עבודה זו נתמכה על ידי UNCF-Merck בוגר עבודת מחקר מדעי Fellowship (JLM), הלאומי ללב, ריאות ודם המכון מענקים RO1-HL-62228 (JSJ) ו RO1-HL-073990 (JSJ).

1. הכנת פתרון &quot;הנקס מאזן מלח (HBSS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי 1 כוס כוס L, סיים את 1000 מ&quot;ל גליל, ומערבבים בר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את אבקת פתרון HBSS את כוס L autoclaved 1 כוס לציון 900 מ&quot;ל עם מים מזוקקים כפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים פתרון HBSS עם 3.4 גרם של מלח Na + Hepes ולהתאים את ה-pH לערך בין 7.35-7.41 שימוש או HCL מרוכז או NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר pH הרצוי שהושגה ונשאר יציב, להוסיף 5 גרם של אלבומין בסרום שור לפתרון בטמפרטורת החדר עד אלבומין הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של מים מזוקקים אנטיביוטיקה, antimyotic, לפתרון כפולה עד הנפח הכולל עומד בסימן מ&quot;ל 1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן הפתרון HBSS ולהפריד אותו לתוך צינורות 50 מ&quot;ל פלקון לשימוש מאוחר יותר. צינורות נוספים אפשר להקפיא ולהשתמש בהם במועד מאוחר יותר. </li></ol> 2. בעלי חיים Preparation - החדרת צינורות לקנה הנשימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מגש עם מכשירים נדרש חומר החדרת צינור לקנה הנשימה (כלומר מלקחיים, מספריים, צינור לקנה הנשימה, 3-0 תפר שחור קלוע, הנשמה חיה קטנה, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עכברוש הוא מורדם לחלוטין עם קוקטייל קטמין / xylazine ביחס של 2 ל קטמין xylazine 1, לגלח את הבטן, החזה, הגרון של החולדה. כדי להבטיח מדינה עמוק הרדמה הושגה, קמצוץ הבוהן של החולדה ולבדוק לנסיגה הדוושה של איבר. ודא עכברוש הוא הרדים עמוק לפני ביצוע כל החתכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עכברוש עם ראש מורם על קרש חיתוך, כי הוא נוטה על 30 מעלות זווית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך בעור מהבטן באמצע כדי מתחת ללסת התחתונה. משם לנתח את שרירי המשולש הקדמי של הצוואר כדי לחשוף את קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים תפר 3-0 קלוע שחור מתחת לקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך קנה הנשימה בין טבעות סחוסד להכניס את צינור לקנה הנשימה. עניבה תפר חזק כדי לאבטח את צינור לקנה הנשימה על קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את צינור לקנה הנשימה כדי הנשמה חיה קטנה. </li></ol> 3. כלי הכנה בידוד תא החיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מגש עם מכשירים את ההליך תא החיסון בידוד (כלומר מלקחיים, מספריים, HBSS, גזוז רך טפלון 24 מד בקסטר intravascular מעל המחט מהיר קת&#39;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני מזרקים 10cc, מילוי במזרק אחד עם HBSS מציגה החיץ לתוך שק קרום הלב ואת מילואים והשני עבור aspirating התאים המכילים HBSS. 3.2.1. מנמיכים את קצה טפלון של 24 מד בקסטר intravascular על (1.6 ס&quot;מ) מהירה קת&#39; על ידי מחט 1 / 2 עד 3 / 4 אורך המקורי עבור ההליך בבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמים את כל מזרקים, מאגרים, ואת ריקה 15 מ&quot;ל Tube פלקון (להחזיק את נוזל חילוץ פעם ההליך הסתיים) על קרח. </li></ol> &lt;בכיתה p = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. תא החיסון בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו האמצע של דופן הבטן (לאורך linea alba) עד שתגיע תהליך xiphoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעט רוחבית לתהליך xiphoid, לעשות חתכים דו צדדי דרך כלוב הצלעות המשך בזווית כלפי השחי. להיזהר לא לנקב את הריאות, הלב, או קרום הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חתכים משני צדי החזה הושלמו, משם לנתח את הסרעפת מן הצלעות התחתונות, חיתוך לרוחב המדיאלי. הערה: שימו לב אי פעם של קרום הלב שבו מתחבר הסרעפת ועצם החזה כדי למנוע נזק. השתמש ברצועות falciform כציון דרך לציין היכן קרום הלב מחוברת בצד השני של הסרעפת. כמו כן, אם קרום הלב הוא חתך, היכולת לבודד תאים אבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם בעדינות צד אחד של בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה והלב (במארז עדיין קרום הלב).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המזרק מלא HBSS ולמצוא טעם שק קרום הלב בערך בחצי הדרך בין עצם החזה ואת הלב (רצוי יותר מקורי מאשר הזנב) והכנס את קצה טפלון של מקוצר מהיר קת&#39; דרך שתי שכבות של קרום הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קטטר נמצא במקום, המשך בעדינות למלא את החלל עם קרום הלב מ&quot;ל 2-3 של החיץ HBBS. אתה יודע מיד אם את הקטטר ממוקם כראוי כאשר אתה מבחין החלל קרום הלב מתרחב. אם אין הוא ממלא עדים, לסגת למקם את מהיר קת&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר שק קרום הלב מתמלא, לקחת את המזרק השני 10 סמ&quot;ק והמקום טיפ בחזרה קרום הלב ולהתחיל aspirating החיץ. חור הכניסה אותו ניתן להשתמש בו או אחרת ניתן ליצור. ודא קצה לא להתקרב יותר מדי אל קירות שק קרום הלב תוך מתן יניקה, בעיקר על החלק התחתון של הלב. זה יכול להוביל ניקוב שק אובדן קרום הלב ושל תא תא המכילs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד aspirating החיץ, קצה הצנתר ניתן להעביר מסביב על מנת לאסוף חיץ ככל האפשר בתוך שק קרום הלב. </li></ol> הערה: אם בכך אתה קצת לקרוע את קרום הלב ולעשות את החור בחלק העליון של הלב גדול יותר מאשר חור המקורי, אין פאניקה. כל עוד קרום הלב עדיין מקיפה מספיק של הלב אתה עדיין יכול לבצע עוד לשטוף הלב אם כי עם כמות פחותה של המאגר. עבור אוסף של כמות אופטימלית של תאים, 03:57 רוחץ נוספים נדרשים. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיץ חילוץ לתוך צינורות פלקון שהונחו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלב, הריאות, ו / או כל רקמה אחרת במידת הצורך למחקרים נוספים. לאחר איסוף של תאים חיסוניים ורקמות אחרות, החולדה צריכה להיות במהירות המתת חסד הומנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הדוגמאות שנאספו תא החיסון במשך 10 דקות ב 200 גרם ב 4 ° C. שמור תמיד את הצינורות על הקרח<html> כאשר אינו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו מחדש את גלולה ב 1 מ&quot;ל של הצפת Hyclone או HBSS. </li></ol> הערה: חשוב לספור את מספר תאים חיסוניים המתקבל לב לאחר כל הליך תא החיסון בבידוד. 5. נציג תוצאות: דוגמה מבודדים תאים התורן הלב שהושגו עם הטכניקה הזו מוכתמת toluidine כחול safranin O / alcian כחול מוצגות דמויות 2 א ו -2, בהתאמה. כפי שניתן לראות באיור 3, התורן לב, שמרו על יכולתם שחרור היסטמין לאחר טיפול activators ידוע כגון 48/80 המתחם חומר P כמתואר מורגן et al. 9 פיזור נציג מגרשים מתוך cytometry הזרימה של תאים מסוג CD4 + CD8 + תאים מוצגים נתוני 4 ו -5, בהתאמה. לימפוציטים מסוג T מזוהים נוספים phenotyped כאוכלוסייה התא טכניקה זו. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים זרימה של תהליך הבידוד לב החיסונית התא. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig2.jpg" /> . באיור 2 תמונות נציג היסטולוגית של תא הפיטום לב מוכתמות כדלקמן: (א) עם toluidine כחול (B) הם safranin O / alcian כחול. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig3.jpg" /> באיור 3. מחקר פונקציונלית של תא הפיטום לב מבודד באזור שריר הלב epicardial ועורר עם 48/80 מתחם (10μg/mL) ו חומר P (10μM). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig4.jpg" /> איור 4. הנציג cytometry זרימה פיזור חלקות CD4 + תאים מבודדים שכותרתו עם חומר P (1:100 dilutיון). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig5.jpg" /> איור 5. Cytometry זרימה נציג בודד CD8 + תאים עם חומר הנקרא P (1:100 דילול).

<ol>
	<li>Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+effect+relationship+between+myocardial+mast+cell+number+and+matrix+metalloproteinase+activity.">Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).</li><li>Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+inhibition+of+mast+cell+degranulation+prevents+left+ventricular+remodeling+induced+by+chronic+volume+overload+in+rats.">Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats.</a> Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).</li><li>Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mast+cell-mediated+activation+of+gelatinase+and+alteration+of+ventricular+diastolic+function.">Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).</li><li>Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+adverse+myocardial+remodeling+secondary+to+chronic+volume+overload+in+mast+cell+deficient+rats.">Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).</li><li>Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Mast+Cells+Mediate+Left+Ventricular+Fibrosis+in+the+Hypertensive+Rat.">Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat.</a> Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).</li><li>Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+pro-inflammatory+cytokine+production+and+peritoneal+macrophage+function+in+rats+with+chronic+heart+failure.">Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure.</a> Cytokine. 34, 284-290 (2006).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+Cells:+Versatile+regulator+of+inflammation,+tissue+remodeling,+host+defense+and+homeostasis.">Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis.</a> Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).</li><li>Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+expression+of+inflammatory+cytokines+and+activation+markers+in+T-cells+from+patients+with+chronic+heart+failure.">Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).</li><li>Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+Relevant+Concentrations+of+Tumor+Necrosis+Factor-&#x0251;+Promote+Progressive+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Remodeling+in+Rats.">Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-&#x0251; Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats.</a> Circulation. 97, 1382-1391 (1998).</li><li>Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+Cardiac+Mast+Cells+Degranulate+and+Release+Preformed+TNF-&#x0251;,+Initiating+the+Cytokine+Cascade+in+Experimental+Canine+Myocardial+Ischemia/Reperfusion.">Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-&#x0251;, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion.</a> Circulation. 98, 699-710 (1998).</li><li>Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-&#945;+inhibition+attenuates+adverse+myocardial+remodeling+in+a+rat+model+of+volume+overload.">TNF-&#945; inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).</li><li>Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+histamine+secretion+during+isolation+of+rat+cardiac+mast+cells.">Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells.</a> Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).</li><li>Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+nervous+system+modulation+of+inflammation+and+remodeling+in+the+hypertensive+heart.">Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart.</a> Hypertension. 55, 270-276 (2010).</li><li>Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+isolating+functional+mast+cells+from+the+heart.">A novel technique for isolating functional mast cells from the heart.</a> Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

<html> שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים לב מאפשר ניתוח של תפקידם, פנוטיפ, ובגרות ללא הפעלה לא רצויה, כי בדרך כלל מתרחשת במהלך טכניקה הבידוד המסורתי האנזימטית העיכול. המספר הכולל הממוצע של תאים שהושגו עם טכניקה זו היא בסביבות 400,000 דולר הלב העכברוש, מכתים דיפרנציאלי cytometry נית?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב וציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מלח מאוזן הנקס &quot; </td><td> סיגמא </td><td> H4891 </td><td> בקבוק אחד עושה 1 ליטר של מלח מאזן &quot;הנקס פתרון. מאזן מלח מחדש הנקס &quot; הפתרון כחלק מן ההליך. </td></tr><tr><td> לאנטיביוטיקה Antimyotic </td><td> Gibco </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H3784 </td><td></td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> בקבוק 250 מ&quot;ל סינון Nalogene </td><td> Thermoscientific </td><td> 157-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 N-HCL </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> CAS 7647-01-0 </td><td> במשך 6 N, להוסיף כמויות שוות של HCL כדי deionizedהמים. </td></tr><tr><td> 10 N NaOH </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> SC267 </td><td> במשך 5 N, להוסיף כמויות שוות של NaOH למים deionized. </td></tr><tr><td> מים מזוקקים פעמיים </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה של ציוד ספציפיות: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב וציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 3-O תפר משי קלועה </td><td> Ethicon מוצרים </td><td> SA64H </td><td></td></tr><tr><td> בעלי חיים קטנים מאוורר </td><td> CWE Incorporated </td><td> SAR-830 </td><td> הגדר קצב הנשימה עד 40.5 נשימות לדקה. </td></tr><tr><td> 18 שפוע מחט מד </td><td> BD Biosciences </td><td> 305199 </td><td> חתוך על ידי מחט 1 / 2 עד 3 / 4 אורך המקורי לשימוש צינור לקנה הנשימה. </td></tr><tr><td> טפלון עצה (עם מחט הסיר) של 24-מד קטטר מהיר קת&#39; בקסטר </td><td> בקסטר </td><td> 2N111 </td><td> מנמיכים את אורך עצה טפלון על ידי 1 / 2 עד 3 / 4. </td></tr><tr><td> 10 סמ&quot;ק מזרק </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-823-16B </td><td></td></tr><tr><td> 15 מ&quot;ל פלקון צינורות </td><td> BD Biosciences </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RT6000B בקירור צנטריפוגה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 75-004-377 </td><td> זכור מראש לצנן ולשמור על 4 ° C. </td></tr><tr><td> Hyclone </td><td> Thermoscientific </td><td> S300030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> האוסר מדעי </td><td> HS-LB-1483 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of functional cardiac immune cells

תאים חיסוניים לב צוברים ריבית התפקידים שהם ממלאים שיפוץ הפתולוגי במחלות לב רבים 1-5 אלו תאים חיסוניים, הכוללים תא הפיטום, T-תאים מקרופאגים;. לאחסן ולשחרר מגוון של מתווכים פעילים ביולוגית כולל ציטוקינים פרוטאזות כמו tryptase. 6-8 מתווכים אלה הוכחו להיות שחקני מפתח מטבוליזם תאי מטריקס ידי הפעלת metalloproteinases מטריצה ​​או גרימת הצטברות קולגן על ידי פונקציית ויסות fibroblasts &#39;לב. 9-11 עם זאת, הטכניקות הזמינות עבור לבודד תאים חיסוניים יש לב היה בעייתי כי הם משתמשים collagenase חיידקי לעכל את רקמת שריר הלב. טכניקה זו גורמת להפעלה של תאים חיסוניים, ולכן אובדן תפקוד. לדוגמה, תא הפיטום לב להיות קשוב באופן משמעותי פחות תרכובות הגורמות degranulation. 12 לפיכך, אנו פיתחו שיטה המאפשרת tהבידוד של תפקודי לב תאים חיסוניים אשר יוביל להבנה טובה יותר של התפקיד של תאים אלה במחלת לב הוא. 13, 14 שיטה זו מחייבת היכרות עם המיקום האנטומי של xiphoid השחי של החולדה תהליך, רצועה falciform, ואת קרום הלב של הלב. ציוני דרך אלו חשובים כדי להגדיל את ההצלחה של ההליך כדי להבטיח תשואה גבוהה יותר של תאים חיסוניים לב. תאים אלו מבודדים החיסונית הלב יכול לשמש לאפיון הפנוטיפ של פונקציונליות, בגרות, ושיתוף תרבות ניסויים בתאי לב אחרים כדי להשיג הבנה טובה יותר של האינטראקציות שלהם.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Functional Cardiac Immune Cells at JoVE.com

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים פונקציונלי מהלב מספק אלטרנטיבה בשיטות המקובלות של collagenase העיכול, מה שגורם לתא רצויות הפעלת המערכת החיסונית, וכתוצאה מכך תגובה לירידה של תאים אלה. השיטה שלנו של בידוד התשואות תפקודית תאים חיסוניים לב על ידי הימנעות בעיות הקשורות עיכול אנזימטי.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

isolation-of-functional-cardiac-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K Views.  University of South Carolina- School of Medicine. שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים פונקציונלי מהלב מספק אלטרנטיבה בשיטות המקובלות של collagenase העיכול, מה שגורם לתא רצויות הפעלת המערכת החיסונית, וכתוצאה מכך תגובה לירידה של תאים אלה. השיטה שלנו של בידוד התשואות תפקודית תאים חיסוניים לב על ידי הימנעות בעיות הקשורות עי?...

Video: Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

בידוד של תאים דנדריטים האדם באיברי הרבייה הנקביים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...