המטרה הכוללת של מאמר זה, היא לתקנן את הפרוטוקול לבידוד, אפיון ובידול של תאי גזע לבביים, CSCs מלב העכבר הבוגר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח, בתחום מחלות לב וכלי דם וטיפול אזורי כגון, טיפול בתאי גזע לב ואי ספיקת לב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה חסכוני, עם סיוע גבוה בתקופה קטנה של זמן.
התחל ניסוי זה על-ידי הכנת כל החומרים, המכשירים ומאגרי הבידוד הדרושים במצב מעוקר כמתואר בפרוטוקול. לאחר הסרת העור מהבטן של עכבר המתת דם, לחתוך את בית החזה בתוך מכסה המנוע סטרילי כדי לפתוח את חלל בית החזה. לחשוף את הלב ולאחר מכן להסיר את הדם ליד הלב באמצעות מזרק מיליליטר אחד.
כדי להסיר כל דם ליד הלב, לשטוף את האזור שמסביב עם PBS קר כקרח. באמצעות מספריים ופינצטה כירורגית כדי לנתח את הלב, למקם אותו בצלחת פטרי 100 מילימטר המכיל 10 מיליליטר קרח קר PBS. השתמש מלקעות שוק מעוקל כדי לדקור את הלב, ולהסיר את הדם שיורית בתוך הלב.
מעבירים ארבעה עד חמישה לבבות מבודדים לצלחת פטרי של 100 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של תות תזונה למלח מאוזן של האם קר כקרח. למחוץ את הלבבות שוב כדי לשטוף אותם ולהסיר כל דם שיורית בתוך הלב. כדי להבטיח הסרה מלאה של הדם, לשנות את פתרון HBSS לאחר כל שטיפה.
החזק כל לב עם זוג ממטרים ולהשתמש בלהב כירורגי לחתוך כל לב לחתיכות 2 עד 4 מילימטר בצלחת פטרי 100 מילימטר, המכיל חמישה עד שבעה מיליליטר של HBSS. לעתים קרובות לשנות את הפתרון כדי להבטיח הסרת דם מלאה. לבסוף, טחון את הלבבות בפתרון HBSS.
צנטריפוגה הלבבות הטחון להציב צינור חרוט 50 מיליליטר ב 500 פעמים G, בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. הוסף חמישה עד שישה מיליליטר, 0.2% פתרון קולגנס II לכדור לעכל את הרקמה. להשעות מחדש את גלולה ביסודיות על ידי נדנדה הצינור על שייקר ב 75 פעמים G, ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 עד 60 דקות.
כל 20 עד 30 דקות, ללחוץ את הצינור במרץ ביד כדי לשפר את תזה. טריטוראט תערובת הרקמה lysed באמצעות חמש מיליליטר פיפטה סרולוגית, וקץ פיפטה מיליליטר אחד כדי לנטרל את גוש הרקמה לתוך ההשעיה תא יחיד. כדי לעצור את תיזה אנזימטית של הרקמה, להוסיף פעמיים עד שלוש פעמים מסחרי זמין CSC תחזוקה בינוני כמו נפח של הרקמה lysed.
להעביר את ההשעיה תא מתעכל דרך מסננת תא 100 מיקרומטר להציב על צינור חרוט 50 מיליליטר כדי להסיר את כל חתיכות רקמה מעוכל. כדי להפריד את התאים לצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות, הוסיפו 37 מעלות צלזיוס, מחוממות מראש, פוליסוקרוז ונתרן diatrizoate פתרון צינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר מכן בעדינות ולאט לאט להוסיף נפח שווה של סינון על הפתרון, הימנעות כל ערבוב של שני הפתרונות.
זה קריטי כדי להוסיף סינון מעל פתרון polysucrose ונתרן diatrizoate לאט מבלי לערבב על ידי הטיית הצינור ב 45 מעלות ועל הקיר של הצינור. אין להוסיף תוסף פוליזוכרוז ונתרן דיטריזואט מעל סינון. מניחים את הצינור לאט מאוד בצנטריפוגה דלי נדנדה הקפדה לא להפריע את הפתרונות.
צנטריפוגה במהירות של פי 500 G למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר שנקבעה במהירות תאוצה והאטה נמוכה יותר, כדי למנוע ערבוב בין שני הפתרונות, ולהפרדה נכונה של תאי גזע הלב. זה קריטי לשים את הפתרון שיפוע בזהירות רבה ללא הפרעה בצנטריפוגה. שים את התאוצה וההאטה של הצנטריפוגה חייב להיות במהירות הנמוכה ביותר, כגון אחד או אפס.
השתמש פיפטה מילימטר אחד כדי להעביר את המעיל באפי המכיל את CSCs יחד עם פתרון נוסף מהשכבה העליונה לצינור מעוקר 15 מיליליטר. מוסיפים נפח שווה של מדיום תחזוקה CSC, ומערבבים אותו כראוי כדי לנטרל את פתרון שאריות פוליזוכרוז ונתרן diatrizoate. צנטריפוגה השעיה זו ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השלך את העל-טבעי. חזור על הכביסה של CSCs עם פתרון DMEM לא שלם לפחות פעמיים. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להיפטר מכל שאריות פוליזוקרוז ונתרן diatrizoate פתרון.
לאחר הסרת supernatant, resuspend גלולה המכילה CSCs מטוהרים באמצעי תחזוקה CSC מיליליטר אחד, ולאחר מכן לספור את התאים. זרע את CSCs בצלחת תרבות שש באר מצופה 0.02% ג'לטין פתרון המכיל 0.5% fibronectin, ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום תחזוקה מלאה. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%CO2.
כאשר תרבות CSC מגיעה לקונפלנציה, להעביר את התאים לצלחת מצופה ג'לטין ופיברונקין חדשה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תרבות אלה העבירו P0 CSCs במדיום תחזוקה CSC מלא ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%CO2 עד confluent. חזור על העברת התאים לצלחת חדשה כדי ליצור CSCs P1 אשר ניתן להשתמש בהם לניסויים נוספים.
כדי לשמור על תרבות CSC בשלב הראשוני שלה, זרע את התאים עוד יותר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לאפיין את התאים המתורכלים, מניחים את לוח המכיל CSC על המטרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש בהגדלה פי עשרה כדי למקד את התאים.
כדי להתבונן בתאים, השתמש בצמצם ניגודיות פאזה והגדל את ההגדלה ל- 20 פעמים על-ידי שינוי העדשה האובייקטיבית ולאחר מכן תמונה של CSCs. לאחר ביצוע immunostaining, מניחים את צלחת התרבות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מקד את התאים בהגדלות שונות, והתבונן בתאים תחת ניגודיות פאזה ומסנני העירור השונים ושמור את התמונות.
עבור בידול תאים, לגדל את CSCs בצלחת שש באר עם שני מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, מדיום תחזוקה מחומם מראש CSC. כאשר התאים מגיעים ל-80 עד 95%, החליפו את מדיום התחזוקה בשני מיליליטר, 37 מעלות צלזיוס, אמצעי התברות קרדיומיוציטים מחומם מראש. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, ב 5% CO2 עד שבועיים עד שלושה שבועות.
שנה את מדיום ההידול כל יומיים עד שלושה ימים. במהלך השינוי הבינוני, יש להתבונן במורפולוגיה של התא תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את תנאי התרבות הטובים. לאחר 12 ימים, תדמיין את התאים עבור סמני התבולל בהתאם לפרוטוקול כשל חיסוני סטנדרטי.
יומיים עד שלושה CSCs מתורבתים מראים מורפולוגיה בצורת ציר כאשר נצפתה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. לאחר שבעה ימים של תרבות, הם מראים שינוי במורפולוגיה להיות מוארך. לאחר כשל חיסוני עבור סמנים של פלוריפוטנטיות, CSCs מציגים ביטויים של OCT4, SOX2 וננוג.
יתר על כן, CSCs להתרבות בינוני תרבות, ולהביע את סמן התפשטות Ki67. כדי לאפיין את המקור הלבבי של CSCs, נבדק ביטוי של סמני לב, והתאים הראו להיות חיובי עבור סמני לב Sca-1, NKX2.5, ו GATA4. לאחר culturing במדיום בידול cardiomyocyte במשך 12 ימים, CSCs מובחן להראות ביטוי של סמני קרדיומיוציט ACTININ, ו TROPONIN-I.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לאפשר ערבוב של הפתרון הדרגתי ואת הסינון. חשוב גם להגדיר את התאוצה וההאטה במהירות הנמוכה ביותר. מי שמזהם אותם, מומלץ לבצע את כל תהליך בידוד התא בתוך ארון biosafety.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הפרדה מבוססת חרוזים מגנטיים או שיטות מיון תאים מבוססות זרימה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון, עד כמה ברורה האוכלוסייה ההומוגנית של תאי גזע לבביים? רדיוס סדק בתא גזע לב הוא סמנים גדולים, ויש הבדלים לכיוון קרדיומיוציטים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום מחלות לב וכלי דם אשר לעתים קרובות תשואה גבוהה של תאי גזע לב מלב העכבר אשר יכול להיות חשוב לטיפול רגנרטיבי אי ספיקת לב איסכמי.
אל תשכח כי עבודה עם להב כירורגי, אקונומיקה ו- DMSO יכול להיות מסוכן, ואמצעי זהירות כגון שימוש בציוד מגן כוח אדם, PPE, תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
