ב), מצביעים BT4L החזק: שווה ערך אינטראקצית AD4L בחוזק להתאחדות הידועה בין חלבון p53 (pVA3) ו אנטיגן T הגדול SV40 (pTD1), ואילו BT8: אינטראקצית AD4L ניכר היה חלש (&lt;10% לעומת קבוצת ביקורת). אנו שגרתי לבצע ניסויים-IP שיתוף (איור 3) וollowing ביטוי חולף בקו תא יונק (HEK293), בתור שחקן assay ביוכימיים עצמאי לחזק את ממצאי Y2H 2-4,12-14,21-24. כדי לוודא RyR2 N הסופית- אינטראקציה עצמית, שני פלסמידים נפרדים קידוד עבור שאריות RyR2 1 - 906 מתויגים עם או את epitope הפפטיד cMyc או HA (BT4L ו AD4L, בהתאמה), היה שיתוף transfected בתאי HEK293 בשיטה משקע סידן פוספט 3. השבר שלאחר הגרעין של תאים הומוגני היה solubilized עם בחורים חומרי ניקוי, ואת החומר מסיס הוסר על ידי צנטריפוגה לייצר lysate התא. Lysate התא, שטופלו dithiothreitol סוכן צמצום, הודגר אז עם Ab HA וחלבון-A חרוזים sepharose כדי immunoprecipitate HA-tagged AD4L. דגימות Co-IP, eluted עם SDS המכילים חיץ, הועמסו על שני ג&#39;לים SDS-PAGE נפרד (1/10 וה 9/10 פיצול ה) ונותחו על ידי immunoblotting עם Ab HA וא.ב. cMyc, respectively. IP הישיר המוצלח של AD4L (~ 100 KDA) על ידי Ab HA אומת על ידי immunoblotting, אך לא השליטה שהלילית באמצעות IgG ארנב הלא חיסוני (איור 4 א). חשוב לציין, cMyc מתויג BT4L (~ 100 KDA) נמצאה רק IP Ab HA, ולא בבקרה שלילית בהיעדר AD4L immunoprecipitated (איור 4B). Y2H מבחני שיתוף IP ספקו הוכחות עקביות עבור RyR2 N הסופית- אינטראקציה עצמית, אבל הם לא הודיעו על מצב oligomerization של תחום N-terminal, כלומר אם הוא יוצר דימרים בלבד או מתחמים גבוהים. יצוין כי מתחמי יהיה לנתק ורק יחידות משנה המהווים יזוהו על ידי SDS-PAGE בגלל SDS- ו denaturation חלבון חום הנגרמת ביטול אינטראקציות חלבון-חלבון. כדי להתגבר על זה, אנו משתמשים cross-linking (איור 5) כי כימי ביציבות conjoins protei קייםoligomers n, מסה מולקולרית אשר יכול אז להיבדק על ידי הפרדה גודל SDS-PAGE 2-5. לדוגמא, homogenate תא HEK293 להביע cMyc-BT4L, שטופל dithiothreitol סוכן הצמצום, היה הגיב glutaraldehyde ונותח על ידי SDS-PAGE ו immunoblotting באמצעות Ab cMyc (איור 6). בנוסף מונומר (~ 100 KDA), להקת חלבון מסה מולקולרית גבוהה של ~ 400 kDa זוהתה באופן תלוי זמן, המציין היווצרות tetramer RyR2 N הסופית- 3. יש לציין, tetramer היה מינים oligomeric השולט, עם דימר מינימלי ולהקות trimer ציין. כדי לקבוע מסה מולקולרית לכאורה שלה, oligomer BT4L הופרד עד 4 - 15% שיפוע SDS-PAGE ג&#39;לים 3. הפקנו עקומת סטנדרט מולקולרי מסה / ג&#39;ל פיגור באמצעות סטנדרטים חלבון עם מגוון של 30 - 460 kDa, ו חישבנו את oligomer להיות 358 kDa 15 (n = 4). מסה מולקולרית לכאורה זו עולה בקנה אחד עם tetramer BT4L מסודרבצורה מעגלית סגורה ולא בצורה ליניארית, כצפוי מן הסידור של ארבע יחידות משנה בתוך ערוץ RyR2 ילידים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה Y2H. שמרים, שיתוף הפך עם פלסמידים הפיתיון היעד, נבחרה לצמיחה במדיום חסר היסטידין ו / או assayed עבור β-גל הפעילות האנזימטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> איור 2. Y2H ממליץ RyR2 N הסופית- דומיין עצמית אינטראקציה. (א) סכמטי המתאר את (הפיתיון) סדרת שברי חלבון חופפים האדם RyR2 נבדק במערכת Y2H עבור<html> אינטראקציה עם מבנה RyR2 N-terminal AD4L (טרף). לתוצאות בדיקות איכותיות מתקבלות על ידי מבחני מושבה מתיח מסנן נייר β-גל מסומנות ב &quot;+&quot; בכפולות או &quot;-&quot; לאינטראקציה שלילית (ב) מבחני כמותי נוזלי β-גל מנורמל נגד הבקרה החיובית (pVA3 מקודד עבור GAL4 DNA-BD. היתוך עם חלבון p53; pTD1 מקודד עבור היתוך לספירה GAL4 עם אנטיגן T גדול SV40). שונה מ 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> איור 3. Co-IP תרשים זרימה. בתאי יונקים, שיתוף transfected עם פלסמידים X ו- Y, הם הומוגני-solubilized דטרגנט לייצר lysate התא בשימוש assay שיתוף IP, ואחריו SDS-PAGE ו immunoblotting.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> איור 4. Co-IP מציין RyR2 N הסופית- דומיין עצמית אינטראקציה בתאי יונקים. HEK293 התאים היו שיתוף transfected עבור שיתוף ביטוי חולף של cMyc מתויג (BT4L) ו HA-tagged (AD4L) RyR2 N הסופית- מושלם ( שאריות 1 - 906). AD4L היה immunoprecipitated עם Ab HA מ בחורים-solubilized ו lysate HEK293 שטופל dithiothreitol, ואילו שליטה שלילי, מבחנים-IP שיתוף בוצעו עם IgG הארנב הלא חיסוני. חלבוני immunoprecipitated חוממו על 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחליטו על 20 מילים-אמפר עבור 3 שעות באמצעות ג&#39;לים 6% SDS-PAGE נפרד עמוס 1/10 ה או 9/10 ה של דגימות ה- IP. העברת חלבון לאחר ב 80 V עבור שעה 2 על polyvinyקרום lidene difluoride, ניתוח immunoblotting בוצע באמצעות (1: 1,000 דילול) Ab HA (A) או Ab cMyc (B), בהתאמה, ואחריו IgG עכבר אנטי peroxidase מצומדות חזרת (1: 10,000 דילול) וזיהוי chemiluminescence משופרת (1 חשיפה דקה). Aliquot של lysate תא, 1/50 ה מנפח מעובד בדגימות IP, נכלל גם לשרת רגיל מסה מולקולרית כמו. שונה מ 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> איור 5. Cross-linking תרשים זרימה. בתאי יונקים, טרנספקציה עם פלסמיד X, הם הומוגני נתון התגובה עם glutaraldehyde ב assay cross-linking, ואחריו SDS-PAGE ו immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> איור 6. Cross-linking מציין RyR2 N הסופית- דומיין tetramer גיבוש HEK293 התאים היו transfected עבור ביטוי חולף של מתויג cMyc (BT4L) RyR2 N הסופית- מושלם (שאריות 1 - 906).. homogenate הסלולרי, שטופל dithiothreitol סוכן הצמצום, הודגר עם glutaraldehyde עבור נקודות זמן המצוינות. דוגמאות היו מחוממות על 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחליטו על ידי SDS-PAGE (6% ג&#39;ל) ב 20 mA עבור 3 שעות. בעקבות העברת חלבון ב 80 V עבור שעה 2 על קרום difluoride polyvinylidene, ניתוח immunoblotting בוצע באמצעות (1: 1,000 דילול) Ab cMyc, ואחריו IgG עכבר אנטי peroxidase מצומדות חזרת (1:10,000 דילול) וזיהוי chemiluminescence משופרת (1 חשיפה דקה). Monomeric (M: ~ 100 KDA) ו tetrameric (T) צורות מסומנות על ידי החצים. שונה מ 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study at JoVE.com

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

genetic-biochemical-approaches-for-vivo-vitro-assessment-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

11.3K Views.  Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences. Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Video: Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...