Bu çalışma NIH hibe R01DA021194 ve R01NS058850 tarafından desteklenmiştir.

1. Beyin dilim hazırlık <ol><li> Genç (15-40 gün eski), erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçan kullanılmıştır. (Biz de bu aynı protokolü fareler kullanın.) Derin üretan anestezisi altında, hayvanlar dekapite ve beyin hızlı bir şekilde disseke edilir. Leica vibratome (VT-1200S) substantia nigra midrostral kısmını içeren sonra 300 mikron kalınlığında koronal beyin dilimleri kesilir. 220 sakaroz, 2.5 KCl 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 D-dilim kesme işlemi (mM) içeren bir çözüm kesen bir buz-soğuk, yüksek oksijenli sakaroz yapılır: glikoz. % 95 oksijenli tutmak ve pH 7.4 &#39;de korumak için O 2 /% 5 CO 2 karışımı ile kabarmış. Kesim çözüm prosedürü boyunca buz tutun. </li><li> 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2, 1.3 MgCl 2, 10: beyin dilimleri içeren oksijenli bir yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) (mM) ile dolu bir kuluçka odasında inkübe edilir D-glukoz. % 95 oksijenli tutmak ve pH 7.4 &#39;de korumak için O 2 /% 5 CO 2 karışımı ile kabarmış. Inkübasyon sıcaklığı beyin dilim kayıt odasına transfer ° C 45 dakika kadar oda sıcaklığında 34. </li></ol> 2. Nigral nöron Elektrofizyolojik parmak izi <ol><li> Bir beyin dilim 32 oksijenli aCSF ile perfüze sürekli bir yama kelepçe kayıt odasına ° C aktarılır </li><li> Patch pipetler otoklava borosilikat (KG-33) PC-10 çektirmesi (Narishige, Tokyo, Japonya) kullanılarak cam kapiller tüp (1.10 mm id, 1.65 mm od, Kral Hassas Cam, Claremont, CA) çıkardı ve hücre içi çözeltisi ile doldurulur DNaz-RNaz içermeyen su (Fisher Scientific) (135 mM KCl, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl 2, 7.3 pH değeri ayarlanmış içeren) ile hazırlanmıştır. Yama pipetler, banyo M 2-3 dirençleri var. </li><li> Substantia nigra farklı anatomik konumu (Şekil 1A1-2) göre tespit edilir. Nomarski optik ve substantia nigra pars compacta (SNC) ve substantia nigra 60X suya daldırma objektif, geniş hücreler ile donatılmış bir video mikroskobu (Olympus BX51W1) görsel rehberliği altında (SNR) (mümkün DA nöronların ve GABA nöronlar) reticulata seçilen pars kayıt için. Konvansiyonel giga ohm sıkı bir mühür tam hücreli yapılandırma (Şekil 1B1) elde edilir. Şu kelepçe ve gerilim kelepçe analizleri yapılabilir. MRNA bozulması en aza indirmek için, elektrofizyolojik kayıt (≤ 5 dk) kısa olmalıdır. Bir seçenek, çıkarlarını nöron (Şekil B2-3) elektrofizyolojik parmak izi sağlamak için sadece membran ve spiking özellikleri kaydetmek için . Bu kısa kaydı sadece 1 dakika sürer. </li></ol> 3. Sitoplazma aspirasyon <ol><li> SNR GABA ve DA nöronları elektrofizyolojik parmak izi ve karakterizasyonu sonra, nazik ağız emme sitoplazma aspire uygulanır. Hücre çekirdeğinde de genomik DNA kirlenme sonucunda aspire edilebilir. Sıkı mühür kırık olmamalıdır, aksi ekstrasellüler enkaz mRNA da dahil olmak üzere, yama pipet içine emilir ve hücre içeriğini kirletmiş olabilir. -70 MV holding akım arttıkça sürece sıkı mühür bütünlüğünü iyi 100 pA aşmamaktadır. </li><li> Daha sonra aspire hücre içeriğini pipet ucu ve küçük bir pozitif basınç kırarak 0,2 ml PCR tüpü içine atılır. Bir hücrenin içeriğini bir PCR tüpünün içine toplanır. Hücre içeriğini kabul ettikten sonra, PCR tüpü toplayarak, buz üzerinde önceden soğutulmuş hemen -20 ° C derin dondurucuya konur. </li><li> MRNA&#39;ların içerebilir ekstrasellüler enkaz kontaminasyonu ekarte etmek için, yama pipet aslında sitoplazma aspire dokusu içine düşürülür ve sonra RT-PCR pipet içerik tabi tutulur. </li></ol> 4. Ters transkripsiyon (RT) <ol><li> Nöronların, genellikle 10-20 makul bir sayıda hücre içeriğini topladıktan sonra, RT mRNA&#39;ların bozulması en aza indirmek için hemen başlamalıdır. </li><li> Tek bir nöron hücre içeriğini miktarı çok küçük olduğundan, RNA izolasyon prosedürü uygulandı değildir. Potansiyel kirlenmesine neden olan genomik DNA kaldırmak için, aspire hücre içeriğini ilk DNaz I (5 mcL DNaz I ve 1.6 mcL DNaz I Tampon, 5 dakika 25 ° C) tarafından sindirilir. Sonra DNaz 1.2 mcL 25 mM EDTA ekleyerek 5 dakika için 75 ° C&#39;de inkübe inaktive olur. </li><li> cDNA Üst Simge III ters transkriptaz tabanlı Hücreler-Doğrudan cDNA Sentezi kiti (Invitrogen, Tablo 1) kullanılarak sentezlenir. CDNA İlk iplikçik, 50 sentezlenmiş ° C de 50 dakika sonra reaksiyon 85 ° C 5 dakika ve 1 mcL RNaz H ekleyin kuluçka tarafından inaktive olured mRNA (37 ° C 20 dk) sindirmek için. Tek telli cDNA daha sonra PCR için -20 ° C&#39;de saklanır. </li><li> Genomik DNA tamamen çıkarılması, diğer tüm reaksiyon bileşenlerini tam olarak aynı iken ters transkriptaz ihmal edildiği RT-eksi kontrolü ile doğrulanır. </li></ol> 5. İki aşamalı PCR <ol><li> Astarlar GenBank dizileri, göre dizayn edilmiştir. Mümkün olduğunca, intron kapsayan primer çiftleri yardım genomik DNA kirlenme tespit kullanılmıştır. Primer çiftinin dizilimini Tablo 2&#39;de listelenmiştir. Primer çiftlerinin etkinliğini ilk pozitif ürün veren tüm beyin mRNA&#39;ların tarafından kontrol edilmelidir. Bütün primerler Entegre DNA Teknolojileri (Coralville, Iowa, ABD) tarafından sentezlenen. </li><li> İlk aşamada, 30 mcL cDNAs 5 mcL varlığında primer çifti (Tablo 2) 35 döngü için yükseltilir. Termal cycler termal bisiklet protokolü (Mastercycler, Eppendorf, Tablo 1), 2 dakika 94 ° C, ilk denatürasyon 94 15 sn sonra 35 döngü ° C doğasını, 30 s: 55 ° C tavlama için 45 s ve 72 ° C, son uzatma için 7 dakika takip uzatmak için. PCR süper mix (Invitrogen, Tablo 1) Taq DNA polimeraz, deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP) ve PCR için gerekli tüm diğer bileşenler tarafından sağlanan </li><li> Ikinci aşamada PCR, 1. Aşama PCR 1 mcL ürün şablon olarak kullanılır ve ilk aşamada kullanılan aynı primer çifti kullanılmıştır (Tablo 2). 30 kısaltılmış uzatma süresi ile 40 döngü çalıştırılır s Aynı PCR süper karışımı kullanılır. </li><li> 2. aşama amplifikasyon PCR ürünleri% 2.5 agaroz jel elektroforezi ile ayrılmış, UV ışığı altında etidyum bromür (0.05 mg/100 ml jel) veya gelgreen tarafından görüntülendi ve fotoğraflandı (B4 Şekil). Pozitif bantlar sonra kesip, bir Qiagen ekstraksiyon kiti (Tablo 1) ve sıralı kullanarak ayıklanır ve hedef genlerin yayınlanan dizileri ile karşılaştırıldı. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları: Substantia nigra pars compacta ve reticulata pars ve substantia nigra komşu GABA projeksiyon nöronlar dopamin (DA) nöronlar pars reticulata farklı elektrofizyolojik karakteristikleri (Ding ve ark 2011. Zhou ve ark 2006). Şekil. 1B2, SNR GABA nöronlar 10 Hz etrafında yüksek frekanslı spontan spike sergilerler. Ani, etrafında bir baz süresi 1 ms var. Mevcut enjeksiyon hiperpolarizan üzerine, bu nöronların akımı I h (Şekil 1B2) zayıf bir ifade gösteren SNR GABA nöronlar, mevcut enjeksiyon hiperpolarizan yanıt zayıf bir depolarizan sarkma gösterir. Buna karşılık, nigral DA nöronları (2 Hz etrafında) 3 ms etrafında bir baz süresi kendiliğinden ani düşük frekanslı sergilerler. DA nöronlar saat akımı (Şekil 1B3) (Ding ve ark 2011, Zhou ve ark 2006) güçlü bir ifade de, mevcut enjeksiyon hiperpolarizan tepki gösteren belirgin bir sarkma gösterir . scRT-PCR elektrofizyolojik tespit SNR GABA nöronlar glutamik asit dekarboksilaz 1 (GAD1 GABA nöronların GABA sentezi ve bir işaretleyici için anahtar enzim) mRNA algılandı, ancak DA nöronları (Şekil 1B4, 5). Aksine, scRT-PCR elektrofizyolojik tespit SNC ve SNR DA nöronları tirozin hidroksilaz (TH, DA nöronlar dopamin sentezi ve bir işaretleyici anahtar enzim) için mRNA tespit ancak GABA nöronlar (Şekil 1B4, 5). Yani scRT-PCR sonuçları elektrofizyolojik nöron kimlik onaylayın. Sonra, scRT-PCR voltaj aktive Kv3 kanal alt birimden, Kv3.1, Kv3.2 Kv3.3 ve Kv3.4 ifade profil kullanılmıştır. Bu alt birimden voltaj kapılı K oluşturmak için katkıda + altbirim kompozisyon (Ding ve ark 2011) bağlı olarak farklı özellikleri kanallar. SNR GABA nöron örnekte Şekil. Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ve Kv3.4 1B4, mRNA&#39;ların tespit edildi. Örnekte SNR DA nöron, Fig.1B5 gösterilen sadece Kv3.2 Kv3.3 ve Kv3.4 tespit edildi. Bizim toplanmış veriler, Kv3.1 daha sık, hızlı spike SNR GABA nöronlar (Ding ve ark 2011) Kv3.1 daha yüksek bir ifadesi seviyesi gösteren SNR GABA nöronlar nigral DA nöronları daha tespit edildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" /> Şekil 1. SNR GABA nöronlar ve nigral DA nöronları Elektrofizyolojik kimlik: nigral alanlarda farklı anatomik konumunu tespit edilebilir. A1 1X amacı ile çekilen koronal Nissl lekeli bir bölümünde, SNC ve SNR yerini gösterir . Kutulu alan captur10X objektif ve orta görüntülenen ed ok ile gösterilen. Hücre zengin SNC ve hücre-fakir SNR açıkça göze çarpıyor. A2 4X bir hedefi ile yakalanan canlı, lekesiz koronal bölümünde SNC ve SNR yerini gösterir. Hücre zengin SNC ve hücre-fakir SNR de açıkça tanımlanabilir. Tüm hücre modunda kenetli bir SNR GABA nöron yama gösterir. VTA, ventral tegmental alan. B1, B2 mevcut kelepçe kayıt modunda SNR GABA nöronların tipik elektrofizyolojik özelliklerini gösterir . Bu nöronlar yangın kendiliğinden yüksek frekanslı eylem, kısa bir süre potansiyel ve mevcut enjeksiyon hiperpolarizan zayıf bir I h-aracılı sarkma tepki var. B3 geçerli kelepçe kayıt modunda nigral DA nöronların tipik elektrofizyolojik özelliklerini gösterir . Onlar, uzun süren spontan düşük frekanslı aksiyon potansiyelleri ateş ve belirgin bir h-aracılı sarkma (ok başı) mevcut enjeksiyon hiperpolarizan tepki var . Böylece, SNR GABA nöronlar ve nigral dopamin nöronları açıkça. Elektrofizyolojik tespit B4 bir elektrofizyolojik tespit SNR GABA nöron scRT-PCR ürünleri bir jel resmi gösterir. Glutamat dekarboksilaz 1 (GAD1) ​​mRNA ancak Tirozin hidroksilaz (TH) mRNA tespit edildi. Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ve Kv3.4 mRNA&#39;ların bu SNR GABA nöron tespit edildi. B5 SNR DA nöron nöron Kv3 kanal mRNA&#39;ların scRT-PCR gösterir. TH mRNA ancak GAD1 mRNA elektrofizyolojik tespit SNR DA nöron tespit edildi. Kv3.2, Kv3.3 ve Kv3.4 mRNA&#39;ların bu SNR DA nöron B6 toplanmış verileri gösterir tespit edildi. 7. Olası yanlış negatif ve yanlış pozitif sonuçlar Edindiğimiz deneyimlere dayanarak, çeşitli faktörler, yanlış negatif scRT-PCR sonuçlarına yol açabilir. Bu faktörler, yeterli miktarda sitoplazma pipet tıkanma, RNaz kirlenme ve verimsiz PCR primerleri yama nedeniyle aspire yetersizlik sayılabilir. Patch pipet tıkanma genellikle video monitörde görülür ve daha fazla erişim direnci ile gösterilir. RNaz kirlenme doğru hareket ettirilir ve eldiven ile önlenebilir. Bir beyin doku yumruk toplam RNA PCR primer etkinliği test edilmelidir (Zhou ve ark 2008;. Ding ve ark 2011). RT öncesinde ilk örnekleri tedavi etmek için her zaman DNaz kullanmak zamandan beri, biz yalancı pozitif sonuç ile karşılaşmadım. Teorik olarak, DNaz sindirim olmadan, genomik DNA kontaminasyonu ve böylece gen intronsuz veya primer çifti yanlış pozitif algılama ortaya çıkabilir intron bölgesi yayılabilir değildir.

<ol>
	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

ScRT-PCR ile beyin dilim yama kelepçe kayıt kombinasyonu burada iyon kanalları, reseptörleri ve ayrı ayrı karakterize nöronlar nörotransmitter sentezi için önemli enzimler için mRNA ekspresyon profilleri araştırmak için mükemmel bir yöntem sağlamak gösterdi. (Zhou ve ark 2009. Surmeier ve ark 1996), söz konusu proteinin tespit edilir ve düşük ekspresyon seviyesi ve / veya uygun antikor eksikliği nedeniyle immünohistokimya gibi diğer yöntemleri kullanarak lokalize edilemez zaman yararlıdır. Sc...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tablo 1" /> Tablo 1: Anahtar reaktifler ve ekipman <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tablo 2" /> Tablo 2. Primer çiftleri sıçan Kv3 kanal nöronal, tirozin hidroksilaz (TH) ve glutamik asit dekarboksilaz 1 (GAD1) ​​scRT-PCR için mRNA&#39;ların

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

Memeli santral sinir sistemi, nöronların farklı moleküler ve fonksiyonel özellikleri ile farklı türleri birbirlerine ayırmak için zor ve aynı zamanda kolaylıkla morfolojisi tarafından belirlenen iç içe. Böylece, belirli bir nöron türü gen ekspresyonu analiz etmek genellikle zordur. Burada önemli nigra nöronlarının farklı tipte profil mRNA tek hücreli ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (scRT PCR) ile tam hücreli yama kelepçe kayıt teknikleri birleştiren bir prosedür belge. Elektrofizyolojik teknikleri ilk bireysel nöronların nörofizyolojik ve fonksiyonel özellikleri kaydetmek için kullanılır. Sonra, elektrofizyolojik karakterize tek nigral nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, reseptörler ve iyon kanalları için mRNA profillerini elde etmek için scRT-PCR analizine tabi tutulur. Yüksek seçicilik ve duyarlılık immünohistokimya, uygun antikor ya da protein ekspresyon seviyesi düşük eksikliği nedeniyle kullanılamaz zaman bu yöntem özellikle yararlı olun. Bu yöntem aynı zamanda diğer beyin bölgeleri nöronların için geçerli.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques at JoVE.com

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Nöronlar ilk elektrofizyolojik karakterizedir. Ardından kaydedilen nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, iyon kanalları ve reseptörler mRNA&#39;ların ifade algılamak için ters transkripsiyon-PCR analizi tabi.

Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Görüntüleme.  University of Tennessee College of Medicine. Nöronlar ilk elektrofizyolojik karakterizedir. Ardından kaydedilen nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, iyon kanalları ve reseptörler mRNA'ların ifade algılamak için ters transkripsiyon-PCR analizi tabi.

Video: Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Nörobilim

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...