הפרוטוקול שלנו מותאם למודל העכבר ומשתמש בחומרים הזמינים לכל החוקרים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מודלים בריאים, מחלות או עכברים שהשתנו גנטית. הפרוטוקול שלנו יאפשר לחוקרים לענות על כל שאלה על ביולוגיה של פריסייט לב מכל מודל עכבר של מחלה או וריאציה גנטית.
הליך זה יספק תובנה על ביולוגיה של פריציט לב ויעזור לנו להבין את תרומתם הונוסטזיס לב המודינמיקה הן בריאות ומחלות. מניחים את העכבר הרדמה בתמקם סופין, וקלטת לאורך צלעותיו. בזהירות לפתוח את חלל החזה, ו cannulate את בית הנוקטה היורד באמצעות מחט פרפר 25-מד.
תעשה חתך באולם הנכון. לאחר מכן, לבלבל את הלב עם לפחות 20 מיליליטר של 250 יחידות למיליליטר heparinized, סידן-מגנזיום ללא פוספט של דולבקו תמיסת מלח במאגר בשני מיליליטר לדקה עם משאבה פריסטולית זרימה משתנה. זלוק הושלם כאשר PBS נקי יוצא האטריה הנכונה.
חותכים את הלב ב aorta, וממקמים אותו לתוך DPBS קר כקרח סידן-מגנזיום. לאחר מכן, מעבירים את הלב לצלחת פטרי באורך 15 על 15 ס"מ. חותכים את הלב לחתיכות זעירות באמצעות מספריים האביב מדפים נקודה עדין עם פתרון אנזים מספיק כדי לכסות את החלקים.
עכשיו, להעביר את החלקים והפתרון לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, ולאטום עם סרט פלסטיק פרפין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית ב 120 סל"ד במשך 75 דקות. לאחר עיכול קולגנס עם פתרון האנזים, decant הנוזל דרך מסננת תא 100 מיקרון לתוך צינור חדש 50 מיליליטר, משאיר מספיק פתרון, כך חתיכות לא להתייבש.
באמצעות מדפים עדין נקודה, לקחת את הרקמה מהצינור ולמקום כמה חתיכות על מגלשת מיקרוסקופ. לאחר מכן, לטחון את הרקמה בין שתי שקופיות מיקרוסקופ כדי לשבור את הרקמה. שטפו את השקופיות עם מדיה תרבותית נטולת אנזימים לצינור חרוט חדש של 50 מיליליטר.
חזור על שלב זה עד שכל חתיכות הרקמה ינותק. שלבו את הפתרון המתוח ואת רקמת הקרקע לצינור אחד. מסננים את ההשעיה וכתוצאה מכך דרך מסננת תא 100 מיקרון לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר.
צנטריפוגה המדגם ב 220 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. שאפו את הפתרון הקודם, והשקיעו בעדינות את גלולת התא במאגר כתמים קר של FACS המכיל DPBS ואלבומין סרום בקר. ספור את התאים ובדוק את יכולת הקיום באמצעות מונה תאים.
לדלל את התאים למיליון תאים למיליליטר עם מאגר כתמים FACS קר המכיל DPBS ואלבומין סרום בקר. התאים מוכנים כעת להיות מוכתמים ומימוינים. הכן ותייג צינורות FACS באורך חמישה מיליליטר עבור כל הפקדים ודגימות התאים.
Aliquot מיליליטר אחד של תאים לצינור עבור מדגם נגוע, פלואורסצנטיות מינוס פקד אחד, ופקדים תואמי isotype. השתמש בתאים הנותרים עבור המיון. ניתן להכין ולהכתים בו זמנית את כל הפקדים והדגימות.
כמו כן, להכין ולתייג צינורות FACS חמישה מיליליטר עבור סך של תשעה פקדי פיצוי, שני סוגים של חרוזים נגועים בתוספת שבעה פלואורוכרומים שונים מ לוח הסמן. כדי לייעל את פקדי פיצוי הפלואורסצנטיות, הוסף טיפה אחת של קדימות פיצוי מבקבוקון הסחיטה לכל צינור. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של נוגדן ל חרוזים.
חזור על הפעולה עבור כל נוגדן מחלונית הסמן. השתמש בפקדי FMO כדי למטב כתמי רקע עקב חפיפה ספקטרלית. לתאים בצינורות הבקרה של FMO, הוסיפו את כל הנוגדנים מהלוח של הסמן בדילול של אחד ל-100, אך אל תכלול נוגדן אחד.
חזור על הפעולה עבור כל נוגדן עבור סך של שבעה פקדים. השתמש בנוגדני בקרה תואמי isotype עבור כתמים לא ספציפיים. לתאים בצינורות המסווים התואמים לאיסוטיפ, הוסיפו את נוגדן הבקרה תואם האימוטיפ בדילול של 1 ל-100.
לאחר מכן, הכן את התאים למיון. לתאים המבודדים הטריים, הוסיפו קוקטייל נוגדנים בדילול של 1 עד 100. כמו כן, להוסיף צבע הכדאיות של התא בדילול של אחד ל-1, 000.
מערבבים במרץ את בקרות הפיצוי על ידי מערבולת דופק. דגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור, למעט חרוזי הכדאיות התא, אשר ניתן להשאיר בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. ערבבו בעדינות את פקדי ה-FMO, את הפקדים התואמים לאימוטיפ ואת התאים למיון לפי מערבולות דופק.
דגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור. הוסף שלושה מיליליטר של מאגר כתמי FACS לכל בקרת פיצוי, בקרת FMO ובקרת isotype. צנטריפוגה הצינורות ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שאף את הפתרון, ולחץ מחדש על כל גלולה ב-400 מיקרוליטרים של מאגר הכתמים FACS. פקדי הפיצוי, פקדי FMO ופקדי isotype מוכנים כעת לשימוש. לאחר הכתמים, לשטוף את התאים עם חיץ כתמים FACS על ידי צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שאף את הפתרון, ולחץ מחדש על גלולת התא במאגר הכתמים FACS ל-0.5 מיליון תאים למיליליטר. באמצעות צינורות FACS חדשים עם צמרות מסנן 35 מיקרון, pipette דגימות התא המוכתם על המכסים ואת סינון הכבידה כדי להשיג מתלים חד-תאיים. שמור על קרח.
השתמש בסדרן תאים כדי לטהר את התאים. הפעל את התאים שאינם נגועים בסדרן התאים כדי להגדיר מתחים ולתקן את אות הרקע. הפעל כל דגימת חרוז פיצוי בצבע יחיד בזה אחר זה כדי להתאים מתחים עבור כל ערוץ ולהתאים שערים לאות החיובי.
לאסוף את הנתונים. השתמש בתוכנה כדי לחשב עבור חפיפה ספקטרלית על-ידי חישוב מטריצת הפיצוי. כל המתחים מוכנים ומוגדרים.
הפעל כל פקד isotype בזה אחר זה. ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי להתאים שערים עבור איגוד לא ספציפי אם קיימים כאלה. הפעל כל דגימת FMO אחת בכל פעם.
כוונן מתחים עבור כל ערוץ כדי לתקן את הגלישה הספקטרלית עקב לוח צבעוני. הפעל את דגימות התא המוכתמות בסדרן התאים. לאסוף תאים במדיה 10 מיליליטר ללא אנזימים תרבות בצינור איסוף חרוט 15 מיליליטר.
השתמש באסטרטגיית gating הבאה. ראשית, שער לתאים בודדים. ואז, שער לתאים חיים.
לאחר מכן, שער לתאים שליליים CD45. שער לתאים שליליים CD34 ו- CD31. לאחר מכן, שער לתאים NG2 חיוביים.
ולבסוף, שער לתאים חיוביים CD146 ו- CD140b. לתרבות pericytes, לזרוע את התאים שהושגו טרי במדיה תרבות ללא אנזימים על צלחת מצופה 24 באר. תרבו את התאים באינקובטור תאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ו-95% חמצן.
לאחר עיכול אנזימטי ודיסוציאציה של הלב כולו ולפני טיהור FACS של התאים, תאים הם תערובת גסה המכילים סוגי תאים רבים ושונים מהלב. לאחר טיהור FACS ו culturing, תאים הם הומוגניים. הם גרעין יחיד, שטוח למדי, ויש להם את המורפולוגיה הרומבואידית הטיפוסית.
באמצעות FACS, תאים מטוהרים להומוגניים. ראשית, פסולת וכפולים היו מגודרים החוצה בהתבסס על חלוקות פיזור קדימה וצד. לאחר מכן, תאים מתים היו מגודרים החוצה עקב תגובת המין שלהם עם הצבע, אשר מייצר אות גדול יותר אינטנסיבי יותר מאשר תאים חיים.
מתוך התאים החיים, תאים hematopoietic היו מגודרים החוצה על ידי היותו CD45 חיובי. כדי להסיר עוד יותר תאים hematopoietic ו אנדותל, CD34 חיובי ו CD31 חיובי תאים היו מגודרים החוצה. לבסוף, תאים חיוביים NG2 ו CD140b/CD146 חיובי נבחרו להיות תאים כלי דם עם ביטוי של סמני pericyte טיפוסי.
בהשוואה לתותח מוח אנושי, לתאים הייתה מורפולוגיה דומה. בהשוואה לעכבר ותאי שריר חלקים אנושיים, לתאים היה אפיון פנוטיפי מורפולוגי שונה של תאים במעבר שבע על ידי אימונוציטוכימיה עבור סמני פריצייטים לא הראו שינויים שנצפו במורפולוגיה או בביטוי סמן. באופן דומה, ניתוח על ידי ציטומטריית זרימה של pericytes במעבר שבע אישר כי האוכלוסייה נשאר הומוגנית.
כדאיות התא היא קריטית כדי להשיג תשואה טובה. שמור על קור רקמות במהלך הרכש, ולשמור על התאים קרים במהלך כתמי התא. כמו כן, ודא כי הפתרון אנזימטי מוכן טרי בכל פעם.
כדי להבטיח בידוד של התאים הנכונים לאחר culturing, לאפיין אותם עם ציטומטריה זרימה וכתמים immunofluorescent. תאים אלה יכולים לשמש בניסויים coculture עם תאים אנדותל למחקרי מחסום תפקודי, כמו גם בדיקות ללמוד את התפקוד הביולוגי והפיזיולוגי שלהם ואת המאפיינים. יליצי לב ממלאים תפקיד בסיסי בשלמות כלי הדם וביציבותם, והתפקוד הלקוי שלהם הוא תוצאתי לתפקוד הלב העולמי.
עם הטכניקה שלנו, חוקרים יכולים לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של pericytes לב.
