ברצוננו להכיר את כל הקבוצה מאורר באוניברסיטת וושינגטון, אשר הידע הקולקטיבי הפך פרוטוקול זה אפשרי. מימון עבור עבודה זו מסופקת על ידי המכון הלאומי לבריאות הנפש (1R01MH085495).

1. הכנת המאסטר Patterned (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרכז פרוסות סיליקון על coater הכביסה, לשטוף את רקיק עם אצטון במהלך השלב הראשוני של תוכנית שתי מחזור ספין בטבלה 1. אצטון יתאדה במהלך השלב השני של התוכנית ספין להשאיר רקיק נקייה ויבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בערך 1 מ&quot;ל AZ9245 photoresist / ב (בקוטר) כדי רקיק ועל ספין מעיל באמצעות התנאים שתוארו בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכים לאפות את רקיק photoresist מצופה ב 110 מעלות מ &#39;2 באמצעות פלטה חשמלית אחידות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Photopattern את המצע או באמצעות מערכת ישיר לכתוב photolithography או aligner מסכת המערכת מסכה המתאימה. מסכות ניתן לרכוש ממספר מקורות מסחריים. בנוסף, שקפים מודפסים בדיו סופג קרינת UV, מודבק שטוח אופטי, ניתן להשתמש כדי לייצר דפוסים עם תכונות גדולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח רקיק בדוגמת מפתח 400K ב 01:02: כיתה מוליכים למחצה מים deionized עבור 1 מ 45 s עם תסיסה עדינה. לשטוף ביסודיות עם מים מוליכים למחצה כיתה deionized ויבש עם זרם של חנקן (N 2) גז. פיתוח תבנית ניתן לבדוק באמצעות מיקרוסקופ עם פילטר UV. אם התבנית אינה מפותחת, רקיק ניתן להחזיר את הפתרון בפיתוח בפעם נוספת. </li></ol> הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, photopatterning צריך להתבצע cleanroom בסביבה. 2. הכנת PDMS בול (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10:01 על ידי שרף משקל: תערובת של hardener Sylgard 182 (PDMS) ו מכסות לחלוטין את המאסטר (רקיק photopatterned) עם התערובת בצלחת פטרי הפנויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> De-הגז PDMS מכוסה שני dessicator ואקום עד בועות לא נראים ולאפשר הבול לרפא בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 1.5 ח לפני ריפוי, חשוב לוודא המאסטר הוא בתחתית המנה כפי שהוא עשוי לעלות אל פני השטח במהלך שלב דה בגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את PDMS בול מתוך המאסטר וקוצצים לגודל המתאים. חנות בולים במיכל מכוסה (צד תכונה למעלה) כדי להגן עליו מפני אבק ופסולת. </li></ol> 3. הכנת המצע זהב Patterned (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 25 מ&quot;מ לא. 1 כוס coverslips עגול בתצהיר מתכת ידי התייחסות אליהם פלזמה חמצן עבור 10 מ &#39; לשטוף עם מים פעמיים 18.2 deionized MΩ ואחריו פעמיים עם אתנול, ייבוש עם זרם של גז 2 N בין כל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות כיס רב אלומת אלקטרונים במערכת בתצהיר, בעקבות הפקדת 50 טיטניום ידי זהב 150. אל האוורור המאייד בין בתצהיר של שכבת טיטניום שכבת זהב. לחילופין, מצופה זהב coverslips ניתן לרכוש ממגוון רחב של ספקים, עם זאת, חשוב כי שכבות המתכת מוכנים על ידי אידוי קרן אלקטרונים והתאיידות לא תרמית. אם נרכשו ממקור חיצוני, מצעים זהב ניתן לנקות על ידי חמצון פלזמה או &quot;Piranha&quot; (07:03 קונצרט כלשהו H 2 SO 4:. 30% H 2 O 2), 11 לפני השימוש. </li></ol> הערה: &quot;Piranha&quot; הפתרון הוא נפץ בנוכחותם של תרכובות אורגניות. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון ביול, 10 hexadecanethiol מ&quot;מ אתנול מוחלט, והפתרון למלא את משבצות, 1 mM גליקול, הסתיים תיאול באתנול מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את חותמת עם אתנול יבש ביסודיות עם הגז N 2. החל ביול פתרון dropwise חותמת PDMS עד מצופה לחלוטין. יבש ביסודיות עם חותמת הגז N 2. המשך 5a או 5b כנדרש על פי התכונות של הבול PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בעדינות את החותמת על גבי מצע הזהב לאפשר monolayer כדי ליצור עבור 15 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המצע זהב לתוך צלחת פטרי המכילה 18.2 מים deionized MΩ, להבטיח את המצע הוא שקוע. לחץ בעדינות את החותמת על גבי מצע הזהב לאפשר monolayer כדי ליצור עבור 15 s. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המצע חותמת פעמיים עם אתנול, ייבוש בגז 2 N אחרי כל לשטוף את המקום המצע בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את המצע למלא את משבצות עם פתרון חותם את המנה עם parafilm על מנת למנוע אידוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר monolayer הרקע טופס בחושך במשך 12-14 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip בדוגמת מפתרון למלא את משבצות ולשטוף פעמיים עם אתנול, ייבוש בגז 2 N אחרי כל שטיפה. </li></ol> 4. מריחת חלבון תאים למצע Patterned <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslip בדוגמת בצלחת פטרי קטנה או התרבות תא תא ומכסים μL 500-1 מ&quot;ל של פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS). DPBS חייבת לכסות לחלוטין את המצע במהלך הדגירה חלבון כדי להבטיח כיסוי גם חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון מרוכז של חלבון על DPBS ומערבבים את הפתרון על ידי צינורהטבעת מספר פעמים. דגירה את תערובת החלבונים עם המצע על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 ח ריכוזים הסופי עבור laminin ו פיברונקטין הם בדרך כלל 12 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בהתאמה. חלבון יכול להיות מתויג עם צבע אמין פלורסנט תגובתי על מנת לאפשר ראיה דפוס קל. עם זאת, חלבון הנקרא צריכה להיות מעורבת 01:01 עם חלבון ללא תווית תיוג כמו חלבון יכול להפריע הפעילות הביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשטוף את המצע ביסודיות עם DPBS (4-5x) כדי להסיר חלבון מאוגד, נזהרת שלא לייבש את המצע או להעבירה דרך ממשק האוויר והמים. לאחר שלוש שטיפות הראשונה, להוסיף כ 500 μL של התקשורת צמיחה להשלים התא כדי לשמור על מצע רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיה צמיחה בשימוש כדי לשטוף את המצע עם מדיה חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק לספור תאים ציפוי על גבי המצע. תאים או העיקרי ניתק, כגון נוירונים בהיפוקמפוס, או שורות תאים הנציח, כגון CHO-K1 תאים, יכול להיות מנוצל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים על גבי מצע מנותק. בדרך כלל 30-200 תאים / מ&quot;מ 2 משמשים. </li></ol> 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סכמטית כללי להכנת photolithographic של אמן בדוגמת. בתהליך זה, פרוסות סיליקון הוא לנקות עם אצטון, מצופה photoresist, נחשף דפוס של עניין, ואת תבנית מפותחת. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. הכללי סכמטית להכנת חותמת PDMS. בתהליך זה, המתאר בדוגמת מכוסה Sylgard (10:01 שרף: hardener), דה בגז בתוך תא ייבוש ואקום, נרפא בתנור ב 60 ° C, לחתוך לגודל. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. סכמטית הכללי דפוסים המצע. בתהליך זה, מצעים זכוכית מצופה טיטניום (50Å) וזהב (150Å) באמצעות המאייד אלומת אלקטרונים, בדוגמת ידי hexadecanethiol microcontact הדפסה באמצעות חותמת PDMS, backfilled עם thiols גליקול הסתיים alkane, ומצופה חלבון fluorescently שכותרתו. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. Patterned אב (א) ו PDMS בול (ב) מוכן בשיטות שתוארו. ברים סולם הם 100μm. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. סאמס Patterned דמיינו עם AlexaFluor 647 שכותרתו פיברונקטין (א) ו CHO-K1 הכליאה תא (B). ברים הם סולם 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="איור 6"/> איור 6. Patterned laminin seeded עם E18 נוירונים בהיפוקמפוס העכבר על 4 ימים במבחנה. AlexaFluor 350-מצומדות אנטי laminin הנוגדן משמש להדמיה דפוס (א) ו E18 נוירונים בהיפוקמפוס העכבר מגואלות MitoTracker האדום 580 (ב). ברים הם סולם 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="איור 7"/> איור 7. בעיות פוטנציאליות כהכנה המצע בדוגמת דמיינו ידי AlexaFluor 647-מצומדות פיברונקטין ספיחה. (א) מוביל ערבוב מספיק לחלבון ספיחה אחידה. (ב) בקשה לא אחידה של לחץ במהלך הטבעה מוביל להעברת פאטן חלקית. (ג) יתר לחץ במהלך הטבעה יכול להוביל חותמת קריסה. (ד) חשיפה של פני השטח בדוגמת לממשק מים באוויר במהלך השטיפה עלולה לגרום חלבון רקע ספיחה. ברים הם סולם 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="איור 8"/> איור 8. דפוסים שקוע יכול לייצר דפוסי קטן עם תכונות שקשה ההדפסה על ידי הדפסה microcontact קונבנציונאלי באוויר. תמונות (א) ו - (ב) להראות באזורים שונים של אותו דפוס, מודפס עם חותמת PDMS אותו באוויר (א) או מים deionized (B). 10μm רחב קווי תמיכה המקיפים את התבנית (נוסף כדי למנוע התמוטטות חותמת) נראים (A), לעומת זאת, תכונות נקודה קטן יותר כפי שמוצג (ב) לא נתפסים. זה מוכיח כי דפוס באוויר עובד היטב עבור תכונות גדולים יותר, אך הדפסה במים עשוי להיות נחוץ עבור דפוסים עם תכונות יותר. ברים סולם הם 20 מיקרומטר. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מחזור </td><td> האצת קצב (סל&quot;ד / s) </td><td> מהירות סופית (סל&quot;ד) </td><td> זמן (s) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 500 </td><td> 1000 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3800 </td><td> 3800 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> טבלה 1.שני מחזור תוכנית ספין השתמשו כדי ליצור ציפוי עבה של 4.5 מיקרומטר AZ9245 על פרוסות סיליקון. כדי להכין חותמות PDMS להקמת בדוגמת מצעים, שני photoresist הוא מפוברק הראשונה (איורים 1 ו - 4 א). האדון הוא ההופכי של חותמת, והוא נוצר באמצעות מערכת או ישיר לכתוב ליתוגרפיה או aligner המסכה. כאשר photoresist חיוביים, כגון AZ9245, משמש לייצור אב, רקיק להתנגד מצופה נחשף לאור עם אותו דפוס שיופיע על פני המצע הסופי. אמנם זה לא תמיד אפשרי, זה כבר דווח כי יחס אידיאלי (גודל תכונה להתנגד עובי) על אדונים חותמת PDMS היא 01:02. 13 מצאנו כי היבט ratios של 01:40 הם אפשריים, בהתאם לאופי דפוס. AZ9245 פרוסות סיליקון מצופה בתנאים שתוארו כאן לתת photoresist בעובי נומינלי של 4.5 מיקרומטר. מצאנו כי זה עובי AZ9245 ניתן להשתמש כדי לייצר אדונים PDMS עם תכונות, החל&gt; 100 מיקרומטר עד 2 מיקרומטר. בולים PDMS נוצקו מתוך Sylgard 182 (או 184 Sylgard) באמצעות האב מפוברק בין photoresist (איור 2). אדונים photoresist ניתן להשתמש מספר פעמים כדי ליצור עותקים רבים של בול אותו דבר. לאחר התקשות PDMS, בולים יוסרו מן האדון באמצעות סכין גילוח ואת חותמת וכתוצאה מכך ניתן דמיינו תחת מיקרוסקופ על ידי הצבת תכונה בצד חותמת על coverslip זכוכית (איור 4B) תוצאות ביול פרופר בדפוס, חד חלבון ברור כי ניתן דמיינו ידי יישום של חלבון שכותרתו fluorescently (איורים 3 ו -5). לחלופין, אימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש כדי להמחיש את דפוס החלבון לאחר קיבוע תא (איור 6). צמיחת תאים מוגבל גם לדפוס חלבון הן שורות תאים ו הנציח תאים ראשוניים (איורים 5, 6). בעוד טכניקה זו היא לשלוט בקלות, כמה בעיות נפוצות שעלולות להתעורר. היישום של חלבון ללא ערבוב מספקת פתרון החלבון מרוכזים DPBS יכול להוביל דפוסי חלבון אחידים (7 א &#39;איור). ביול לא נכון עלול להוביל להעברת דפוס חלקי או התמוטטות בול (איור 7 ב-C). בנוסף, לחשוף את המצע בדוגמת המכילים חלבון adsorbed לאוויר יכולים לשבש את monolayer גרימת התנגדות ירד ברקע (איור 7D). דפוסי מורכבת תכונות מאוד קטנה (&lt;5 מיקרומטר) ו היבט ratios גבוהה לעתים קרובות דורשים שימוש הדפסה microcontact שקוע. במים הליך זה (3.5b) משמש כמחסום למניעת hexadecanethiol מהפקדת על מצע החיצוני של התבנית (איור 8). 14

<ol>
	<li>Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers:+Applications+in+microfabrication.">Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication.</a> Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).</li><li>Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+microstamping+technique+enhances+polylysine+transfer+and+neuronal+cell+patterning.">A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning.</a> Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).</li><li>Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+DNA+molecules.">Microcontact printing of DNA molecules.</a> Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).</li><li>Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+octadecylsiloxane+on+the+surface+of+silicon+dioxide+and+its+application+in+microfabrication.">Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication.</a> J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).</li><li>Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+proteins+onto+surfaces+containing+end-attached+oligo(ethylene+oxide)+-+a+model+system+using+self-assembled+monolayers.">Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) - a model system using self-assembled monolayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).</li><li>Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+Dynamically+Adhesive+Substrates+for+Cell+Migration.">Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration.</a> Langmuir. , 17733-17738 (2010).</li><li>Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-like+electronic+displays:+Large-area+rubber-stamped+plastic+sheets+of+electronics+and+microencapsulated+electrophoretic+inks.">Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).</li><li>Yanker, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+printing+of+trichlorosilanes+on+glass+for+selective+protein+adsorption+and+cell+growth.">Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth.</a> Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).</li><li>Johnson, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+and+reusing+patterned+self-assembled+monolayers+for+cell+culture.">Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture.</a> Chemical Communications. , 520-522 (2011).</li><li>Herne, T., Tarlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+DNA+probes+immobilized+on+gold+surfaces.">Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).</li><li>Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+self-assembled,+compact+organophosphonate+monolayers+to+the+native+oxide+surface+of+silicon.">Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon.</a> J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).</li><li>Johannes, M., Cole, D., Clark, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+based+nanofabrication+of+master+pattern+molds+for+use+in+soft+lithography.">Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography.</a> Applied Physics Letters. , (2007).</li><li>Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submerged+microcontact+printing+(S&#x03BC;CP):+An+unconventional+printing+technique+of+thiols+using+high+aspect+ratio,+elastomeric+stamps.">Submerged microcontact printing (S&#x03BC;CP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps.</a> Langmuir. , 12060-12063 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+microcontact+printing+as+a+microlithographic+technique.">Extending microcontact printing as a microlithographic technique.</a> Langmuir. , 2059-2067 (1997).</li><li>Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+microcontact-printed+proteins+by+atomic+force+miroscopy+molecular+sizing.">Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing.</a> Langmuir. , 5154-5158 (2005).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+proteins+for+cell+biology.">Microcontact printing of proteins for cell biology.</a> J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).</li><li>Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-pen"+nanolithography.">"Dip-pen" nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+multiple+aligned+self-assembled+monolayers+using+light.">Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light.</a> Langmuir. , 9080-9088 (2004).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מספר בעיות עלולות להתעורר בהפקת ליתוגרפיות של האמן משמש ליצירת חותמת PDMS. Underexposure של להתנגד מצופה תוצאות רקיק בדפוסי מעורפל ולא ברור וגם חשיפה של להתנגד מצופה תוצאות רקיק תכונות מוגדלים או חסר. באופן כללי, עם אדונים גדלים תכונה גדולה (&gt; 10 מיקרומטר) קל יחסית לפתח דפוס, בעוד האדונים עם תכונות קטן יכול לדרוש אופטימיזציה רב של פרמטרים photopatterning ופיתוח (מעבר לפרמטרים המומלץ על ידי היצרן photoresist). המאסטרים הכי קשה לייצר לשלב את שתי התכונות גדולים וקטנים. המצאה של חותמת PDMS ממורה היא פשוטה באמצעות ההליך המתואר בסעיף 2. עם זאת, יש להקפיד לחלוטין לערבב את שני המרכיבים של Sylgard 182. כישלון להשיג ערבוב מוחלט של הרכיבים תגרום חוסר יכולת הבול להקשיח והרס סביר של המאסטר. בנוסף, הורים עשויים לנפץ כאשר הפרידה בינו לבין חותמת PDMS אם כוח עודף משמש או פיתול מתרחשת במהלך ההפרדה. אם המורה עושה הפסקה בתהליך של הסרת חותמת, הוא עדיין עשוי להיות אפשרי להשתמש חותמת לאחר ניקוי עם אתנול. עם זאת, חותמת זו עשויה לייצר דפוסים עם אתרי פגם. בעוד הדפסה microcontact של סאמס באמצעות חותמת PDMS הוא תכליתי עשוי להיות שימושי ביישומים רבים, בשורה של צעדים חיוניים חייב להיות אחריו על מנת להשיג חלבון מוצלח תא הכליאה. כדי לקבל חלבון טוב כליאה בתא, מצעים זהב חייב להיות מוכן על ידי קרן אלקטרונים בתצהיר, שכן אידוי תרמי מוביל משטחי זהב גלם שאינם תומכים היווצרות monolayer הנכון. יתר על כן, מצאנו כי איך מצע זכוכית ערוכה בתצהיר טיטניום וזהב גם משפיע על איכות המצע זהב ויציבות monolayer. בעוד מצעים זכוכית ניתן לנקות להפקדה תוך שימוש במגוון רחב של טכניקות, לרבות מתנול רותחים, &quot;Piranha&quot;, 11 ו - &quot;עיט&quot; הפתרון, 12 בידינו coverslips שהוכן על ידי חמצון פלזמה עדיפים בהרבה על coverslips לנקות בשיטות אחרות. ראינו כי שיטות ניקוי חומצה ממס, ועל בסיס מבוססי לתת monolayers עם יציבות טמפורלית ירד ומספר גדל של אתרי פגם. טכניקת הטבעה המדויק הנדרש כדי לייצר חלבון אופטימלי ודפוסי הסלולר משתנה בהתאם לגודל ולצורה של התכונות להיות חותמת יחס של הבול. בדרך כלל, טכניקת הטבעה המדויק עבור כל חותמת חדשה חייבת להיות אופטימיזציה טכניקת הטבעה משפר לאחר מספר ניסויים. החלת יותר מדי לחץ במהלך הטבעה תוביל חותמת התמוטטות, אשר נוטה לקרות עם בולים המכיל היבט ratios גדול (איור 7C). לחלופין, החלת תוצאות הלחץ מעט מדי בהעברת דפוס חלקית (איור 7 ב). אפשר גם לנצל את טכניקת הטבעה מעט כדי לשנות את התכונות של הדפוס. לדוגמה, מצאנו כי התכונות ניתן להגדיל מעט ע&quot;י הטבעה עבור תקופות זמן ארוכות יותר ואחרים בגודל דיווחו כי ממדי תכונות מסוימות ניתן להפחית באמצעות שקוע טכניקות הדפסה microcontact. 15 לעתים קרובות להיות בועות אוויר שנלכדו מתחת הבול כאשר ביצוע הטבעה שקוע, אולם שיטה זו עשויה לתת את התוצאות הטובות ביותר כאשר תכונות קטן יחד עם היבט ratios גדולים הרצוי. ישנם יתרונות רבים לשימוש הדפסה microcontact בשילוב עם כימיה עצמית התאספו monolayer. כאשר חלבונים הדפסה ישירות על גבי מצעים, שינויי קונפורמציה הוכחו להתרחש 16 המיוחס לשלב שבו חלבונים מיובשים בתהליך הטבעה. צעד זה יבוש הוא חשב להוביל להצטברות חלבונים denaturation, אשר בתורו משפיע על תפקוד החלבון. במערכת SAM, חלבונים לספוג למצע מתמיסה מימית שנאגרו, זהה איך מצעים מוכנים בדרך כלל התרבות התאים. בנוסף, הדפסה microcontact של חלבונים לא להשיג ריתוק תא לפרקי זמן, בשל היעדר של מולקולות חלבון עמיד רקע. 17 לעומת זאת, השימוש monolayer רקע גליקול מספק הכליאה מעולה. 5 במקרים בהם השימוש על מצע זהב הוא או אינו אפשרי או רצוי, מונומרים trichlorosilane יכול להיות מנוצל במקום כדי לאפשר כליאה חלבונים בתא. 9 אמנם יש שיטות הכליאה של חלבונים בתאים שאינם מסתמכים על הדפסה microcontact, שיטות אלה נוטים להיות העבודה יותר אינטנסיבית לא מקובל לייצר את כמויות גדולות של מצעים זהים נדרש בדרך כלל למחקרים ביולוגיים. 18,19

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> פרוסות הסיליקון </td><td> ופלה לתבוע שירותים </td><td></td><td> 2 אינטש </td></tr><tr><td> ספין coater / פלטה </td><td> ברואר המדע </td><td> Cee 200CB ספין אופים מערכת </td><td></td></tr><tr><td> AZ9245 photoresist </td><td> מייז כימיקלים </td><td> 105880034-1160 </td><td></td></tr><tr><td> ישיר לכתוב photolithography מערכת </td><td> Microtech srl </td><td> LW325 LaserWriter מערכת </td><td></td></tr><tr><td> מסכת Aligner </td><td> HTG </td><td> 3HR </td><td></td></tr><tr><td> AZ מפתחים 400K </td><td> מייז כימיקלים </td><td> 105880018-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard סיליקון 182 אלסטומר Kit </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> לא 25 מ&quot;מ. 1 כוס coverslips עגול </td><td> VWR </td><td> 16004-310 </td><td></td></tr><tr><td> פלזמה מחמצן </td><td> דינר </td><td> Femto </td><td></td></tr><tr><td> טיטניום חתיכות Kamis </td><td> Incorporated </td><td></td><td> 99.95% טהור </td></tr><tr><td> כדורי זהב </td><td> Kamis Incorporated </td><td></td><td> 99.999% טהור </td></tr><tr><td> אלומת אלקטרונים המאייד </td><td> קורט ג&#39;Lesker </td><td> PVD 75 סרט דק הפקדת מערכת </td><td> עם אביזר קרן אלקטרונים </td></tr><tr><td> Hexadecanethiol </td><td> אלפא Aesar </td><td> A11362 </td><td></td></tr><tr><td> 1-mercaptoundec-11-י.ל.) טטרה (ethyleneglycol) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 674508 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111000200 </td><td> 200 הוכחה מוחלטת </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> VWR </td><td> 4500-434 </td><td> ללא סידן ומגנזיום </td></tr><tr><td> עכבר Laminin אני </td><td> VWR </td><td> 95036-762 </td><td></td></tr><tr><td> האדם פלזמה פיברונקטין </td><td> Invitrogen </td><td> 33016-015 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 647 חומצה carboxylic, succinimidyl אסתר </td><td> Invitrogen </td><td> A-20006 </td><td></td></tr><tr><td> MitoTracker האדום 580 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 350 חומצה carboxylic, אסתר succinimidyl </td><td> Invitrogen </td><td> A-10168 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-laminin נוגדן </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> AB2034MI </td><td></td></tr></tbody></table>

creating two-dimensional patterned substrates for protein and cell confinement

הדפסה Microcontact מספק שיטה מהירה, לשעתקו מאוד ליצירת מוגדרים היטב מצעים בדוגמת. 1 בזמן ההדפסה microcontact יכול להיות מועסק ישירות להדפיס מספר גדול של מולקולות, כולל חלבונים, DNA 2, 3 ו silanes, 4 היווצרות עצמית , התאספו monolayers (Sams) מ ארוך alkane thiols על שרשרת זהב מספק דרך פשוטה להגביל חלבונים בתאים דפוסים מסוימים המכיל אזורים דבק עמיד. ריתוק זה יכול לשמש כדי לשלוט מורפולוגיה תאים שימושי לבחינת מגוון של שאלות בחלבון ביולוגיה של התא. כאן אנו מתארים שיטה כללית ליצירת מוגדרים היטב דפוסי חלבון ללימודי הסלולר 5 תהליך זה כולל שלושה שלבים:. הייצור של מאסטר בדוגמת באמצעות photolithography, יצירת בול PDMS, ו microcontact הדפסה של זהב מצופה המצע. בדוגמת פעם, אלה תרבות מצעים תאים המסוגלים חלבונים כליאת ו / או תאים (תאים ראשוניים או שורות תאים) לדפוס. השימוש כימיה עצמית התאספו monolayer מאפשר שליטה מדויקת את החלבון / תא אזורים בדוגמת דבק ולא דבק אזורים; זו לא יכולה להיות מושגת באמצעות הטבעה חלבון ישיר. Hexadecanethiol, בשרשרת ארוכה alkane תיאול בשימוש בשלב ההדפסה microcontact, מייצרת משטח הידרופובי כי בקלות adsorbs חלבון מן הפתרון. גליקול, הסתיים תיאול, המשמש למלא את משבצות הלא מודפס אזורים של המצע, יוצר monolayer כי הוא עמיד חלבון ספיחה של התא ולכן הצמיחה. 6 אלה מונומרים תיאול לייצר monolayers מובנים מאוד שדווקא להגדיר אזורים של המצע שיכולים לתמוך חלבון ספיחה וצמיחה התא. כתוצאה מכך, מצעים אלה הם שימושיים עבור מגוון רחב של יישומים ממחקר של התנהגות אינטר 7 ליצירת המיקרואלקטרוניקה. 8 בעוד סוגים אחרים של כימיה monolayer שימשו לימודי תרבות התא, כולל עבודה מהקבוצה שלנו באמצעות trichlorosilanes ליצור דפוסים ישירות על מצעים זכוכית, 9 monolayers בדוגמת נוצר thiols alkane על זהב הם ישר קדימה להכין. יתר על כן, מונומרים משמש להכנת monolayer זמינים מסחרית, יציבה, ואינם דורשים טיפול או אחסון תחת אווירה אינרטי. מצעים בדוגמת שהוכן thiols alkane ניתן למחזר ולעשות בהם שימוש חוזר מספר פעמים, תוך שמירה על תא הכליאה 10.

Watch this Scientific Journal Video about Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement at JoVE.com

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

עצמית התאספו monolayers (Sams) נוצר זמן alkane thiols על שרשרת זהב לספק מוגדרים היטב מצעים ליצירת דפוסי חלבון תא הכליאה. הדפסה Microcontact של hexadecanethiol באמצעות חותמת (PDMS) polydimethylsiloxane ואחריו למלא את משבצות עם גליקול, הסתיים alkane תיאול מונומר מייצר דפוס שבו חלבונים בתאים לספוג רק לאזור hexadecanethiol חותמת.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

creating-two-dimensional-patterned-substrates-for-protein-cell

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Views.  Washington University in St. Louis. עצמית התאספו monolayers (Sams) נוצר זמן alkane thiols על שרשרת זהב לספק מוגדרים היטב מצעים ליצירת דפוסי חלבון תא הכליאה. הדפסה Microcontact של hexadecanethiol באמצעות חותמת (PDMS) polydimethylsiloxane ואחריו למלא את משבצות עם גליקול, הסתיים alkane תיאול מונומר מייצר דפוס שבו חלבונים בתאים לספוג רק לאזור h...

Video: Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

תא דפוסים על photolithographically מוגדר Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; מצעים

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

הרחבת טכניקת תפר באמצעות מצעי nanopatterned עבור Nanotopographical אפנון של התנהגות תא

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

הערכת תקין התפשטות על שניים - שלושה ממדי מסוג קולגן מצעים

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

הקמת הגיאומטריה של האדם תא גזע עובריים המושבות על מצעים תואמי כדי לשלוט במכניקה ברמת רקמות

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...