Nos gustaría agradecer a todo el grupo de Maurer en la Universidad de Washington, cuyo conocimiento colectivo ha hecho posible este protocolo. La financiación de este trabajo es proporcionado por el Instituto Nacional de Salud Mental (1R01MH085495).

1. Preparación del Maestro patrones (Figura 1) <ol><li> El centro de la oblea de silicio en el spin-aplicador y enjuagar la lámina con acetona durante la fase inicial del programa de rotación de dos ciclos en la Tabla 1. La acetona se evapora durante la segunda etapa del programa spin dejando una hostia limpia y seca. </li><li> Aplicar aproximadamente 1 ml AZ9245 fotosensible / a (de diámetro) para el pan y el giro escudo con las condiciones descritas en la Tabla 1. </li><li> Soft-hornear la oblea fotosensible recubierto a 110 º C durante 2 m con una placa de alta uniformidad. </li><li> Photopattern el sustrato utilizando un sistema de escritura directa fotolitografía o un sistema alineador de máscara y la máscara adecuada. Las máscaras se pueden comprar en un número de fuentes comerciales. Además, las transparencias impresas con tinta UV absorbentes, pegado a un plano óptico, se puede utilizar para producir modelos con características de gran tamaño. </li><li> Desarrollar la oblea con dibujos en 01:02 400K desarrollador: semi-conductor de agua desionizada de grado de 1 m 45 s con agitación suave. Enjuague bien con agua semi-conductor de grado desionizada y se seca con una corriente de nitrógeno (N 2) de gas. El desarrollo del patrón se puede comprobar con un microscopio con un filtro UV. Si el patrón no está completamente desarrollado, la oblea se puede devolver a la solución de desarrollo de tiempo adicional. </li></ol> Nota: Para obtener mejores resultados, photopatterning debe llevarse a cabo en un entorno limpio. 2. Preparación de PDMS sello (Figura 2) <ol><li> Preparar un 10:1 en peso de resina: mezcla de endurecedor de Sylgard 182 (PDMS) y cubren por completo el maestro (obleas photopatterned) con la mezcla en una placa de Petri desechables. </li><li> De gas-el PDMS-cubierta principal en un desecador de vacío hasta que no se ven burbujas y permitir que el sello de curar en un horno a 65 ° C durante 1,5 h. Antes del curado, es importante asegurarse de que el maestro está en el fondo del plato, ya que puede subir a la superficie durante el paso de desgasificación. </li><li> Cortar el PDMS sello del maestro y el ajuste al tamaño adecuado. Tienda de la marca en un recipiente con tapa (lado característica arriba) para protegerlo del polvo y los escombros. </li></ol> 3. Preparación del sustrato de oro con dibujos (Figura 3) <ol><li> Prepare 25 mm no. Un cubreobjetos de vidrio redondas para la deposición de metales mediante el tratamiento con plasma de oxígeno de 10 m. Aclarar dos veces con agua 18,2 mW desionizada seguido por dos veces con etanol, secar con una corriente de N 2 gas entre cada paso. </li><li> El uso de un bolsillo multi-haz de electrones del sistema de depósito, depósito de 50 Å de titanio seguido por 150 de oro Å. No ventile el evaporador entre la deposición de la capa de titanio y una capa de oro. Por otra parte, recubierto de oro cubreobjetos se pueden comprar en una variedad de proveedores, sin embargo, es importante que las capas de metal son preparadas por evaporación por haz de electrones y evaporación térmica no. Si se compran desde una fuente externa, los sustratos de oro se puede limpiar por la oxidación de plasma o &quot;piraña&quot; (07:03 Conc. H 2 SO 4:. 30% H 2 O 2) 11 antes de su uso. </li></ol> Nota: &quot;Piraña&quot; La solución es explosivo en la presencia de compuestos orgánicos. <ol start="3"><li> Prepare la solución de sellado, 10 hexadecanethiol mM en etanol absoluto, y la solución de relleno, 1 mM de glicol terminado tiol en etanol absoluto. </li><li> Enjuague el sello con etanol y secar bien con gas N 2. Aplicar estampado solución al gota a gota sello PDMS hasta que esté completamente cubierto. Seque el sello de fondo con N 2 gas. Proceder a la 5a o 5b en su caso sobre la base de las características de la marca de PDMS. </li><li><ol class="lalpha"><li> Presione suavemente el sello sobre el sustrato de oro y permitir que la monocapa para formar a 15 s. </li><li> Coloque el sustrato de oro en una placa de Petri que contiene 18,2 mW agua desionizada, asegurando el sustrato se sumerge. Presione suavemente el sello sobre el sustrato de oro y permitir que la monocapa para formar a 15 s. </li></ol></li><li> Enjuagar el sustrato sellada dos veces con etanol, secado con N 2 gas después de cada lavado y el lugar del sustrato en una placa de Petri. </li><li> Cubrir la superficie con una solución de relleno y sellado de la placa con parafilm para evitar la evaporación. </li><li> Deje que la monocapa de fondo a la forma en la oscuridad durante 12-14 h. </li><li> Quitar los cubreobjetos con dibujos de la solución de relleno y enjuague dos veces con etanol, secado con N 2 gas después de cada lavado. </li></ol> 4. La aplicación de proteínas y células al sustrato con dibujos <ol><li> Coloque el cubreobjetos con dibujos en una pequeña placa de Petri o cámara de cultivo celular y la tapa con 500 l de 1 ml de fosfato de Dulbecco solución salina tamponada (DPBS). El DPBS debe cubrir completamente el sustrato durante la incubación de proteínas para asegurar una cobertura uniforme de proteínas. </li><li> Añadir una solución concentrada de proteína a la DPBS y mezclar la solución por tuberíating varias veces. Incubar la mezcla de proteínas con el sustrato a 37 ° C durante 1 h. Las concentraciones finales de laminina y fibronectina son generalmente de 12 mg / ml y 20 mg / ml, respectivamente. Las proteínas pueden ser marcadas con un colorante fluorescente amina reactiva para permitir la visualización fácil del patrón. Sin embargo, la proteína marcada se debe mezclar 1:1 con proteínas sin etiquetar como el etiquetado de proteínas puede interferir con la actividad biológica. </li><li> Después de la incubación, lavar bien el sustrato con DPBS (4-5x) para eliminar la proteína no consolidados, teniendo cuidado de que no se seque el sustrato o para hacer que a través de la interfase aire-agua. Después de los primeros tres lavados, agregar aproximadamente 500 l de los medios de comunicación completa crecimiento de las células para mantener un sustrato húmedo. </li><li> Vuelva a colocar el medio de cultivo utilizado para lavar la superficie con medio fresco. </li><li> Se disocian y el recuento de las células de revestimiento sobre el sustrato. Cualquiera de las células disociadas primarios, tales como las neuronas del hipocampo, o líneas celulares inmortalizadas, tales como células CHO-K1, se puede utilizar. </li><li> Placa de disociar las células sobre el sustrato. Normalmente de 30 a 200 células / mm 2 se utilizan. </li></ol> 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquema general para la preparación de fotolitografía de un maestro de modelado. En este proceso, una oblea de silicio se limpia con acetona, recubierto con fotosensible, expuesta a los patrones de interés y el modelo desarrollado. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Esquema general para la preparación del sello de PDMS. En este proceso, el maestro de modelado se cubre con Sylgard (10:01 resina: endurecedor), de-cámaras de gas en un secador de vacío, curado en un horno a 60 ° C, y cortar a medida. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Esquema general de los patrones del sustrato. En este proceso, sustratos de vidrio están recubiertas con titanio (50 bis) y oro (150A) con un cañón de haz de electrones, modelado por hexadecanethiol microcontacto impresión con un sello de PDMS, rellenar con glicol terminado tioles alcano, y recubiertas con proteína fluorescente marcado. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Patrones maestro (A) y el sello PDMS (B), preparado según los métodos descritos. Las barras de escala son 100μm. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. SAMs con dibujos visualiza con AlexaFluor 647 marcado con fibronectina (A) y CHO-K1 confinamiento celular (B). Las barras de escala son 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Patrones laminina sembrado con E18 neuronas del hipocampo del ratón a los 4 días in vitro. AlexaFluor 350-conjugado anti-laminina anticuerpos se utiliza para la visualización de patrones (A) y E18 neuronas del hipocampo del ratón están manchadas con MitoTracker Red 580 (B). Las barras de escala son 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. Escollos potenciales en la preparación del sustrato patrón visualizado por AlexaFluor 647-conjugado de fibronectina adsorción. (A) lleva insuficiente mezcla de proteínas desigual adsorción. (B) la aplicación desigual de la presión durante la estampación conduce a la transferencia parcial de Patten. (C) El exceso de presión durante la estampación puede llevar a la marca de colapso. (D) La exposición de la superficie modelada a la interfaz de aire y agua durante el enjuague puede dar lugar a proteínas de fondo de adsorción. Las barras de escala son 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8. Patrón sumergidas pueden producir patrones con pequeños detalles que son difíciles de impresión mediante la impresión de microcontacto convencionales en el aire. Imágenes (A) y (B) muestran las diferentes regiones de un mismo patrón, impresas con el mismo sello PDMS en el aire (A) o agua destilada (B). 10μm en toda las líneas de apoyo que rodean el patrón (añadido para ayudar a evitar el colapso de timbre) se ve en (A), sin embargo, las características de puntos pequeños, como se muestra en (B) no se ven. Esto demuestra que la impresión en el aire funciona bien para las grandes características, pero la impresión en el agua puede ser necesario para los patrones con características más pequeñas. Las barras de escala de 20 micras. <table border="1"><tbody><tr><td> Ciclo </td><td> Velocidad de aceleración (rpm / s) </td><td> Velocidad final (rpm) </td><td> Tiempo (s) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 500 </td><td> 1000 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3800 </td><td> 3800 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tabla 1.Dos ciclos del programa spin utiliza para crear una capa de 4,5 micras de espesor de AZ9245 sobre una oblea de silicio. Para preparar sellos PDMS para la formación de patrones sustratos, un maestro en fotosensible es el primero fabricado (Figuras 1 y 4A). El maestro es el inverso de la marca y se crea utilizando un sistema de escritura directa en la litografía o un alineador de la máscara. Cuando un fotoprotector positivo, como AZ9245, se utiliza para el maestro de producción, la oblea de resistencia con recubrimiento es expuesto a la luz con el mismo patrón que aparecerá en el sustrato final. Aunque no siempre es posible, se ha informado de que la relación de aspecto ideal (tamaño de la característica de resistir espesor) para maestros sello PDMS es de 1:2. 13 Hemos encontrado que las relaciones de aspecto de 01:40 son posibles, dependiendo de la naturaleza del patrón. AZ9245 obleas de silicio recubierto en las condiciones descritas aquí dar fotosensible con un espesor nominal de 4,5 micras. Hemos encontrado que este espesor de AZ9245 se pueden utilizar para producir maestros PDMS con características que van desde&gt; 100 mm a 2 micras. PDMS sellos se echan de Sylgard 182 (o Sylgard 184) con el maestro fabricados a partir de fotosensible (Figura 2). Maestros fotosensible puede ser utilizado varias veces para crear muchas copias de la misma calaña. Después del endurecimiento del PDMS, sellos se retiran de la maestra con una cuchilla de afeitar y el sello resultante puede visualizarse con un microscopio mediante la colocación de lado el sello hacia abajo en función de un cubreobjetos (Figura 4) Adecuada los resultados de estampado en un patrón agudo, proteínas claro que se puede visualizar mediante la aplicación de la proteína marcada con fluorescencia (Figuras 3 y 5). Por otra parte, la inmunohistoquímica puede ser utilizado para visualizar el patrón de proteínas después de la fijación de células (Figura 6). Crecimiento de las células es muy limitada con el patrón de proteínas de las dos líneas de células inmortalizadas y células primarias (figuras 5 y 6). Si bien esta técnica es fácil de dominar, varios problemas comunes puedan surgir. La aplicación de la proteína sin mezcla suficiente de la solución concentrada de proteínas en el DPBS puede llevar a la desigual distribución de las proteínas (Figura 7). Sellado incorrecto puede llevar a la transferencia parcial o patrón de colapso de timbre (Figura 7B-C). Además, la exposición de dibujos que contiene el sustrato de la proteína adsorbida en el aire puede afectar la monocapa causando disminución de la resistencia en el fondo (Figura 7D). Patrones compone de características muy pequeña (&lt;5 micras) y altas tasas de aspecto a menudo requieren el uso de la impresión por microcontacto sumergido. En este procedimiento (3.5b) se utiliza el agua como una barrera para evitar que se deposite hexadecanethiol sobre el sustrato fuera del patrón (Figura 8). 14

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	<li>Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers:+Applications+in+microfabrication.">Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication.</a> Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).</li><li>Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+microstamping+technique+enhances+polylysine+transfer+and+neuronal+cell+patterning.">A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning.</a> Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).</li><li>Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+DNA+molecules.">Microcontact printing of DNA molecules.</a> Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).</li><li>Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+octadecylsiloxane+on+the+surface+of+silicon+dioxide+and+its+application+in+microfabrication.">Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication.</a> J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).</li><li>Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+proteins+onto+surfaces+containing+end-attached+oligo(ethylene+oxide)+-+a+model+system+using+self-assembled+monolayers.">Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) - a model system using self-assembled monolayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).</li><li>Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+Dynamically+Adhesive+Substrates+for+Cell+Migration.">Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration.</a> Langmuir. , 17733-17738 (2010).</li><li>Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-like+electronic+displays:+Large-area+rubber-stamped+plastic+sheets+of+electronics+and+microencapsulated+electrophoretic+inks.">Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).</li><li>Yanker, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+printing+of+trichlorosilanes+on+glass+for+selective+protein+adsorption+and+cell+growth.">Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth.</a> Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).</li><li>Johnson, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+and+reusing+patterned+self-assembled+monolayers+for+cell+culture.">Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture.</a> Chemical Communications. , 520-522 (2011).</li><li>Herne, T., Tarlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+DNA+probes+immobilized+on+gold+surfaces.">Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).</li><li>Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+self-assembled,+compact+organophosphonate+monolayers+to+the+native+oxide+surface+of+silicon.">Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon.</a> J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).</li><li>Johannes, M., Cole, D., Clark, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+based+nanofabrication+of+master+pattern+molds+for+use+in+soft+lithography.">Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography.</a> Applied Physics Letters. , (2007).</li><li>Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submerged+microcontact+printing+(S&#x03BC;CP):+An+unconventional+printing+technique+of+thiols+using+high+aspect+ratio,+elastomeric+stamps.">Submerged microcontact printing (S&#x03BC;CP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps.</a> Langmuir. , 12060-12063 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+microcontact+printing+as+a+microlithographic+technique.">Extending microcontact printing as a microlithographic technique.</a> Langmuir. , 2059-2067 (1997).</li><li>Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+microcontact-printed+proteins+by+atomic+force+miroscopy+molecular+sizing.">Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing.</a> Langmuir. , 5154-5158 (2005).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+proteins+for+cell+biology.">Microcontact printing of proteins for cell biology.</a> J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).</li><li>Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-pen"+nanolithography.">"Dip-pen" nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+multiple+aligned+self-assembled+monolayers+using+light.">Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light.</a> Langmuir. , 9080-9088 (2004).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Una serie de cuestiones que pueden surgir en la producción litográfica de la maestra utilizado para la creación de marca de PDMS. Subexposición de los resultados de obleas resistencia con recubrimiento en los patrones de nebuloso y confuso y la sobreexposición de los resultados de obleas resistencia con recubrimiento en las características de ampliación o no. En general, los maestros con tamaños grandes (&gt; 10 mm) son relativamente fáciles de patrón y se desarrollan, mientras que maestros con característica...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> De obleas de silicio </td><td> Wafer Recuperar Servicios </td><td></td><td> 2 pulgada </td></tr><tr><td> Giro aplicador / placa caliente </td><td> Brewer Ciencia </td><td> Cee 200CB spin-Bake sistema </td><td></td></tr><tr><td> AZ9245 fotosensible </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880034-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Escritura directa fotolitografía sistema </td><td> Microtech srl </td><td> LW325 LaserWriter sistema </td><td></td></tr><tr><td> Máscara de alineador </td><td> HTG </td><td> 3h </td><td></td></tr><tr><td> AZ Autor 400K </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880018-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard de silicona 182 Kit de elastómero </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 mm no. Un cubreobjetos de vidrio redondo </td><td> VWR </td><td> 16004-310 </td><td></td></tr><tr><td> Plasma Oxidante </td><td> Diener </td><td> Femto </td><td></td></tr><tr><td> Piezas de titanio Kamis </td><td> Incorporado </td><td></td><td> 99,95% </td></tr><tr><td> Pellets de oro </td><td> Kamis Incorporated </td><td></td><td> 99,999% de pureza </td></tr><tr><td> Haz de electrones del evaporador </td><td> Kurt J. Lesker </td><td> PVD 75 Thin Film sistema de deposición de </td><td> con el accesorio de haz de electrones </td></tr><tr><td> Hexadecanethiol </td><td> Alfa Aesar </td><td> A11362 </td><td></td></tr><tr><td> 1-mercaptoundec-11-il) tetra (etilenglicol) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 674508 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111000200 </td><td> 200 pruebas, absoluta </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> VWR </td><td> 4500-434 </td><td> Sin el calcio y el magnesio </td></tr><tr><td> Ratón laminina I </td><td> VWR </td><td> 95036-762 </td><td></td></tr><tr><td> La fibronectina de plasma humano </td><td> Invitrogen </td><td> 33016-015 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 647 de ácido carboxílico, éster de succinimidilo </td><td> Invitrogen </td><td> A-20006 </td><td></td></tr><tr><td> MitoTracker Red 580 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 350 de ácido carboxílico, éster de succinimidilo </td><td> Invitrogen </td><td> A-10168 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos anti-laminina </td><td> Fisher Scientific </td><td> AB2034MI </td><td></td></tr></tbody></table>

creating two-dimensional patterned substrates for protein and cell confinement

Impresión por microcontacto proporciona un método rápido y altamente reproducible para la creación de sustratos bien definidos patrones. Mientras que una impresión por microcontacto pueden ser empleadas para imprimir directamente a un gran número de moléculas, incluyendo proteínas, DNA 2, 3 y silanos, 4 la formación de uno mismo -ensambladas monocapas (SAM) de largo tioles cadena de alcanos en el oro proporciona una forma sencilla de limitar las proteínas y las células a patrones específicos que contienen las regiones adhesiva y resistente. Esta detención se puede utilizar para controlar la morfología celular y es útil para examinar una serie de preguntas en proteínas y biología celular. Aquí se describe un método general para la creación de patrones de proteínas bien definido para los estudios celulares 5 Este proceso consiste en tres pasos:. La producción de un maestro de modelado usando fotolitografía, la creación de un sello de PDMS, y microcontacto impresión de un oro sustrato recubierto. Una vez modelados, los sustratos de cultivo de células son capaces de limitar las proteínas y / o células (células primarias o líneas celulares) para el patrón. El uso de la química monocapa auto-ensambladas permite un control preciso sobre las regiones adhesivas con dibujos de proteína / celular y de las no-adhesivo, lo que no se puede lograr utilizando estampación directa de proteínas. Hexadecanethiol, la larga cadena alcano tiol utilizado en la etapa de impresión microcontacto, produce una superficie hidrofóbica que fácilmente absorbe las proteínas de la solución. El glicol de terminación tiol, que se utiliza para rellenar las zonas no impresas del sustrato, crea una monocapa que es resistente a la adsorción de proteínas y por lo tanto el crecimiento celular. 6 Estos monómeros tiol produce monocapas altamente estructurado que definen con precisión las regiones del sustrato que pueden apoyar adsorción de proteínas y el crecimiento celular. Como resultado, estos sustratos son útiles para una amplia variedad de aplicaciones, desde el estudio del comportamiento 7 intercelular a la creación de la microelectrónica. 8 Mientras que otros tipos de química monocapa se han utilizado para los estudios de cultivos celulares, incluyendo el trabajo de nuestro grupo con trichlorosilanes para crear patrones directamente sobre sustratos de vidrio, 9 monocapas patrón formado por tioles alcano en el oro son claros para prepararse. Por otra parte, los monómeros utilizados para la preparación de monocapa están disponibles comercialmente, estable, y no requieren almacenamiento o manipulación en atmósfera inerte. Sustratos patrón preparada a partir de alcanos tioles también pueden ser reciclados y reutilizados varias veces, el mantenimiento de confinamiento celular. 10

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Monocapas auto-ensambladas (SAMs) formado por largas cadenas de alcanos tioles en oro proporcionan sustratos bien definidos para la formación de los patrones de proteínas y el confinamiento de la célula. Impresión por microcontacto de hexadecanethiol con un polidimetilsiloxano (PDMS) sello seguido por el relleno con un glicol terminada alcano tiol monómero produce un patrón en el que las proteínas y las células de absorber sólo a la región hexadecanethiol sellado.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

creating-two-dimensional-patterned-substrates-for-protein-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K vistas.  Washington University in St. Louis. Monocapas auto-ensambladas (SAMs) formado por largas cadenas de alcanos tioles en oro proporcionan sustratos bien definidos para la formación de los patrones de proteínas y el confinamiento de la célula. Impresión por microcontacto de hexadecanethiol con un polidimetilsiloxano (PDMS) sello seguido por el relleno con un glicol terminada alcano tiol monómero produce un patrón en el que las proteínas y las células de absorber sólo a la región hexadecanethiol sellad...

Video: Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

El estudio de las trayectorias celular Rolling en los patrones del receptor asimétrica

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Investigación

Bioingeniería

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Patrones celular en fotolitográficamente Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Sustratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Microcontacto de impresión de las proteínas de Biología Celular

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Biología

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe a novel protocol employing the TiO2 photocatalysis to locally alter cell affinity of the substrate surface. For this experiment, a thin TiO2 film was sputter-coated on a glass coverslip, and the TiO2 surface was subsequently modified with an organosilane monolayer derived from octadecyltrichlorosilane (OTS), which inhibits cell adhesion. The sample was immersed in a cell culture medium, and focused UV light was irradiated to an octagonal region. When a neuronal cell line PC12 cells were plated on the sample, cells adhered only on the UV-irradiated area. We further show that this surface modification can also be performed in situ, i.e., even when cells are growing on the substrate. Proper modification of the surface required an extracellular matrix protein collagen to be present in the medium at the time of UV irradiation. The technique presented here can potentially be employed in patterning multiple cell types for constructing coculture systems or to arbitrarily manipulate cells under culture.

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.

Photopatterning proteínas y células en el medio ambiente acuoso Usando TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Fotocatálisis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Un método versátil de Patterning proteínas y células

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Preparación de microambientes de matriz extracelular sintonizable para evaluar la especificación del fenotipo celular Schwann

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Control de la adhesión celular mediante técnicas de patrón de hidrogel para aplicaciones en microscopía de fuerza de tracción

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

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