この作品は、NIHの助成金R01DA021194とR01NS058850によってサポートされていました。

1。脳スライス標本<ol><li>ヤングは（15〜40日齢）の雄と雌のSprague - Dawleyラットが使用されます。 （我々はまた、マウスでこれと同じプロトコルを使用する。）深いウレタン麻酔下で、動物を断頭され、脳を速やかに解剖しています。黒質のmidrostral一部を含む、300μmの厚さの冠状脳切片は、ライカビブラトーム（VT - 1200S）にカットされています。手順を切断スライスを含む溶液を（mMで）切る、氷冷、酸素、高ショ糖で実行されます：220ショ糖、2.5のKCl、1.25のNaH 2 PO 4、25のNaHCO 3、0.5 CaCl 2で 、7のMgCl 2、10 D -ブドウ糖。それは、95％酸素化を維持し、pH7.4のpHを維持するためにO 2 / 5％CO 2の混合物にバブリングする。手続きを通じて最先端ソリューションの氷冷をしてください。 </li><li> 125のNaCl、2.5 KClを、1.25のNaH 2 PO 4、25のNaHCO 3、2.5のCaCl 2、1.3のMgCl 2、10：脳のスライスを含む酸素人工脳脊髄液（ACSF）（mMで）を充填したインキュベーションチャンバー中でインキュベートされていますD -グルコース。それは、95％酸素化を維持し、pH7.4のpHを維持するためにO 2 / 5％CO 2の混合物にバブリングする。インキュベーション温度は34℃です。室温で45分間、その後のC脳スライスを記録室に転送されるまで。 </li></ol> 2。黒質神経細胞の電気生理学的フィンガープリンティング<ol><li>一つの脳のスライスは、連続して32に酸素化されたACSFを灌流パッチクランプ記録チャンバー℃に転送されます。 </li><li>パッチピペットはオートクレーブホウケイ酸（KG - 33）PC - 10プーラーを（ナリシゲ、東京、日本）を用いてガラスキャピラリーチューブ（1.10 mm（内径）、1.65 mm外径、キングプレシジョンガラス、クレアモント、カリフォルニア州）から取り出されて細胞内液で満たされているDNアーゼ- RNaseフリー水（フィッシャーサイエンティフィック）（135 mMの塩化カリウム、0.5mMのEGTA、10mMのHEPES、1.5mMのMgCl 2、pH7.3に調整したpHを含む）を用いて調製。パッチピペットは、バスでMΩ2-3の抵抗を持っている。 </li><li>黒質は、その明確な解剖学的位置（ 図1A1 - 2）にしたがって識別されます。黒質緻密部（SNC）および黒質におけるノマルスキー光学系と60Xの水浸レンズを搭載したビデオ顕微鏡（オリンパスBX51W1）、大規模な細胞の視覚的なガイダンスは、網様部の下に（SNR）（可能なDAニューロンとGABAニューロン）が選択されています録音用。従来のギガオームタイトシール全細胞の構成が得られる（ 図1B1）。電流クランプと電圧​​クランプ解析を行うことができます。 mRNAの分解を最小限に抑えるために、電気生理学的記録は、（≤5分）簡単なはずです。一つのオプションは、興味の神経細胞（ 図B2 - 3）のために電気生理学的指紋を提供する唯一の膜とスパイクの特性を記録することです。この簡潔な記録は、わずか約1分かかります。 </li></ol> 3。細胞質の吸引<ol><li> SNR GABAおよびDAニューロンの電気生理学的フィンガープリンティングと特性評価の後、穏やかな口の吸引は、細胞質を吸引するために適用されます。細胞核は、ゲノムDNAのコンタミネーションで、その結果、吸引されることがあります。タイトなシールが破られてはいけません、それ以外のmRNAを含む細胞外破片は、パッチピペットに吸引し、セルの内容を汚染する可能性があります。 -70 mVで保持電流の増加が100 pAを超えていないとして、密封の完全性は、長いようなものがあります。 </li><li>その後、吸引セルの内容は、ピペットチップや小さな正圧を壊すことによって、0.2mLのPCRチューブに排出されます。一つのセルのコンテンツが複数のPCRチューブに回収される。セルの内容を受け入れた後、収集PCRチューブ、氷上で冷却したが、直ちに-20℃の冷凍庫に配置されます。 </li><li> mRNAを含む可能性のある細胞破片の汚染を除外するために、パッチピペットは、実際に細胞質を吸引することなく、組織に低下し、その後ピペットの内容は、RT - PCRに供される。 </li></ol> 4。逆転写（RT） <ol><li>通常のニューロンは、10〜20の合理的な数から、セルの内容を収集した後、RTがmRNAの劣化を最小限に抑えるために、直ちに開始する必要があります。 </li><li>単一のニューロンからの細胞のコンテンツの量が小さすぎるので、RNAの単離操作は実行されません。潜在的な汚染ゲノムDNAを除去するには、吸引セルの内容は、最初のDNase I（5μLのDNase Iおよび1.6μLのDNase Iをバッファー、25℃で5分° C）によって消化される。をDNase Iは1.2μLの25 mM EDTAを追加し、5分間75℃でインキュベートすることにより不活化される。 </li><li> cDNAをスーパースクリプトIII逆転写酵素ベースのセルダイレクトcDNA合成キット（インビトロジェン、 表1）を用いて合成される。第一鎖cDNAは、50℃で合成される℃で50分間は、その後、反応は85℃インキュベーションによって不活性化される℃で5分間、1μLのRNase Hに対するCの追加です。EDは、mRNA（37℃、20分間）を消化する。一本鎖cDNAは、後のPCR増幅のために-20℃で保存されます。 </li><li>ゲノムDNAの完全な除去は、他のすべての反応成分がまったく同じだったしながら逆転写酵素が省略されているRT -マイナスコントロールによって検証されます。 </li></ol> 5。二段階PCR増幅<ol><li>プライマーは、GenBankの配列に基づいて設計されました。可能な限り、イントロンスパニングプライマーのペアは、ヘルプはゲノムDNAのコンタミを検出するために使用された。プライマー対の配列を表2にリストされています。プライマーペアの有効性は、最初の肯定的な製品を生み出す脳全体のmRNAで検証する必要があります。すべてのプライマーは、統合されたDNA技術（コーラル、アイオワ州、米国）によって合成される。 </li><li>最初の段階では、30μLのcDNAの5μLをプライマー対（ 表2）の存在下で35サイクル増幅されます。サーマルサイクラーのサーマルサイクリングのプロトコール（MasterCycler、エッペンドルフ、 表1）は 、94℃、初期変性のためのC、94℃15秒の後、35サイクル° C変性するために、55℃30秒を° Cでアニールすることで2分です。と72℃で45秒° Cが最後の伸長のための7分間に続いて、拡張する。Taq DNA ポリメラーゼ 、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPの）、およびPCR増幅のために必要な他のすべてのコンポーネントは、PCRスーパーミックス（Invitrogen社製、表1）によって提供される</li><li>第二段階PCRでは、第1段階 PCR増幅から1μLの製品は、テンプレートとして使用され、最初のステージで使用したものと同じプライマー対は、（ 表2）が使用されます。 40サイクルを30に短縮延長時間で実行されているS.同じPCRスーパーミックスが使用されます。 </li><li>第2段階の増幅からPCR産物を2.5％アガロースゲル電気泳動によって分離され、UV光の下でエチジウムブロマイド（0.05 mg/100 mLのゲル）またはgelgreenによって可視化、および（B4図 ）撮影。切り出した正のバンドはその後、キアゲン抽出キット（ 表1）と配列決定を用いて抽出し、標的遺伝子の公表された配列と比較されます。 </li></ol> 6。代表的な結果： 黒質緻密部と網様部と黒質に隣接するGABA投射ニューロンにおけるドーパミン（DA）ニューロンは網様が異なる電気生理学的特性（;丁ら2011。Zhouら2006）がある様部。 図に示す。 1B2、SNR GABAニューロンは、10 Hz付近の高周波自発的なスパイクを示す。スパイクは1ミリ秒程度の基本持続時間を持っている。電流注入を過分極すると、SNR GABAニューロンは、これらのニューロンに電流I H（ 図1B2）の弱い発現を示し、電流注入を過分極に応答して、弱い脱分極サグが表示されます。対照的に、黒質のDAニューロンは（2 Hz付近）ミリ、約3ベースの持続時間を持って自発的なスパイクを低周波数を示す。 DAニューロンはまた、I H電流（ 図1B3）（。。;丁ら2011 Zhouら2006）の強い発現を示し、電流注入を過分極に応答して顕著な電圧低下を示す。 SCRT - PCRは、電気生理学的に同定されたSNR GABAニューロンではなく、DAニューロン（ 図1B4、5）でグルタミン酸脱炭酸酵素1のmRNA（GAD1、GABA合成およびGABAニューロンのマーカーのための重要な酵素）を検出する。対照的に、SCRT - PCRは、電気生理学的に同定されたSNCとSNR DAニューロンではなく、GABAニューロン（ 図1B4、5）でチロシン水酸化酵素のmRNA（ドーパミン合成とDAニューロンのマーカー用TH、鍵酵素）を検出する。そうSCRT - PCRの結果は、電気生理学的ニューロンの同定を確認する。次に、SCRT - PCRは、電圧活性化KV3チャネルサブユニット、Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3とKv3.4の発現をプロファイルするために使用されていました。これらのサブユニットがサブユニットの組成に応じて多様な特性の電位依存性K +チャネル（ディンら、2011）を形成するために貢献する。この例ではSNR GABAニューロンは、 図に示す。 1B4は 、Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3とKv3.4のmRNAが検出された。 Fig.1B5に示す例ではSNRがDAニューロンでは、唯一のKv3.2、Kv3.3とKv3.4が検出された。私達のプールされたデータでは、Kv3.1はより頻繁に速いスパイクSNR GABAニューロン（ディンら、2011）におけるKv3.1の高い発現レベルを示す、黒質のDAニューロンに比べてSNR GABAニューロンが検出された。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" /> 図1。 SNR GABAニューロンと黒質のDAニューロンの電気生理学的同定：黒質領域は、それぞれ異なる解剖学的位置によって識別することができますA1は 1X目的で撮影した冠状ニッスル染色セクションでSNCとSNRの位置を示しています。。箱入りの面積はCAPTURいた矢印で示すように10倍の目標と真ん中に表示されているとED。細胞の豊富なSNCおよびセル悪いSNRがはっきりとわかります。A2は 4X目的で撮影したライブ、未染色の冠状断面におけるSNCとSNRの位置を示しています。細胞の豊富なSNCおよびセル悪いSNRも明確に識別可能です。 VTA、腹側被蓋野。B1には、全細胞モードでクランプされたSNRがGABAニューロンであることパッチを示しています。B2は、現在のクランプ記録モードでのSNR GABAニューロンの典型的な電気生理学的特性を示しています。短い期間のこれらのニューロンの火災自発高周波の活動電位と電流注入を過分極に弱い私は、H -介したサグ応答を持っている。B3は、現在のクランプ記録モードでの黒質のDAニューロンの典型的な電気生理学的特性を示しています。彼らは、長い期間の自発的な低周波の活動電位の発火や著名なI H -介したサグ（矢印の頭）電流注入を過分極に応答している。このように、SNR GABAニューロンと黒質ドーパミンニューロンは明らかに電気生理学的に識別されます。B4電気生理学的同定されたSNRはGABAニューロンからSCRT - PCR産物のゲルの写真を示しています。グルタミン酸脱炭酸酵素1（GAD1）のmRNAがないチロシンヒドロキシラーゼ（TH）のmRNAが検出されました。 Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3とKv3.4のmRNAは、このSNR GABAニューロンが検出された。B5は SNR DAニューロンにおける神経KV3チャネルmRNAのSCRT - PCR検出を示しています。 THのmRNAがないGAD1のmRNAは、電気生理学的に同定されたSNR DAニューロンが検出された。 Kv3.2、Kv3.3とKv3.4のmRNAは、このSNR DAニューロンが検出された。B6は、プールされたデータを示しています。 7。潜在的な偽陰性と偽陽性の結果我々の経験に基づいて、いくつかの要因が偽陰性SCRT - PCRの結果につながることができます。これらの要因は、パッチピペットの先端の目詰まり、RNaseのコンタミ、および非効率的なPCRプライマーによる細胞質の十分な量を吸引で失敗が含まれています。パッチピペットの先端の目詰まりは、通常、ビデオモニタ上で見られるとのアクセスが増加の抵抗によって示すことができます。 RNaseのコンタミは、徹底した非活性化し、手袋することで回避できます。 PCRプライマーの有効性は、脳組織パンチからトータルRNAを使用してテストする必要があります（。Zhouら2008;。ディンら、2011）。 我々は常に、最初のRTの前に我々のサンプルを治療するためにDNaseを使用するので、我々は、偽陽性の結果が発生していない。理論的には、DNase処理なしに、ゲノムDNAのコンタミネーションとそのため偽陽性の検出は、遺伝子がイントロンであるかのプライマー対は、イントロン領域をまたいでいない場合に発生する可能性があります。

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	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

SCRT - PCRによる脳スライスにおけるパッチクランプ記録の組み合わせは、我々は、イオンチャネル、受容体、および個々に特徴づけられる神経細胞における神経伝達物質の合成の鍵酵素のmRNA発現プロファイルを調べるための優れた方法を提供するここに示した。これにより、問題​​がある蛋白質がこのような低発現量に起因する免疫組織化学および/または適切な抗体の欠如など、他の方法...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="表1" /> 表1。主な試薬と装置<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="表2" /> 表2。ラット神経KV3チャネル、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）とグルタミン酸脱炭酸酵素1（GAD1）SCRT - PCRのためのmRNAのプライマー対

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

哺乳類の中枢神経系では、多様な分子と機能的な特性を持つ神経細胞の異なるタイプが、互いに混ざり分離することが困難とも容易にその形態によって識別されていません。従って、それは特定のニューロンタイプに遺伝子発現を解析することは困難です。ここでは、かなりの黒質の神経細胞の異なる種類のプロファイルのmRNA発現の単一細胞逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（SCRT - PCR）で細胞全体のパッチクランプ記録技術を組み合わせた手順を文書化する。電気生理学的手法は、まず個々のニューロンの神経生理学的および機能的特性を記録するために使用されます。次に、単一の電気生理学的特徴と黒質神経細胞の細胞質を吸引し、神経伝達物質合成酵素、受容体、イオンチャネルのmRNAの発現プロファイルを得るためにSCRT - PCR解析に供される。高選択性と感度は免疫組織化学が原因でsuitable抗体やタンパク質の低い発現レベルの欠如に使用できない場合、このメソッドは特に有用です。また、このメソッドは、他の脳領域の神経細胞に適用可能です。

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

ニューロンは、最初の電気生理学的に特徴づけられる。その後、記録されたニューロンから細胞質を吸引し、神経伝達物質合成酵素、イオンチャンネル、受容体のmRNAの発現を検出するために転写- PCR解析を逆に供される。

シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K ビュー.  University of Tennessee College of Medicine. ニューロンは、最初の電気生理学的に特徴づけられる。その後、記録されたニューロンから細胞質を吸引し、神経伝達物質合成酵素、イオンチャンネル、受容体のmRNAの発現を検出するために転写- PCR解析を逆に供される。

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

神経科学

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

パッチクランプ技術を用いたダーク適応、マウス網膜スライス標本におけるニューロンにおける記録光誘発シナプス後応答

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

作成、テスト、および成人の脳の切片でカリウム イオン選択的な電極を使用して

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

絶対数のシーケンス (Seq 歌姫) と手動並べ替えおよび二重の in Vitro転写を使用してマウスの蛍光に分類されたニューロンの単一細胞 RNA シーケンス

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現 の 検出

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...