Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01DA021194 e R01NS058850.

1. Preparação fatia do cérebro <ol><li> Jovens (15-40 dias de idade) do sexo masculino e feminino Sprague-Dawley são usados. (Nós também usamos esse mesmo protocolo em camundongos.) Sob anestesia profunda de uretano, os animais são decapitados eo cérebro é rapidamente dissecados. De 300 m de espessura fatias do cérebro que contém a parte coronal midrostral da substantia nigra são cortados em um vibratome Leica (VT-1200S). A fatia de corte procedimento é realizado em uma gelada, sacarose oxigenado alta corte solução contendo (em mM): 220 sacarose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 D- glicose. É borbulhava com uma mistura de 95% O CO 2 / 5 2% para manter oxigenada e manter o pH em 7,4. Manter a solução de corte de gelo frio durante todo o procedimento. </li><li> As fatias de cérebro são incubados em uma câmara de incubação preenchido com um fluido cerebrospinal oxigenado artificial (ACSF) contendo (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 10 D-glicose. É borbulhava com uma mistura de 95% O CO 2 / 5 2% para manter oxigenada e manter o pH em 7,4. A temperatura de incubação é de 34 ° C por 45 min e, em seguida, em temperatura ambiente até que a fatia do cérebro é transferido para a câmara de gravação. </li></ol> 2. Fingerprinting eletrofisiológicas de neurônios da substância negra <ol><li> Uma fatia do cérebro é transferido para uma câmara de gravação de patch-clamp continuamente perfundido com a ACSF oxigenada a 32 ° C. </li><li> Pipetas patch são retirados autoclavado borosilicato (KG-33) tubo de vidro capilar (1,10 mm id, 1,65 mm de diâmetro externo, o rei de precisão de vidro, Claremont, CA), utilizando um extrator de PC-10 (Narishige, Tóquio, Japão) e preenchido com solução intracelular preparado com DNase-RNase água (Fisher Scientific) (contendo 135 mM KCl, 0,5 mM EGTA, 10 HEPES mM, 1,5 mM MgCl 2, pH ajustado para 7,3). As pipetas de correção tem resistências de 2-3 mohms no banho. </li><li> A substância negra é identificada de acordo com sua localização anatômica distintos (Fig. 1A1-2). Sob a orientação visual de um vídeo-microscópio (Olympus BX51W1) equipado com Nomarski óptica e objetiva de imersão 60X de água, grandes células da substância negra pars compacta (SNc) e substantia nigra pars reticulata (SNR) (neurônios possível DA e neurônios GABA) são selecionados para a gravação. Convencionais giga-ohm apertado selo de configuração de célula inteira é obtida (Fig. 1B1). Análises pinça de corrente e voltagem clamp pode ser realizada. Para minimizar a degradação do mRNA, a gravação eletrofisiológico deve ser breve (≤ 5 min). Uma opção é gravar somente a membrana e propriedades spiking de fornecer impressões digitais eletrofisiológico para os neurônios de interesses (Fig. B2-3). Esta gravação breve leva apenas cerca de 1 min. </li></ol> 3. Aspiração citoplasma <ol><li> Depois de fingerprinting eletrofisiológicos e caracterização de SNR GABA e neurônios DA, de sucção da boca suave é aplicada para aspirar o citoplasma. O núcleo da célula também pode ser aspirado, resultando na contaminação do DNA genômico. A vedação não deve ser quebrado; detritos de outra forma extracelular incluindo mRNA pode ser sugado para a pipeta patch e contaminar o conteúdo da célula. A integridade da vedação é bom, desde que o aumento na corrente segurando a -70 mV não exceda 100 pA. </li><li> Em seguida, o conteúdo da célula aspirado é expulso em um tubo de 0,2 mL PCR, quebrando a ponta da pipeta e uma pressão pequena positivo. Conteúdo de uma célula é coletado em um tubo de PCR. Depois de aceitar o conteúdo da célula, a coleta de tubos PCR, pré-resfriado em gelo, é imediatamente colocado em um freezer -20 ° C. </li><li> Para impedir a contaminação de detritos extracelulares que podem conter mRNAs, a pipeta patch é baixado para o tecido sem realmente aspiração citoplasma e, em seguida, o conteúdo da pipeta é submetido a RT-PCR. </li></ol> 4. Transcrição reversa (RT) <ol><li> Depois de recolher o conteúdo da célula a partir de um número razoável de neurônios, geralmente 10-20, RT deve começar imediatamente para minimizar a degradação dos mRNAs. </li><li> Uma vez que a quantidade do conteúdo da célula a partir de um único neurônio é muito pequeno, RNA procedimento de isolamento não é executada. Para remover o DNA genômico potenciais contaminantes, o conteúdo da célula é aspirada primeiro digerido pelo DNase I (5 mL DNase I e 1,6 mL DNase I Buffer, 5 min a 25 ° C). Então DNase I é inativada pela adição de 1,2 mL 25 mM EDTA e incubado a 75 ° C por 5 min. </li><li> cDNA é sintetizado usando o SuperScript III da transcriptase reversa baseada em células-Direct kit de síntese de cDNA (Invitrogen, Tabela 1). Primeiro domínio cDNA é sintetizado a 50 ° C por 50 min, então a reação é inativada por incubação a 85 ° C por 5 min e 1 mL de RNase H é adicionared para digerir mRNA (37 ° C por 20 min). O cDNA de fita simples é armazenado a -20 ° C para a amplificação PCR mais tarde. </li><li> Remoção completa do DNA genômico é verificada por RT-minus controle em que a transcriptase reversa é omitida, enquanto todos os componentes de reação outros eram exatamente as mesmas. </li></ol> 5. Dois estágios de amplificação PCR <ol><li> Primers foram desenhados de acordo com as seqüências no GenBank. Sempre que possível, intron-spanning pares de primers foram usados ​​que ajudam a detectar a contaminação do DNA genômico. Seqüências de primers estão listadas na Tabela 2. A eficácia dos pares de primer deve ser o primeiro verificado pelo mRNAs cérebro inteiro que produzem produtos positivo. Todos os primers são sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, EUA). </li><li> Na primeira fase, 5 mL de 30 mL cDNAs é amplificado por 35 ciclos com a presença do par de primer (Tabela 2). O protocolo de ciclagem térmica do termociclador (Mastercycler, Eppendorf, Tabela 1) é de 2 min a 94 ° C para a desnaturação inicial, em seguida, 35 ciclos de 15 s em 94 ° C para desnaturar, 30 s, a 55 ° C para recozer, e 45 s em 72 ° C para estender, seguido por 7 min para uma extensão final. Taq DNA polimerase, trifosfatos desoxinucleotídeo (dNTPs), e todos os outros componentes necessários para a amplificação PCR são fornecidos por um super PCR mix (Invitrogen, Tabela 1) </li><li> Na segunda etapa da PCR, o produto de 1 mL da 1 ª etapa de amplificação por PCR é usado como modelo eo par de primer mesmo utilizado no primeiro estágio é utilizado (Tabela 2). 40 ciclos são executados com o tempo de extensão reduzida para 30 s. O mesmo PCR mix super é usado. </li><li> Produtos de PCR de amplificação do estágio 2 º estão separados por eletroforese em gel de agarose 2,5%, sendo visualizado por brometo de etídio (0,05 mg/100 mL gel) ou gelgreen sob luz UV e fotografado (Fig. B4). As bandas positivos são então cortadas, extraído usando um kit Qiagen extração (Tabela 1) e sequenciado, e comparadas com as seqüências publicadas dos genes-alvo. </li></ol> 6. Resultados representativos: A dopamina (DA) neurônios na substância negra pars compacta e pars reticulata e os vizinhos neurônios de projeção GABA na substância negra pars reticulata têm distintas características eletrofisiológicas (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011).. Como mostrado na figura. 1B2, os neurônios SNR GABA apresentam picos de alta freqüência espontânea em torno de 10 Hz. Os picos têm uma duração base de cerca de 1 ms. Após hiperpolarizantes injeção de corrente, os neurônios GABA SNR exibir um sag fraco despolarizantes em resposta a hiperpolarizantes injeção de corrente, indicando uma fraca expressão da I h atuais nestes neurônios (Fig. 1B2). Em contraste, os neurônios nigral DA apresentam baixa freqüência (cerca de 2 Hz) picos espontâneos que têm uma duração base de cerca de 3 ms. Neurônios DA também mostram uma queda acentuada em resposta à injeção de corrente hiperpolarizante, indicando uma forte expressão de I h corrente (Fig. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011). SCRT-PCR detectaram mRNA para descarboxilase do ácido glutâmico 1 (GAD1, a enzima chave para a síntese de GABA e um marcador de neurônios GABA) em eletrofisiologicamente identificados SNR GABA neurônios, mas não em DA neurônios (Fig. 1B4, 5). Em contraste, SCRT-PCR detectaram mRNA de tirosina hidroxilase (enzima TH, a chave para a síntese de dopamina e um marcador de neurônios DA) na SNc eletrofisiologicamente identificados e neurônios SNR DA, mas não em neurônios GABA (Fig. 1B4, 5). Então SCRT-PCR resultados confirmam a identificação neurônio eletrofisiológico. Em seguida, SCRT-PCR foi usado para o perfil da expressão de tensão ativado Kv3 subunidades canal Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4. Estas subunidades contribuem para formar voltagem dependentes K + canais de diversas propriedades dependendo da composição de subunidades (Ding et al. 2011). No exemplo SNR GABA neurônio mostrado na figura. 1B4, mRNAs para Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 foram detectados. No exemplo SNR DA neurônio mostrado na Fig.1B5, apenas Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 foram detectados. Em nossos dados agrupados, Kv3.1 foi mais frequentemente detectado em neurônios GABA SNR do que nos neurônios nigral DA, indicando um maior nível de expressão de Kv3.1 no fast-spiking SNR GABA neurônios (Ding et al. 2011). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" /> Figura 1. Identificação eletrofisiológicas de neurônios GABA SNR e neurônios nigral DA A:.. Nigral áreas podem ser identificados por sua localização anatômica distintos A1 mostra a localização da SNc e SNR em uma seção Nissl manchada coronal capturado com um objetivo 1X. A área foi encaixotado CAPTURed com uma objetiva de 10X e exibidas no meio, como indicado pela seta. A SNc células-ricos e pobres células SNR são claramente visíveis. A2 mostra a localização da SNc e SNR em um ao vivo, sem manchas seção coronal capturado com um objetivo 4X. A SNc células-ricos e pobres células SNR também são claramente identificáveis. VTA, área tegmental ventral. B1 mostra um SNR GABA remendo neurônio sendo preso no todo-cell modo. B2 mostra as propriedades típicas eletrofisiológicas de neurônios GABA SNR no modo actual de fixação de gravação. Esses neurônios fogo potencial de ação espontânea de alta freqüência de curta duração e têm uma resposta fraca Eu sag h mediada para hiperpolarizantes injeção de corrente. B3 shows típicos propriedades eletrofisiológicas de neurônios nigral DA no modo actual de fixação de gravação. Eles fogo espontâneo potenciais de baixa freqüência de ação de longa duração e têm um proeminente eu sag h-mediada (cabeça de seta) resposta ao hiperpolarizantes injeção de corrente. Assim, os neurônios GABA SNR e neurônios dopaminérgicos da substância negra são claramente identificados eletrofisiologicamente. B4 mostra uma imagem de gel SCRT-PCR produtos de um eletrofisiológico identificou SNR GABA neurônio. Descarboxilase glutamato 1 (GAD1) ​​mRNA, mas não tirosina hidroxilase mRNA (TH) foi detectado. mRNAs para Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 foram detectados neste GABA SNR neurônio. B5 mostra SCRT-PCR detecção de mRNAs canal neuronal Kv3 em um neurônio DA Snr. MRNA TH mas não mRNA GAD1 foi detectado em um eletrofisiologicamente identificados SNR DA neurônio. mRNAs para Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 foram detectados neste DA SNR neurônio. B6 mostra dados agrupados. 7. Potencial de falsos negativos e falsos resultados positivos Com base em nossa experiência, vários fatores podem levar a resultados falso negativos SCRT-PCR resultados. Esses fatores incluem insuficiência na aspiração quantidade suficiente do citoplasma, devido à correção da pipeta entupimento da ponta, a contaminação RNase e ineficiente primers PCR. Remendo entupimento ponteira geralmente pode ser visto no monitor de vídeo e indicado pela resistência maior acesso. RNase contaminação pode ser evitada através de uma desactivação completa e luvas. PCR eficácia do primer deve ser testada usando RNA total a partir de um tecido cerebral punch (Zhou et al 2008;.. Ding et al 2011). Uma vez que usamos sempre DNase primeiro tratamos nossos amostras antes de RT, não temos encontrado resultados falso-positivos. Teoricamente, sem digestão DNase, a contaminação do DNA genômico e, assim, a detecção de falsos positivos pode ocorrer quando o gene é intronless ou o par de primer não abrange a região intron.

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	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A combinação de gravação de patch-clamp na fatia do cérebro com SCRT-PCR demonstramos aqui fornecem um excelente método para investigar os perfis de expressão de RNAm para canais iônicos, receptores e enzimas-chave para a síntese de neurotransmissores nos neurônios individualmente caracterizado. Isso é particularmente útil quando a proteína em questão não podem ser detectadas e localizadas através de outros métodos, tais como imunohistoquímica, devido ao nível de baixa expressão e / ou falta de antic...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1. Reagentes e equipamentos chave <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="Tabela 2" /> Tabela 2. Pares de primers para rato canal Kv3 neuronal, tirosina hidroxilase (TH) e descarboxilase do ácido glutâmico 1 (GAD1) ​​mRNAs para SCRT-PCR

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

No sistema central de mamíferos nervoso, diferentes tipos de neurônios com diversas características moleculares e funcionais são misturados uns com os outros, difícil separar e também não são facilmente identificados pela sua morfologia. Assim, é muitas vezes difícil de analisar a expressão de gene em um tipo de neurônio específico. Aqui nós documentamos um procedimento que combina de célula inteira correção técnicas de gravação de fixação com uma única célula reverter reação em cadeia da polimerase (SCRT-PCR) para expressão de mRNA perfil em diferentes tipos de neurônios no nigra substancial. Técnicas eletrofisiológicas são utilizados pela primeira vez para registrar as propriedades neurofisiológicas e funcionais de neurônios individuais. Então, o citoplasma de uma única eletrofisiologicamente caracterizada neurônios da substância negra é aspirado e submetido a SCRT-PCR para obter perfis de expressão de RNAm para as enzimas de síntese de neurotransmissores, receptores e canais iônicos. A alta seletividade e sensibilidade tornam este método particularmente útil quando imunohistoquímica não pode ser usado devido à falta de anticorpos adequado ou baixo nível de expressão da proteína. Este método também é aplicável aos neurônios em outras áreas do cérebro.

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Neurônios são os primeiros caracterizada eletrofisiologicamente. Em seguida, o citoplasma do neurônio gravado é aspirado e submetido a transcrição reversa-PCR para detectar a expressão de mRNAs de enzimas neurotransmissor síntese, canais iônicos e receptores.

Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K visualizações.  University of Tennessee College of Medicine. Neurônios são os primeiros caracterizada eletrofisiologicamente. Em seguida, o citoplasma do neurônio gravado é aspirado e submetido a transcrição reversa-PCR para detectar a expressão de mRNAs de enzimas neurotransmissor síntese, canais iônicos e receptores.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Neurociência

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...