שיטה זו מאפשרת ללמוד תצורות של קומפלקסים חלבונים הדורשים ביטוי משותף עבור דגימות בדיקה יעילות, כגון היווצרות של הטרודימרים. הפוטנציאל הסופי העיקרי של שיטה זו הוא ניצול הביטוי המשותף של חלבונים שנחקרו באופן דיפרנציאלי באמצעות שילובים של וקטורים תואמים כדי לקדם הרכבה מורכבת יעילה, יחד עם זרימת עבודה חסכונית בזמן ומדרגיות המאפשרת בדיקת טלאים מהירה של אינטראקציות מרובות. שיטה זו יכולה לשמש גם לסינון מהיר של ביטוי חלבון אופטימלי ותנאי טיהור.
הדגמה חזותית מסייעת לבצע כראוי שלבים קריטיים של הפרוטוקול, כגון הגדרת ביטוי משותף, הפרעה לתא ושלבי משיכה עוקבים. כדי להתחיל, לגדל Escherichia coli BL21(DE3) זן ב Luria-Bertani, או LB, מדיה ב 37 מעלות צלזיוס לצפיפות אופטית, או OD, של 0.1 עד 0.2. צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרחיף החיידקים למשך דקה אחת ב 9, 000 G בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.
לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של מאגר טרנספורמציה קר כקרח, או שחפת, ודגרו במשך 10 דקות על קרח. בסוף הדגירה, צנטריפוגה במשך 30 שניות ב 8, 000 G בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של חיץ שחפת, 100 ננוגרם מכל וקטור, ודגרו במשך 30 דקות על קרח.
מחממים בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך 150 שניות, ואז מצננים על קרח למשך דקה. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של LB מדיה ללא אנטיביוטיקה לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ומשהה מחדש את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של מדיה LB לפני ציפוי התרחיף על צלחת אגר LB המכילה 0.5% גלוקוז ואנטיביוטיקה מתאימה.
דוגרים על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את התאים מהצלחת עם שני מיליליטר של מדיה LB לתוך 50 מיליליטר של מדיה LB עם אנטיביוטיקה מתאימה. הוסף יוני מתכת או גורמים משלימים ידועים אחרים לפני אחסון aliquot עם 20% גליצרול במינוס 70 מעלות צלזיוס עבור ניסויים הבאים.
גדל את התאים עם סיבוב קבוע של 220 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס OD של 0.5 עד 0.7. מצננים את התרבית לטמפרטורת החדר ומוסיפים IPTG לריכוז סופי של מילימול. אחסן aliquot 20 מיקרוליטר של תרחיף התא כבקרה של הדגימה uninduced.
דוגרים על התאים למשך הלילה ב-220 סל"ד ב-18 מעלות צלזיוס. למחרת, חלקו את התרחיף החיידקי לשני חלקים ואחסנו אליציטוטים של 20 מיקרוליטר כדי לאשר את ביטוי החלבון. צנטריפוגה את השעיית התא הנותרת ב 4, 000 G במשך 15 דקות.
לבדיקת משיכה, יש להשהות מחדש את הכדוריות במיליליטר אחד של חיץ ליזה קר כקרח עם מעכבי פרוטאז וחומרים מחזרים שנוספו מיד לפני הניסוי. התאם את הרכב החיץ עבור החלבונים שנבדקו. לשבש את התאים על ידי סוניקציה על קרח ולאחסן aliquot 20 מיקרוליטר עבור אלקטרופורזה.
צנטריפוגה ב 16, 000 G במשך 30 דקות ולאסוף 20 מיקרוליטר של lysate מובהר עבור אלקטרופורזה. אזנו את השרף עם מיליליטר אחד של חיץ ליזה קר כקרח למשך 10 דקות, ואז צנטריפוגה ב -2, 000 גרם למשך 30 שניות והשליכו את הסופרנטנט. מוסיפים לליזטים של תאים לשרף ודגרים במשך 10 דקות בסיבוב קבוע של 15 סל"ד.
לאחר מכן, צנטריפוגה ולהשליך את supernatant לפני איסוף 20 מיקרוליטר של החלק unbound לניתוח. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ כביסה קר כקרח ודגרו במשך דקה אחת. שוב, צנטריפוגה ולהשליך את הסופרנטנט.
לאחר מכן, בצעו שתי שטיפות ארוכות עם חיץ כביסה קר כקרח. לאחר השטיפה השנייה, לנטרל את החלבונים הקשורים עם 50 מיקרוליטר של חיץ elution בשייקר ב 1, 200 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לנתח את חלבונים מדולל עם אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד SDS.
מחקרים על תחום הקשור לאצבעות אבץ, או ZAD, הומו-דימריזציה בחלבון קושר מלטוז, או MBP, ומבחני משיכה 6xHistidine מוצגים כאן. הביטוי המשותף של MBP ו- Thioredoxin 6xHistidine-fused ZADs מראה פעילות הומודימריזציה טובה וניתנת לשחזור, ומופיע כפס נוסף בתוצאות SDS-PAGE של מבחן משיכת MBP. דוגמה נוספת לשימוש בשיטה לחקר היווצרות מורכבת חלופית מוצגת כאן.
במבחן הביטוי המשותף, ENY2 המתויג 6xHistidine קיים אינטראקציה הן עם Sgf11 המתויג GST והן עם MBP-CTCF, אך לא היה GST-Sgf11 נוכח במשיכות MBP ולהיפך. השוואה שלב אחר שלב של מרווחי הזמן הנדרשים בזרימת העבודה של מבחן המשיכה הקונבנציונלי בהשוואה למשיכה למטה המצומדת לביטוי משותף מוצגת כאן. התוצאות של שימוש בשתי הטכניקות כדי לחקור את אותה אינטראקציה בין תחום BTB של חלבון CP190 לבין תחום C-terminal המתויג GST של חלבון Drosophila CTCF מוצגות כאן.
הבחירה הנכונה של בדיקת זיקה ומסיסות, Thioredoxin, GST או MBP, היא קריטית לביצוע יעיל של הבדיקה. צעד קריטי נוסף הוא שיבוש מהיר ואחיד של התאים. מומלץ מאוד להשתמש בבדיקות סוניקטור מרובות חוד.
שיטה זו מאפשרת מחקר ישיר של היווצרות הטרודימרים בין תחומי חלבונים שאחרת יוצרים הומודימרים שלא היו מתנתקים במהלך הדגירה של חלבונים מטוהרים במבחן משיכה קונבנציונלי.
