بفضل Birne ماري Tsiola Areti ، ويبدو أن أوريبي استيفيز Jaymie Arelys. وأيد هذا العمل في جزء من جامعة مدينة نيويورك ومؤسسة البحوث وهوارد هيوز الطبي الصيفي المنح لطلاب المعهد برنامج المرحلة الجامعية (المهماز) والمعهد الوطني للصحة RO3 41702-00-01. وأيد أيضا البحوث في كلية كوينز ، وأجريت بعض التجارب على معدات من مرفق الأساسية للتصوير ، البيولوجيا الخلوية والجزيئية في كلية كوينز.

وأثيرت الزرد باستخدام البروتوكولات القياسية 13 في الحيوان كلية كوينز مرفق في 28 درجة مئوية. وينبغي بريفورميد أزواج الأسماك الفردية أو الجماعية والتزاوج الأجنة الناتجة تنظيفها وتخزينها في الحاضنة 28 درجة مئوية. ينبغي فحص صحة الأسماك يوميا. التسميد في آخر لمدة 5 أيام (DPF) ، ينبغي فصل الأسماك في خزانات في مناطق ذات كثافة الأسماك 10-15 ، ودخلت حيز الأسماك الحضانة المنشأة. للبروتوكول المعروضة هنا جمعت الزرد في اليرقة من خلال مراحل الكبار : 15 ، 30 ، 45 ، 60 ، 90 ، 180 DPF. 1. الزرد جمع الموضوع والتثبيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة خزان الأسماك من الموائل به ووضعه في صافي Tricaine 0.2 ٪ إلى تخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تخدير الأسماك في المياه الجليدية لمدة 15 دقيقة على الموت ببطء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الطازجة بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأسماك التي تم جمعها في PFA 4 ٪ لمدة 1-2 ساعات في الليل RT ثم في 4 درجات مئوية في طبق بتري ملفوفة في parafilm. هذا يحافظ على مسطح يجعل تشريح الأسماك وأسهل بكثير في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التثبيت ، وشطف مرتين في برنامج تلفزيوني مع توين (PBT). يمكن أن نضع في الأسماك PBT في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 يوما. </li></ol> 2. تشريح الأسماك وقياس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السمك مكان واحد في نصف طبق بتري مليئة PBS الطازجة وضعه على جنبه الايمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس طول الأسماك من الخطم إلى قاعدة الذيل (والسويقة الذيلية) ، وليس بما زعانف الذيل ، وذلك باستخدام الفرجار الرقمية ملم (الشكل 1). هذا هو طول القياسية (SL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن تعيين كل سمكة رقم / حرف تركيبة للسماح الأسماك الفردية والقلب الناتجة تشريح لتعقبها لتحليلها لاحقا. تم إدخال البيانات ، بما في ذلك عدد الأسهم الوالدين ، والعمر في التثبيت ، والقياسات SL ، إلى جدول ونظمت على أساس هذه التسميات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التشريح ، والشرائط أنبوب التسمية PCR مع عدد تتبع تعيين وملء مع PBT أو حل مناسبة أخرى لمزيد من التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه الجانب البطني السمك في طبق بتري حتى حين استقرار الجسم مع ملقط يمسك رأسه بين العينين والخياشيم (الشكل 2). </li></ol> الأسماك الصغيرة (أقل من 12mm SL) : <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أ) استخدام الملقط حادة ، أو إبرة صغيرة في حامل دبوس ، وإزالة العضلات الصدرية والزعانف من الجسم للكشف عن القلب. لا يمكن للحركة مستمرة من خلال ملقط تشريح قضية التيارات في PBT التي تحرك الأسماك. هذه هي مشكلة خاصة بالنسبة لصغار السمك ، وبالتالي يمكن استخدام إبرة صغيرة لإزالة العضلات الصدرية والزعانف وفتح تجويف الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أ) استخدام ملقط برفق لحلج القطن في قلب من تجويف من تحت الأذين. بالتناوب ، في بعض الأسماك التي قد تكون قادرة على إزالة القلب عن طريق سحب بلطف خارج بصلي وبقية قلب ستتبع. كن حذرا من مكان الأذين إذا باستخدام هذه التقنية حيث يمكن بسهولة أن يكون معطوبا. إذا كان هناك الأنسجة الزائدة التي تأتي مع القلب ، والتي على ما يرام ، ويمكن بعد تطهيرها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أ) إذا كان السمك يحتوي على علامة فلوري القلب مثل تيراغرام (myl7 : GFP) twu34 ، واستخدام نطاق نيون للتشريح ، والتحقق من ازالة القلب من قبل الإزهار (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم إزالة أ) مرة واحدة في قلب من تجويف ، استخدم ملقط لعقد القلب وإبرة صغيرة لإزالة إضافية غير الأنسجة القلبية وبطانة epicardial من الخارج من القلب. </li></ol> الأسماك الأكبر (أكبر من SL 12mm) : <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ب) عن طريق التعامل مع الربيع المقص الصغير ، وجعل ثلاثة شقوق أقل من 1MM العميق : 1 -- قطع عرضية من خلال الخياشيم 2 -- قطع عرضية في البطن الأمامي 3 -- خفض السهمي على الجانب البطني تربط كلا تخفيضات (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ب) استخدام الملقط حادة إزالة العضلات الصدرية والزعانف من الجسم لفتح تجويف الجسم وتكشف الأنسجة فضي للتأمور (الشكل 5A). إزالة هذه الأنسجة التامور والقلب سوف تصبح مرئية (الشكل 5B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ب) استخدام المقص الصغير لقطع الشريان المتصل الشريانية بصلي الشكل ، وتقع أعلى من القلب. بمجرد أن يتم قطع هذا الشريان ، وضعت تحت نصائح ملقط الأذين ، استخدم ملقط لحلج القطن في قلب من التجويف. إذا كان هناك الأنسجة الزائدة التي تأتي مع القلب ، والتي على ما يرام ، ويمكن إزالتها في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ب) بمجرد إزالة القلب من تجويف ، استخدم ملقط سنتين إلى عقد القلب وإزالة الأنسجة الإضافية ، أو زوج واحد من ملقط لعقد القلب والإبرة الدقيقة لإزالة اضافية ، غير القلب الأنسجة. ويمكن إزالة بطانة epicardial ، يتضح من تصبغ به سوداء ، من الخارج من القلب إذا رغبت في ذلك عن طريق كشط بلطف الأنسجة. </li></ol> 3. التصوير القلوب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد 23g / L المغذيات طبق بتري وأغار أغار تغطية طدت مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط ، وجعل جيدا في آغار الذي يسمح للراحة القلب في الاتجاه المطلوب للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Removه القلب من أنبوب من خلال عقد PCR غيض من بصلي مع ملقط بحزم. مكان القلب في طبق آغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه القلب في أجار إلى صورة فوتوغرافية. يمكن أن تكون العينة بعد استدارة كل صورة لجميع التوجهات المحتملة (الشكل 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الضوء الحمل والتعرض لوقت قصير صورة قلوب. لإجراء تعديلات نوعية الضوء باستخدام التعرض عند الضرورة للحصول على أفضل صورة. </li></ol> 4. ممثل النتائج : ويرد مثال جيد تشريح القلب نظيفة في توجهات متعددة في الشكل 6. وسوف يكون كل قلب بعض الاختلافات في التشكل العام ، ولكن القلب يجب أن يكون كاملا ، يحتوي على البطين سليمة ، والأذين الشريانية منتفخة. وترد بعض الأمثلة على هذا الاختلاف في التشكل العام في الشكل 7. ويمكن أيضا إزالة الأنسجة السوداء epicardial رصدت من القلب. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. قياس السمك من الخطم إلى السويقة الذيلية باستخدام الفرجار الرقمية ملم. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. امسك السمك مع ملقط بين العينين والخياشيم. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3 ألف محددة الفلورسنت القلب علامة المعدلة وراثيا مثل تيراغرام (myl7 : GFP). twu34 يمكن ، كما هو موضح هنا ، والمعونة في تصور قلوب من تشريح الأسماك الصغيرة. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4 ثلاثة شقوق لإزالة العضلات الصدرية والجلد : 1 -- قطع عرضية من خلال الخياشيم 2 -- قطع عرضية في البطن الأمامي 3 -- خفض السهمي على الجانب البطني ربط كل من التخفيضات. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig5.jpg" alt="الشكل 5"/> . الشكل 5 رسائل الأسود تسمية غرف القلب : الشريانية بصلي (BA) ، البطين (الخامس) ، والأذين (أ). A - تجويف الجسم العلوي مفتوحا لإظهار الأنسجة فضية من بيريكارديوم. B - بعد إزالة بيريكارديوم ، والقلب هو مرئي وإزالتها بسهولة. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig6.jpg" alt="الشكل 6"/> وتظهر الشكل 6. توجهات مختلفة من القلب. رسائل سوداء تسمية غرف القلب : الشريانية بصلي (BA) ، البطين (الخامس) ، والأذين (أ). السهام تشير غراي الموقع والتوجه للقلب ، في اشارة الى موقعه الطبيعي في الجسم : الأمامي (A) ، الخلفية (P) ، الظهرية (D) ، بطني (V) ، يسار (L) ، والحق (R). شريط يشير مقياس 400μm. A - بطني نظرا للقلب B - الظهرية نظرا للقلب C - الوحشي وجهة نظر من الجانب الأيسر D - الوحشي وجهة نظر من الجانب الأيمن <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig7.jpg" alt="الشكل 7"/> ويبين الشكل 7. مورفولوجية قلوب من مختلف الأحجام. رسائل سوداء تسمية غرف القلب : الشريانية بصلي (BA) ، البطين (الخامس) ، والأذين (أ). وأشار مقياس شريط 400 ميكرون. AC - هارتس الأسماك النموذج مع SL أقل من 12mm DF - هارتس الأسماك النموذج مع SL أكبر من 12mm

<ol>
	<li>Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+southpaw+joins+the+roster:+the+role+of+the+zebrafish+nodal-related+gene+southpaw+in+cardiac+LR+asymmetry.">A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry.</a> Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).</li><li>Armstrong, E. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+development:+endothelial+cell+signaling+and+differentiation.">Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation.</a> Circ Res. 95, 459-470 (2004).</li><li>Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+zebrafish+heart:+from+left-right+axis+specification+to+epithelial+tissue+morphogenesis.">Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis.</a> Dev Biol. 330, 213-220 (2009).</li><li>Glickman, N. S., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+development+in+zebrafish:+coordination+of+form+and+function.">Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function.</a> Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).</li><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors.">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li><li>Schoenebeck, J. J., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cardiac+development:+Advances+in+imaging+add+new+dimensions+to+the+utility+of+zebrafish+genetics.">Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).</li><li>Beis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+cellular+analyses+of+zebrafish+atrioventricular+cushion+and+valve+development.">Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development.</a> Development. 132, 4193-4204 (2005).</li><li>Lepilina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration.">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127, 607-619 (2006).</li><li>Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+addition+of+new+myocardial+and+epicardial+cells+fosters+homeostatic+cardiac+growth+and+maintenance+in+adult+zebrafish.">Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish.</a> Development. 135, 183-192 (2008).</li><li>Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book,+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (1995).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذه الأساليب لتشريح القلب الزرد في مرحلة ما بعد جنينية الأسماك يسمح لإزالة كاملة من القلب التالفة. في حين أن هذا الأسلوب واضح ومباشر ، ويقدم أدلة لخفض الخارجية التي من شأنها منع إتلاف القلب ومطرد من ناحية لا بد لصغار السمك. والخطو...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> مادة </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> EMD </td><td> PX0055 </td><td> .04g/mL في برنامج تلفزيوني </td></tr><tr><td> ملقط # 55 </td><td> FST </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> المقص الصغير </td><td> FST </td><td> 15005-08 </td><td></td></tr><tr><td> دبوس حامل </td><td> FST </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> الإبر الصغيرة </td><td> FST </td><td> 10130-10 </td><td></td></tr><tr><td> المغذيات آجار </td><td> BBL </td><td> 11472 </td><td> 23g / L في 2 المقطر O H </td></tr><tr><td> أطباق بتري </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> PCR - 8 أنبوب شرائط </td><td> الولايات المتحدة الأمريكية والعلم </td><td> 1402-2500 </td><td></td></tr><tr><td> الفرجار الرقمية </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-648-17 </td><td></td></tr></tbody></table>

heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, danio rerio

الزرد أصبحت كائن نموذج مفيد وعملي لدراسة القلب الجنينية للتنمية (انظر استعراض الاخيرة 1-6) ، ومع ذلك ، عمل فحص ما بعد الجنينية من خلال التنمية الكبار القلب كان محدودا 70-10. دراسة مورفولوجية المتغيرة للقلب النضج والشيخوخة هي مقيدة بسبب عدم وجود التقنيات المتاحة لتنظيم وعزل قلوب الأحداث والبالغين. من أجل تحليل التنمية على مدى عمر قلب السمكة ، ونحن تشريح قلوب الزرد في مراحل عديدة ومنها صورة لمزيد من التحليل 11. يمكن للميزات المورفولوجية للقلب بسهولة يمكن قياسها كميا ، ويمكن قلوب الفردية لمزيد من التحليل من قبل مجموعة من الأساليب القياسية. الزرد تنمو بنسب متفاوتة والنضج يرتبط على نحو أفضل مع حجم الأسماك من العمر ، وهكذا ، بعد التثبيت ، والأسماك ، وصورة قياس طول نحن كمقياس لنضوج الأسماك. هذا البروتوكول يفسر اثنين ، حجم تقنيات متميزة تعتمد على تشريح الزرد ، بدءا من طول اليرقات معيار 3.5mm (SL) مع قلوب طول البطين 100μm (VL) ، بين الكبار ، مع SL من 30mm و1MM VL أو أكبر. اليرقات السمكية وتعليم الكبار وهيئة مميزة جدا والتشكل الجهاز. اليرقات ليست فقط أصغر بكثير ، لديهم أقل الصباغ وكل جهاز هو بصريا من الصعب جدا التعرف عليها. لهذا السبب ، فإننا نستخدم تقنيات تشريح متميزة. كنا قبل التشريح ، تثبيت إجراءات ، كما اكتشفنا أن تشريح قلوب مباشرة بعد euthanization لها التشكل أكثر تنوعا ، مع بالون فضفاض للغاية ومثل الأذينين مقارنة مع قلوب إزالة التثبيت التالية. ثابت السمك قبل التشريح والاحتفاظ بها في التشكل فيفو وموقف الغرفة (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك ، لأغراض العرض التوضيحي ، ونحن نستفيد من القلب (عضلة القلب) محددة GFP تيراغرام المعدلة وراثيا (myl7 : GFP) twu34 (12) ، والذي يسمح لنا تصور قلب كامل ومفيد بشكل خاص في المراحل المبكرة في التنمية عندما القلب التشكل هو أقل وضوحا من الأنسجة المحيطة بها. تشريح القلب يجعل إجراء مزيد من التحليل للخلية وعلم الأحياء الجزيئية الكامنة وراء تطور ونضوج القلب باستخدام التهجين في الموقع ، المناعية ، واستخراج الحمض النووي الريبي أو الأساليب التحليلية الأخرى أسهل في مرحلة ما بعد الزرد الجنينية. وسوف يوفر هذا البروتوكول تقنية قيمة لدراسة التنمية نضوج القلب والشيخوخة.

Watch this Scientific Journal Video about Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio at JoVE.com

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

ووصف واضح وطريقة موحدة للتشريح والعزلة من القلب الزرد في مراحل تنموية متعددة. وتناقش أيضا الشرح وتقدير التقنيات.

تشريح القلب في اليرقات ، اسماك الزرد الأحداث والكبار ، دانيو rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

heart-dissection-in-larval-juvenile-and-adult-zebrafish-danio-rerio

Research

JoVE Journal

Biology

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

21.3K Views.  Queens College, City University of New York. ووصف واضح وطريقة موحدة للتشريح والعزلة من القلب الزرد في مراحل تنموية متعددة. وتناقش أيضا الشرح وتقدير التقنيات.

Video: Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

تشريح الجهاز العصبي المركزي اليرقات في Melanogaster ذبابة الفاكهة

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

الجسيمة والجميلة تشريح الأذن الداخلية الظهارة الحسية في اسماك الزرد الكبار ( دانيو rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

تشريح هيئات من اسماك الزرد الكبار

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

تشريح الكلى اسماك الزرد الكبار

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

العناية والصيانة العادية من اسماك الزرد (<em&gt; دانيو rerio</em&gt;) المختبر: مقدمة

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

في النمذجة فيفو من المهووسين الجينوم البشري باستخدام دانيو rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging اسماك الزرد الكبار

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...