עבודה זו נתמכה על ידי קרן קולטר, Beyster הקרן, הזדמנות מחקר לתואר הראשון (UROP) תכנית הקיץ לATA וקרן מדע בוגר תלמיד מחקר מלגה לאומית (גרנט לא dge 0718128; ID:. 2010101926) לJBW.

1. אפיון מערכת שלב: ספים הקובע להפרדת שלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות המכילים PEG ו DEX במאגר הרצוי או בינוני תרבית תאים כפי שמוצגים באיור 1 (נקודות סגולות) ב15 מ&quot;ל או 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל. להלן, PEG ו DEX יתייחסו לPEG 35 kDa ו 500 דקס kDa, אולם ריכוזים קריטיים ישתנו בהתאם לשני הפולימרים המשמשים. רשום את המסה של PEG ו DEX בכל פתרון. פתרוני פולימר-ריכוז גבוה עשויים להימשך מספר שעות כדי להמס. Vortexing יכול לשמש לפתרוני סרום חינם. לתקשורת המכילה חלבונים או סרום, הנח את הצינורות על במה רועדת עד ששני פולימרי המסה מלאה. רשום את המשקל של חומרים המשמשים להמסה של הפולימרים ולרשום את הריכוזים הראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפולימרים הם התמוססו באופן מלא, את הפתרונים שאמורים להופיע מעוננים. זה הסימן הראשון שהפרדת פאזות התרחשה. כדי לאשר זאת, לאפשרפתרוני פולימר למנוחה במצב אנכי בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. צנטריפוגה ב 1000 XG ניתן להשתמש כדי להאיץ את תהליך הפרדת פאזות. השלב התחתון יהיה צפוף יותר DEX עשיר והשלב העליון יהיה PEG עשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט להוסיף חיץ או מדיה נוסף לחצוצרות. מרווחים קטנים יש להשתמש כדי שלא לעבור את נקודת הפרדת פאזות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התמיסה מתבהרת וכבר לא מפרידה בין שלב שאחרי צנטריפוגה, הסף להפרדת פאזות כבר הגיע. רשום את המשקל הסופי של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במשקולות נרשמו הקודמות לפולימרים, יחד עם המשקל הסופי לאחר הוספת תקשורת, לקבוע wt% / wt של כל שני פולימרים שבהפרדת השלב כבר לא מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילת ערכים אלה כ% PEG wt / wt על ציר y ו% wt / wt DEX על ציר x. עלילה זו, המכונית עקומה binodal, ניתן להשתמש בו כדי לקבוע את ריכוז הסף להפרדת פאזות לconcentrati השונהתוספות של PEG / DEX במדיום תרבות תאים ספציפיים. </li></ol> 2. תצורת 1: דפוסי הרחקה (96 גם פורמט פלייט) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונים נפרדים של 5.0% wt / wt PEG ו 12.8% wt / wt DEX במדיום תרבות תא. השתמש בפתרוני ATPS של לפחות פעמים בנקודה הקריטית כדי להבטיח שATPS נשאר לאחר הפולימרים לאזן בכבוד זה לזה. יש כמות קטנה של שטף של DEX לשלב PEG העשיר ולהיפך, לכן, משום שעבד בסמוך לריכוז הקריטי יכול לגרום לאובדן של מערכת השלב כירידת ריכוזים מתחת לנקודה קריטית. כמו כן, העברת צלחת תרבית תאים לחממה ולחות הטמפרטורה מבוקרת יכולה לשנות את מאפייני שני שלבים ולבצע את שני פתרוני בליל. הערה: תאים מסוימים עשויים לתפקד טובים יותר עם ניסוחי ATPS אחרים. ניסוחים מקובלים עשויים להיות נבחרו בהתבסס על עקומות binodal נקבעו מהחלק 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את התאים שישמשו להדרת פאטrning. קבע את המספר / ריכוז הכולל של תאים זמינים. אופציונלי: לתייג את התאים עם CellTracker או תוויות שאינן ציטוטוקסיות אחרות למיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים וresuspend הגלולה בנפח מתאים של 5.0% PEG כדי להשיג את המספר הרצוי של תאים להדרה. לדוגמה, אחד טוב של 96-צלחת גם דורש 37,500 תאי פיברובלסטים להיות resuspended ב200 μl של PEG לייצר מפגש ביום המחרת. הרחב את המספרים הללו כמתאימים לסוגי תאים אחרים וגדלי מצע תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micropipettor, לוותר על 0.5 טיפי μl של DEX על מצע תרבית תאים יבש. טיפי נפח גדולות יותר לייצר אזורי הדרה גדולות יותר. טיפין החל בגודל 0.1 עד μl 1 מומלצות לmicropatterning הדרה. אופציונלי: טיפי דקס ניתן להפקיד 24 שעות לפני הזמן ואפשרו להתייבשות בטמפרטורת חדר. זה יכול לייצר דפוסים נקיים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 200 μl של השעית תא PEG לתוך tהוא גם כדי לכסות את טיפי דקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בחממת humidified עבור 12 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. ודא כי הספלון אינו מוטה במהלך טיפול ושהוא נמצא על מדף חממת רמה, כדי למנוע שיבוש הדפוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון PEG ולשטוף שלוש פעמים עם 200 μl של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיום התרבות טרי ולחזור לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על התרבויות מעת לעת כדי לבחון תנועת תא לאזור ההרחקה. </li></ol> 3. תצורת 2: דפוסי איילנד (פורמט פלייט 96-היטב) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונים של 5.0% wt / wt PEG ו 12.8% wt / wt DEX במדיום תרבות תא, כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את התאים שישמש לדפוסי אי. קבע את המספר / ריכוז הכולל של תאים זמינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגלולה וresuspend התאים בנפח מתאים של 12.8% DEX כדי להשיג את הריכוז הרצוי של תאים עבור דפוסי אי. ריכוזים של 5000 לסה&quot;נLLS / μl או פחות מומלץ לסוגי תאים מאוד חסידים. לתאים שיש להם קושי או תאים שמצרפים באופן רופף לדבוק, ריכוזים של עד 10,000 תאים / μl יכולים להיחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובד במהירות כדי למנוע התייבשות, פיפטה μl 0.5 טיפין של DEX על מצע תרבית תאים יבש, כמתואר לעיל. אל תאפשר טיפין לייבוש. אופציונלי: 200 μl של פתרון PEG ניתן להוסיף גם לפני הזמן. טיפי דקס אז יכולות להיות מופקדות בפתרון PEG שם הם שוקעים לתחתית ולפנות שטח התרבות. זה יכול לייצר דפוסי אי נקיים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את טיפי דקס עם 200 μl של PEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בחממת humidified עבור 12 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. ודא כי הספלון אינו מוטה במהלך טיפול ושהוא נמצא על מדף חממת רמה, כדי למנוע שיבוש הדפוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון PEG ולשטוף שלוש פעמים עם 200 μl של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תרבות טריהבינוני ולחזור לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על התרבויות מעת לעת כדי לבחון תנועת תא והחוצה הפצה מהאיים. </li></ol> 4. תצורה 3: הדרת עמיתים לתרבויות (פורמט פלייט 96-היטב) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונים של 5.0% wt / wt PEG ו 12.8% wt / wt DEX במדיום תרבות תא, כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את התאים שישמשו להדרה ודפוסי אי. קבע את המספר / ריכוז הכולל של תאים זמינים לכל סוג תא. אופציונלי: כמה זיווגים סלולריים עשויים להציג מדדי הפצה שונים באופן דרמטי. כדי למנוע את התאים שהוצאו מoverpopulating תאי דוגמת האי (במיוחד לתרבויות לטווח ארוכות), טיפול בתאים המשמשים להרחקה עם mitomycin צלזיוס במשך 2 שעות או להקרין אותם לפני הקציר. זה ימנע התפשטות. צבעי ניאון CellTracker יכולים לשמש כדי להבדיל בין שתי אוכלוסיות תאים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים וresuspend הגלולה לexclusion דפוסים בנפח מתאים של PEG 5.0% כדי להשיג את המספר הרצוי של תאים, כאמור לעיל. Resuspend הגלולה לדפוסי האי בנפח מתאים של 12.8% DEX כדי להשיג את הריכוז הרצוי של תאים, כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micropipettor, לוותר על 0.5 טיפי μl של השעית תא DEX על מצע תרבית תאים יבש. אל תאפשר טיפין לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את טיפי דקס עם 200 μl של השעית תא PEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בחממת humidified עבור 12 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. ודא כי הספלון אינו מוטה במהלך טיפול ושהוא נמצא על מדף חממת רמה, כדי למנוע שיבוש הדפוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון PEG ולשטוף שלוש פעמים ב200 μl של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיום התרבות טרי ולחזור לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטר את העמיתים לתרבויות להתבונן אינטראקציה בין אוכלוסיות תאים. אופציונלית: בקרה יכולה להיות מוכנה על ידי ביצוע הרחקה או האי הדפוסים individually, על ידי תאי שיתוף התרבות שאינו מתקשרים או על ידי חסימת מסלולים של עניין אחד או שתי אוכלוסיות תאים לפני או אחרי הדפוסים. </li></ol>

<ol>
	<li>Hatti-Kaul, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+two-phase+systems+:+methods+and+protocols.">Aqueous two-phase systems : methods and protocols.</a> Methods in biotechnology. xiii, 440 (2000).</li><li>Albertsson, P. A. k. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Partition of cell particles and macromolecules: separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes, and cells in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. , 346 (1986).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+partitioning+using+an+aqueous+two-phase+flow+system+in+microfluidic+devices.">Continuous cell partitioning using an aqueous two-phase flow system in microfluidic devices.</a> Biotechnol. Bioeng. 88 (4), 489-494 (2004).</li><li>Soohoo, J. R., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+aqueous+two+phase+system+for+leukocyte+concentration+from+whole+blood.">Microfluidic aqueous two phase system for leukocyte concentration from whole blood.</a> Biomed. Microdevices. 11 (2), 323-329 (2009).</li><li>Hahn, T., Hardt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+size+separation+of+DNA+samples+at+liquid-liquid+interfaces.">Concentration and size separation of DNA samples at liquid-liquid interfaces.</a> Anal. Chem. 83 (14), 5476-5479 (2011).</li><li>Hatti-Kaul, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+two-phase+systems.+A+general+overview.">Aqueous two-phase systems. A general overview.</a> Mol. Biotechnol. 19 (3), 269-277 (2001).</li><li>Hustedt, H., Kroner, K. H., Menge, U., Kula, M. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+recovery+using+two-phase+systems.">Protein recovery using two-phase systems.</a> Trends in Biotechnology. 3 (6), 139-144 (1985).</li><li>Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Phase+Separation+as+a+Possible+Route+to+Compartmentalization+of+Biological+Molecules.">Aqueous Phase Separation as a Possible Route to Compartmentalization of Biological Molecules.</a> Acc Chem. Res. 45 (12), 2114-2124 (2012).</li><li>Helfrich, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+and+assembly+of+metal+particles+and+their+bioconjugates+in+aqueous+two-phase+systems.">Partitioning and assembly of metal particles and their bioconjugates in aqueous two-phase systems.</a> Langmuir. 21 (18), 8478-8486 (2005).</li><li>Diamond, A. D., Hsu, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prote.+Partitioning+in+PEG/Dextran+Aqueous+Two-Phase+Systems.">Prote. Partitioning in PEG/Dextran Aqueous Two-Phase Systems.</a> AIChE Journal. 36 (7), 1017-1024 (1990).</li><li>Y-T, Z. -. Q., Zhu, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+interfacial+tension+of+aqueous+two-phase+systems.">Modeling of interfacial tension of aqueous two-phase systems.</a> Chemical Engineering Science. 54 (4), 433-440 (1999).</li><li>Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+dependence+of+the+interfacial+tension+for+aqueous+two-phase+polymer+solutions+of+dextran+and+polyethylene+glycol.">Concentration dependence of the interfacial tension for aqueous two-phase polymer solutions of dextran and polyethylene glycol.</a> Langmuir. 28 (8), 3831-3839 (2012).</li><li>Rha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+of+Polyethylene+Glycol/Potassium+Phosphate+Aqueous+Two-Phase+Systems.">Interfacial Tension of Polyethylene Glycol/Potassium Phosphate Aqueous Two-Phase Systems.</a> Physics and Chemistry of Liquids: An International Journal. 38 (1), 25-34 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Generation+of+Multiplexed+Cell+Cocultures+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Followed+by+Aqueous+Two-Phase+Exclusion+Patterning.">Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous Two-Phase Exclusion Patterning.</a> Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (9), 647-657 (2012).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells.">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8 (9), 736-741 (2009).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells:+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches.">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22 (24), 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. , (2011).</li><li>Tavana, H., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+biphasic+microprinting+approach+to+tissue+engineering.">Aqueous biphasic microprinting approach to tissue engineering.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 13404 (2011).</li><li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precisely+targeted+delivery+of+cells+and+biomolecules+within+microchannels+using+aqueous+two-phase+systems.">Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems.</a> Biomed. Microdevices. 13 (6), 1043-1051 (2011).</li><li>Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rehydration+of+Polymeric,+Aqueous,+Biphasic+System+Facilitates+High+Throughput+Cell+Exclusion+Patterning+for+Cell+Migration+Studies.">Rehydration of Polymeric, Aqueous, Biphasic System Facilitates High Throughput Cell Exclusion Patterning for Cell Migration Studies.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2920-2926 (2011).</li><li>Falconnet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+engineering+approaches+to+micropattern+surfaces+for+cell-based+assays.">Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays.</a> Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).</li><li>Lim, J. Y., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensing+and+response+to+micro-+and+nanostructured+surfaces+produced+by+chemical+and+topographic+patterning.">Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning.</a> Tissue Eng. 13 (8), 1879-1891 (2007).</li><li>Ringeisen, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jet-based+methods+to+print+living+cells.">Jet-based methods to print living cells.</a> Biotechnol. J. 1 (9), 930-948 (2006).</li><li>Wright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+static+and+dynamic+patterned+co-cultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils.">Generation of static and dynamic patterned co-cultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7 (10), 1272-1279 (2007).</li><li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+cells+and+their+environments+using+multiple+laminar+fluid+flows+in+capillary+networks.">Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (10), 5545-5548 (1999).</li><li>Berthier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pipette-friendly+laminar+flow+patterning+for+cell-based+assays.">Pipette-friendly laminar flow patterning for cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (12), 2060-2065 (2011).</li><li>Davidson, R. L., O'Malley, K. A., Wheeler, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-induced+mammalian+cell+hybridization:+effect+of+polyethylene+glycol+molecular+weight+and+concentration.">Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: effect of polyethylene glycol molecular weight and concentration.</a> Somatic Cell Genet. 2 (3), 271-280 (1976).</li><li>Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Two-Dimensional+Patterned+Substrates+for+Protein+and+Cell+Confinement.">Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement.</a> J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).</li><li>Moon, S., Lin, P., Keles, H. O., Yoo, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Title+Cell+Encapsulation+by+Droplets.">Title Cell Encapsulation by Droplets.</a> J. Vis. Exp. (8), e316 (2007).</li></ol>

המחברים לא היו מתחרים אינטרסים כספיים.

שיטת micropatterning תא ATPS דורשת מומחיות מעט מאוד מעבר למיומנות בטכניקות תרביות תאים וניתן לשלוט במהירות. היתרונות של גישה זו הם שהוא זול, מהיר ותואם עם מגוון רחב של סוגי תאים ותבניות תרבות. מסיבות אלה, הפרוטוקול שלנו יש לאמץ בקלות על ידי מדעני חיים, במיוחד אלה שלומדים התפשטו...

מערכות של שתי שכבות מימיות (ATPSs) טופס כאשר פתרונות של שני פולימרים אינם תואמים מעורבבים בריכוזים גבוהים מספיק. הפרדת שלב מושפע ממגוון של גורמים, הכוללים את המשקל המולקולרי וקוטביות של הפולימרים, הטמפרטורה של הפתרונים, pH והתוכן יוני של 1 הממס המימי, 2. הנקודה שבה שני פתרוני הפולימר הנפרדים נקבעים על ידי מאפייני physiochemical של מערכת השלב נבחר, אך בדרך כלל מתרחשת בריכוזי פולימר נמוכים (פחות מ 20% wt / wt) תחת הלא denaturing תנאים, המאפשרת ATPSs לשמש לביוטכנולוגיה יישומים 3-9. עד כה, ATPS הנחקר ביותר בהרחבה היא מערכת dextran (DEX) פוליאתילן גליקול (PEG) /. את ATPS נוצר על ידי פולימרים זולים וביולוגיים אלה תואר במקור עבור הטיהור של ביומולקולות בדרך של חלוקה מולקולרית 2, 10. מחיצותמתרחש כאשר מולקולות נוספות או חלקיקים שאינם תורמים למערכת השלב מעורבבות עם PEG ו DEX. בהתבסס על הזיקות היחסיות שלהם לאו DEX או PEG, המולקולות או חלקיקים תהיינה מועדפות מתגוררות בתוך אחד משני השלבים או בממשק. מאפיין נוסף של PEG / DEX ATPS הוא קיומו של מתח interfacial בין שני שלבי הפולימרים. ATPSs נוצר על ידי PEG ו DEX בדרך כלל להציג מתחי interfacial כי הם נמוכים בהרבה ממערכות נוזל נוזל אחרות שני שלבים כמו שמן ומים, אולם כוחות מתח interfacial עדיין השפעות על חלקיקים קטנים כגון וירוסים, תאים ואגרגטים חלבון 2 , 11-13. לבסוף, מאחר שמשקל המולקולרי הגבוה וPEG DEX הנפרד בריכוזים נמוכים (wt / wt לזני פולימרי משקל מולקולריים גבוהים פחות מ 5%) בנוכחות ריכוזים פיסיולוגיים של מלחים, יש כמה, אם בכלל, השפעות מזיקות על תאי יונקים שולבו בתוך אלה מערכות14-16. לאחרונה, את מאפייני interfacial ואפקטי חלוקת ATPSs יושמו על ידי המעבדה שלנו עבור דפוסי תא 14, 16-20. זו הושגה פתרון DEX צפוף על מצעי תרביות תאים בנוכחות PEG ידי micropatterning. כאשר תאים שולבו שלב PEG, הם מנועים מלהיכנס לטיפי דקס עקב מתח interfacial PEG / DEX 20. כאשר תאים הם בדוגמת בשלב DEX, הן נשמרות על פני השטח של מצע תרבית התאים במתח ובמחיצות 16, 17, 19 interfacial. בניגוד לשיטות אחרות לדפוסי תא, תא דפוסי ATPS קלים ללימוד ודורשים ידע בסיסי על הפולימרים עצמם, והיכולת לבצע תרבית תאים ולהשתמש micropipettor בלבד. שיטות אחרות לדפוסי תא כרוך לעתים קרובות בציוד והכשרה מיוחדים שאינם מתורגמים בקלות לדואר מדעי חיים. לדוגמה, כמה שיטות (microcontact הדפסת הדפסה או הזרקת דיו) תאי דפוס בעקיפין על ידי יישום דפוסים של ביומולקולות הדבקה הסלולרית למצע תרבות שלאחר מכן ישמשו כאתרים לקובץ מצורף תא 21, 22. למרות גישות עקיפות שימושיות לכמה סוגי תאים, הם דורשים רמה גבוהה של מיומנות משתמש וציוד מיוחד כדי להמציא כלי הדפוסים, ויכולים חסרי ייחוד בהתאם לסוג הדפוס / biomolecule המסוים של התאים. לחלופין, ניתן להפקיד תאים עם סגוליות דפוס גבוהות בדרך של גישות דפוסים ישירים הכוללות מינרית זרימת דפוסים, שכפול והדפסת דיו 23-26. עם זאת, שיטות אלו דורשות גם מומחיות משתמש וציוד מיוחד, ויכולות לפגוע בתאים בתהליך ההדפסה. למרות שגישות אלו בדרך כלל לייצר דפוסים מדויקים של תאים, לדפוסי תא להיות כלי שימושי בתחום מדעי החיים, זה חייב להיות חסכוניnd פשוט ליישום. כאן אנו מדווחים פרוטוקול מפורט ליצירת תרביות תאים בדוגמת באמצעות ATPSs המתואר ביישומים שלנו שפורסמו בעבר. שימוש micropipettors בלבד, משתמשים יכולים ליצור אזורים סלולריים הדרה או איים סלולריים עבור מבחני הגירה. זו מושגת בדרך של מתח interfacial PEG / DEX כי גם שומר תאים בשלב DEX או מוציא תאים הופקדו בשלב PEG מDEX. על ידי סריקת שתי טכניקות דפוסי יסוד אלה, ניתן במהירות כדי לייצר עמיתים לתרביות של תאים כמו תאי כבד פיברובלסטים שיתוף תרבויות. שיטות דפוסים, פרמטרי ATPS ותוצאות צפויות מתוארות בפירוט.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> יצרן </td></tr><tr><td> Dextran 500.000 kDa </td><td> Pharmacosmos, דנמרק </td></tr><tr><td> 35,000 kDa פוליאתילן גליקול </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td></tr><tr><td> הלה </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> NIH 3T3 </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> מעקב סלולרי </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco, קרלסבד, קליפורניה </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco, קרלסבד, קליפורניה </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco, קרלסבד, קליפורניה </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> Gibco, קרלסבד, קליפורניה </td></tr></tbody></table>

cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems

טכנולוגיות דפוסים סלולריים, כי הם מהירים, קלים לשימוש ובמחיר סבירים שתידרשנה לפיתוח העתידי של מבחני תפוקה גבוהות סלולריים, פלטפורמות לחקר אינטראקציות תא סלולריים ומערכות רקמות מהונדסות. פרוטוקול מפורט זה מתאר שיטה ליצירת שיתוף תרביות של תאים באמצעות פתרונות ביולוגיים של dextran (DEX) ופוליאתילן גליקול (PEG) ששלב נפרד בשילוב ריכוזים מעל סף. תאים יכולים להיות תבנית במגוון תצורות המשתמשות בשיטה זו. דפוסי הדרת תא יכולים להתבצע על ידי הדפסת טיפין של DEX על מצע ומכסה אותם עם תמיסה של תאים המכיל PEG. מתח interfacial נוצר בין שני פתרוני הפולימר גורם לתאים לנפול סביב החלק החיצוני של טיפת DEX וליצור קרחת עגולה שיכול לשמש למבחני הגירה. איים סלולריים יכולים להיות תבנית על ידי מחלק שלב DEX תא עשיר לפתרון PEG או על ידי כיסוי DEXאגל עם פתרון של PEG. עמיתים לתרבויות יכולות להיוצר באופן ישיר על ידי שילוב של הדרת תא עם דפוסי האי DEX. שיטות אלה הן תואמות עם מגוון רחב של גישות טיפול נוזל, כולל micropipetting הידני, וניתן להשתמש בו עם כמעט כל סוג תא חסיד.

כדי לבחור שילוב מתאים של PEG ו DEX עבור דפוסי תא זה חשוב כדי לקבוע את עקומת binodal. עקומה זו משרטטת את הנקודות בן כ ATPS יכול להיוצר ויכול להשתנות לקבוצת נתונה של פולימרים המבוססות על הטמפרטורה, pH ותוכן יוני. לתאי culturing שדורשים ניסוחים בינוניים אישית ייתכן שיהיה צורך בניסוי כד...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems at JoVE.com

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

מערכות מימיות שני שלבים שמשו בו זמנית לאוכלוסיות רבות הדפוס של תאים. השיטה מהירה וקלה זה עבור דפוסי תא מנצלת את הפרדת פאזות של תמיסות מימיות של גליקול dextran ופוליאתילן ומתח interfacial שקיים בין שני פתרוני הפולימרים.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

cell-co-culture-patterning-using-aqueous-two-phase-systems

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K Views.  University of Michigan. מערכות מימיות שני שלבים שמשו בו זמנית לאוכלוסיות רבות הדפוס של תאים. השיטה מהירה וקלה זה עבור דפוסי תא מנצלת את הפרדת פאזות של תמיסות מימיות של גליקול dextran ופוליאתילן ומתח interfacial שקיים בין שני פתרוני הפולימרים.

Video: Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Toolkit כדי לאפשר גיור פחמימן בסביבות מימיות

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

תא דפוסים על photolithographically מוגדר Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; מצעים

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe a novel protocol employing the TiO2 photocatalysis to locally alter cell affinity of the substrate surface. For this experiment, a thin TiO2 film was sputter-coated on a glass coverslip, and the TiO2 surface was subsequently modified with an organosilane monolayer derived from octadecyltrichlorosilane (OTS), which inhibits cell adhesion. The sample was immersed in a cell culture medium, and focused UV light was irradiated to an octagonal region. When a neuronal cell line PC12 cells were plated on the sample, cells adhered only on the UV-irradiated area. We further show that this surface modification can also be performed in situ, i.e., even when cells are growing on the substrate. Proper modification of the surface required an extracellular matrix protein collagen to be present in the medium at the time of UV irradiation. The technique presented here can potentially be employed in patterning multiple cell types for constructing coculture systems or to arbitrarily manipulate cells under culture.

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.

Photopatterning חלבונים ותאים בסביבה מימית שימוש Tio<sub&gt; 2</sub&gt; Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

באמצעות דפוסים דבקים כדי לבנות התקני 3D נייר Microfluidic

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

בונה אלגינט Layered: פלטפורמה עבור Co-תרבות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video