פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ מרובה מסננים להדמיה חיה של כל המבנה של משטח העין של העכבר במודל העכבר ההידור הפלואורסצנטי הכפול. השילוב של פלטפורמה מיקרוסקופית רב-פוטון מותאמת אישית ועכברים פלואורסצנטיים כפולים מאפשר הדמיה בזמן אמת של המבנה והמבנה של פני השטח העין. כדי להקים את מיקרוסקופ מולטיפוטונים, בחר את טבילת המים 20X, 1.00 NA המטרה ולהגדיר את לייזר ספיר טיטניום כמקור עירור על מיקרוסקופ זקוף.
הגדר את אורך הגל של פלט הלייזר ל- 880 ננומטר עבור EGFP ו- 940 ננומטר עבור tdTomato. כלול שתי מראות דיכרואיות להפרדת SHG EGFP ו- EGFP tdTomato ולהשתמש 434-17, 510-84 ו 585-40 ננומטר הלהקה לעבור מסננים כדי להפריד ספקטרלית את האותות SHG EGFP ו tdTomato. כדי להגדיר את מחזיק העין, לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה בעכבר הרדמה 8-12 שבוע, למקם את העכבר על שלב מיקרוסקופ מחומם ולהכניס בדיקה ניטור טמפרטורה.
מניחים את העכבר במחזיק עכבר סטריאטוקסי מותאם אישית ומכניסים את פסי האוזן לתוך הבשר השמיעתי החיצוני. השתמש קיבעון שלוש נקודות כדי לאבטח את מחזיק הראש ולהחיל 0.4% Oxybuprocaine הידרוכלוריד ותמיסת מלח על פני השטח העין. כסו את קצות זוג מדפים דומונט מספר חמש עם לולאת צינור PE.
לאחר שלוש דקות לבצע נסיגה עפעף ידני כדי לאשר את הבלט גלגל העין בזהירות למקם לולאת צינור מחזיק PE לאורך שולי העפעף כדי לחשוף את פני השטח העין. ולהשתמש בכוח של המחזיק כדי לייצב את גלגל העין עם המדפים. לאחר מכן, מכסים את משטח הקרנית עם ג'ל עיניים עם אינדקס שבירה של 1.338.
עבור הדמיה סדרתית Z של פני הקרנית, השתמש במקור אור כספית כדי לדמיין את שדה המטרה ולפתוח את תוכנת המיקרוסקופ. בחר את מכפיל התמונות והרווחים הדיגיטליים המתאימים להמחשת המבנה התאי במשטח העין והגדר את השקופית הראשונה והאחרונה כדי לאפשר רכישה של מחסנית תמונות. הגדר את רזולוציית התמונה ל- 512 על 512 פיקסלים ואת שלב Z למיקרומטר אחד.
לאחר מכן, לחץ על התחל לאסוף תמונות טוריות Z רכישת תמונה חיה אחת עם 880 nanometer העירור עבור SHG EGFP אוסף אותות, ותמונה חיה אחת ב 940 nanometer העירור עבור אוסף אותות tdTomato EGFP בתוך כל אזור. לאורך התמונה, השתמש במחזיק הבמה ממונע צעד כדי לסובב את גלגל העין כדי לאפשר הדמיה על פני הקרנית כולה. לאחר שכל התמונות נרכשו, טען את התמונות הטוריות Z לתוך פיג'י ובחר את תוסף המסנן חציוני תלת-מימדי.
לאחר הסרת רעשי הרקע, בחרו בחבילת המסנן 'הסרת חידוד מסיכה' פיג'י כדי לחדד את התמונות ולחצו על ניגודיות הבהירות האוטומטית כדי למטב אוטומטית את איכות התמונות. לאחר העיבוד, שמרו את התמונות כרצף תמונות טורי וייצאו את רצף התמונה לתוכנה מתאימה לשחזור תלת-מימדי. בכל התמונות מיקרוסקופיה multiphoton, להציג את אותות tdTomato ו SHG EGFP ב פסאודו ירוק, אדום, ציאן בהתאמה לפני לכידת תמונות מבנה 3D על ידי תצלום בזק.
מיקרוסקופיה מרובת פוטון מאפשרת הדמיה של תאי כנף ובזל שטחיים באפיתל הקרנית של עכברים מהונפים פלואורסצנטיים כפולים. תאים בודדים מהשכבה הבסיסית ניתן למפות לשכבה השטחית, כמו גם תאים שטחיים בצורת משושה יחיד. כפי שנחשף על ידי הביטוי הציטופלסמי של אות tdTomato, חלבון הממברנה עשיר במערכת כלי רכב תאיים עשירה, כולל מנגנון הגולגי והריתוק האנדופלסמי מפוזרים בתוך תאי הכנף.
בתוך סטרומה קולגן, קורטזיטים בצורת סטלטה מתוארים על ידי קרום מיקוד פלואורסצנטים EGFP בעכברים אלה. הקורטזיטים המוטמעים בסטרומה המכללה הם במים רופפים יותר מאשר בתוך תאי ה אנדותל. בנוסף, עצבי הסתעפות דקים בתוך סטרומה הקרנית ניתן גם לדמיין על ידי קרום מיקוד אותות tdTomato ו monolayers תא אנדותל הקרנית להפגין צורה משושה הומוגנית יחסית מחובר בתבנית חלת דבש.
האפיתל הלימבי מורכב משכבה אחת עד שתי שכבות של תאי אפיתל. הזן הפלורסנטי הכפול מאפשר גם הדמיה של נימים בתוך הלחמית, ומאפשר שחזור של הארכיטקטורה תלת מימדית של נימים המתארים את אנדותל כלי הדם. ייצוב גלגל העין עם לחץ מתון ללא פציעה הוא קריטי לרכישת תמונות באיכות טובה כמו לחץ לא מספיק או מוגזם יכול לסכן את איכות התמונה.
זה פלטפורמת הדמיה תמונה NVivo ניתן לשנות עבור הדמיה של מבנים מתחת לפני השטח העין והוא יכול להיות מיושם על מחקרים in-situ של מחלות עיניים שונות.
