עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH R01AR054593 וR01AR054593-S1 לשו.

1. הכנת צלחות תרבית רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעייל אחד גם עם מספיק פולי-D-ליזין (PDL) כדי לכסות את תחתית הבאר. לאפשר את הצלחות לייבוש במכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהבארות יבשות, לשטוף עם מים סטריליים, ולשאוב. לאפשר את הצלחות לייבוש במכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר, מעייל יבש עם פיברונקטין (שהומס במי biowhittaker לילה על 37 מעלות צלזיוס בריכוז של 1 מ&quot;ג ב6 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני NCSC [95 מ&quot;ל DMEM/F12, 1 המ&quot;ל פן / דלקת (P / S), 1 המ&quot;ל N2, 2 B27 מ&quot;ל, mercaptoethanol μl 100 (2ME; 50 מניות מ&quot;מ), bFGF (20 בינוני ng / ml), IGF -1 (20 ng / ml של מדיום) וEGF (20 ng / ml של מדיום)] לפני פיברונקטין היבש בצלחות, </li></ol> 2. לחלץ תאי זקיק שיער מקרקפת אנושית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתתחיל בהליך של NCSCs המבודד, צריך להכין את מדיות ומגיב בהתאמה (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עור רענן מבוגר אנושי קרקפת מנהלים מתיחים פנים או פהרקמת קרקפת טל היא נאספה, נשטפה עם PBS המכיל פניצילין-סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז העור מועבר לתוך צינורות 50 מ&quot;ל וטופח DMEM עם Dispase (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הלילה ב 4 ° C. ° C דגירה של 2-4 שעות ב 37 היא גם יעילה. חתיכות עור צריכות להיות רוחב מרבי של 1 סנטימטר כדי לאפשר לאנזים לחדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את העור לתוך צלחת פטרי לעקר; למשוך את כל שיער מעור על ידי אחיזת השערה הקרובה לפני שטח העור ומושך בחוזקה וחלקה. זקיקי השיער להראות מורפולוגיה של שתי anagen (איור 1 א) או טלוגן (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת ברי הזקיק הבודד ב0.05% טריפסין-EDTA (Invitrogen) במשך 15-20 דקות בטמפרטורת חדר עם הרעד מהעת לעת, להוסיף 4 המ&quot;ל DMEM עם 10% FBS לעצור תגובה. אפיתל הזקיקים הוא trypsinized ומסונן דרך 40 מיקרומטר סינון כדי לקבל השעית תא בודד המכילה תאים של גודל וצורה שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטוותב 200 XG למשך 5 דקות, להשליך supernatant זהירות, מחדש להשעות ב1 המ&quot;ל PBS המכיל 2% סרום (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, זקיקי שיער מרוט יכולים להיות ממוקמים בתרבות ללא עיכול טריפסין לגדול תחומי שיער באתר. </li></ol> 3. בידוד של NCSCs זקיק השיער באמצעות מיון תא זרימת Cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית זקיק שיער תא בודד התקבלה על ידי עיכול טריפסין ומתויגת עם נוגדנים נגד CD271 (APC מצומדות) / HNK1 (FITC מצומדות) או CD271 / alpha4 integrin (PE-מצומדות) עבור 40 דקות על קרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת חדר ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב PBS המכיל 2% סרום (FBS), ולפני המיון, PI מתווסף לשער את התאים המתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיון תא על ידי cytometry זרימה (FACS). איסוף CD271 +, HNK1 + תאים חיוביים כפולים או CD271 +, alpha4 integrin + תאים חיוביים כפולים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מיוןing, CD271 +, HNK1 + תאים חיוביים כפולים או CD271 +, alpha4 integrin + תאים חיוביים כפולים מתורבתים בצלחות התקשרות נמוכות במיוחד במדיום NCSC </li></ol> 4. תרבות של NCSCs הראשוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי זקיקי המנותקים או FACS מיון תאים בצלחות התקשרות נמוכות במיוחד במדיום NCSC, לשנות בינוני כל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו תרבית תאים בכל יום תחת מיקרוסקופ. NCSCs יתחיל ליצור אגרגטים קטנים צפים לאחר מספר ימים ותחומים בנויים היטב ב2-5 שבועות בתרבות, בהתאם לגילם של התורמים (איור 3 א). התולדה תופיע בכמה ימים באזור הבליטה וספירות בנויות היטב בהאתר בכמה שבועות (איור 3 ב &#39;), כאשר זקיקי שיער כולו הם בתרבית במדיום NCSC. </li></ol> 5. הרחבת NCSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם PBS פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסיפו מחומם מראש (עד 37 מעלות צלזיוס, ביקורתי) accutase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10דקות עם הרעד מהעת לעת כדי להפוך את תחומי תאי גזע עצביים בטוחים ניתקו לתוך תא בודד (לNCSC המצורף תרבותי, תאי אינקובטורים עם accutase על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להפוך לתאי גזע זקיק שיער בטוחים מנותקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף וסרכזת תאים פעמים למשך 5 דקות ב 200 XG בטמפרטורת החדר בDMEM/F12 בינוני כדי להסיר כל פתרון accutase נותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות תאים עם מדיום התרבות NCSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות הצפה, לשים את התאים בצלחות התקשרות נמוכות במיוחד. לתרבות מצורפת, לשים את התאים בתרבית רקמת pretreated צלחות. </li></ol> 6. נציג תוצאות מדיום תרבות NCSC הוא מספיק כדי לשמור hNCSCs במדינה מובחנת ללא צורך בתאים מזינים. הקרטינוציטים לא יתרבו ומתו בהדרגה במדיום. תאים קטנים ועגולים מסוימים להתרבות וליצור אגרגטים קטנים בהשעיה לאחר 3 עד 5 ימים. אגרגטים צפים אלה הגדילו לאטגודל n, מבנים שנוצרו בשלושת ממדי מרחב דמוי, שאנו נקראים תחומי שיער (איור 3 א). אם בתרבית בצלחות מצופות, את NCSCs יהיה לצרף אל פני השטח ולא בצורה כל תחומים. את NCSCs המצורף לגדול מהר יותר מאשר בהשעיה. תאי גזע יוצרי כדור או מצורפים להביע סמני NCSCs. כאשר זקיקי שיער כל תרבויות, ספירות נוצרות באזור המקביל לאזור הבליטה (איור 3 ב &#39;). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3194/3194fig1.jpg" /> איור 1. קטף אנגן () וטלוגן (B) זקיקי שיער. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3194/3194fig2.jpg" /> איור 2. תמונות מייצגות של ניתוח FACS של NCSCs פנל שמאלי.: תאים מגודרות באמצעות 4 נוגדני integrin אנטי CD271 ואנטי alphe. לוח ימני: תאים מגודרים באמצעות נוגדנים אנטי CD271 ואנטי HNK1. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3194/3194fig3.jpg" /> איור 3. מורפולוגיה של תחומי שיער () מורפולוגיה של תחומים צפים שיער, פנל שמאלי:. צריכת חשמל נמוכה, פנל ימני:. הספק גבוה (B) מורפולוגיה של תחום שיער באתר באזור הבליטה, הפנל שמאלי: תחום שיער בבליטת telogen, לוח ימני: תחום שיער באזור הבליטה של ​​זקיק שיער anagen.

<ol>
	<li>Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+slow-cycling+limbal+epithelial+basal+cells+that+can+be+preferentially+stimulated+to+proliferate:+implications+on+epithelial+stem+cells.">Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells.</a> Cell. 57, 201-209 (1989).</li><li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-retaining+cells+reside+in+the+bulge+area+of+pilosebaceous+unit:+implications+for+follicular+stem+cells,+hair+cycle,+and+skin+carcinogenesis.">Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis.</a> Cell. 61, 1329-1337 (1990).</li><li>Tanimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+stem+cells+provide+a+functional+niche+for+melanocyte+stem+cells.">Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+novel+population+of+multipotent+adult+stem+cells+from+human+hair+follicles.">Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles.</a> Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).</li><li>Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+with+neural+crest+characteristics+derived+from+the+bulge+region+of+cultured+human+hair+follicles.">Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles.</a> J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).</li><li>Wong, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+cells+with+stem+cell+features+can+be+traced+back+to+multiple+lineages+in+the+adult+skin.">Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin.</a> J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).</li><li>Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+neural+crest+stem+cells+in+the+adult+hair+follicle.">Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle.</a> Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).</li><li>Amoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+hair+follicle+stem+cells+form+Schwann+cells+that+support+repair+of+severed+peripheral+nerves.">Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).</li><li>Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell+grafts+as+therapies+for+motor+neuron+disease.">Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease.</a> Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).</li><li>McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-derived+precursors+generate+myelinating+Schwann+cells+for+the+injured+and+dysmyelinated+nervous+system.">Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system.</a> J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).</li><li>LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Neural Crest. , (1999).</li><li>Tumbar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303, 359-363 (2004).</li><li>Roh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-potentiality+of+a+new+immortalized+epithelial+stem+cell+line+derived+from+human+hair+follicles.">Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

שיטות הבידוד ותרבות התאים שתוארו הן לשעתק ויציבות. לנו שנוצרנו NCSCs מעשרות אנשים ברחבי טווח גילים רחב. למרות זאת הוא הכי טוב לעבד את הרקמה מייד לאחר קציר רקמה, מצא כי רקמות קרקפת יכולות להיות מאוחסנות בבטחה בתקשורת על קרח לתחבורת לילה עם השפעה מינימאלית על כדאיויות תא. ...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11965-092</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM/F12</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11330-32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat-inactivated FBS</td>
 <td>Hyclone</td>
 <td>SH30071.03</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27 supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504044</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N2 supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502048</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>PHG0026</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGF</td>
 <td>R&amp;D system</td>
 <td>236-EG-01M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IGF-I</td>
 <td>R&amp;D system</td>
 <td>291-G1-050</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>25300-054</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17105041</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15070063</td>
 </tr>
 </tbody> 
</table>
Table 1.

isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles

זקיקי שיער עוברים צמיחה לכל חיים ומחזור השיער הוא תהליך מבוקר היטב מעורב שגשוג ורגיעה לתאי גזע. בליטת שיער היא נישה מאופיינת היטב לתאי גזע בוגרי 1. זה קטע של נדן השורש החיצוני מכיל מספר סוגים שונים של תאי גזע, כוללים תאי אפיתל גזע 2, בתאי גזע מלנוציט 3 ו רכס עצבי כמו תאי גזע 4-7. זקיקי שיער מייצגים מקור נגיש ועשיר לסוגים שונים של תאי גזע אנושיים. אנחנו ואחרים מבודדים תאי גזע עצביים לפסגה (NCSCs) מזקיקים עובריים ובוגרים שיער אדם 4,5. תאי גזע אנושיים אלו הנם תווית ייצוב תאים ומסוגלים התחדשות עצמית באמצעות חלוקת תאים סימטריות במבחנה. הם מבטאים סמנים בשלים עצביים רכס סלולריים אך לא סמני בידול. מחקר פרופיל הביטוי שלנו הראה שהם חולקים דפוסי ביטוי גנטי דומים עם העור העכברי העצבי cre לא בוגרתאי רחוב. הם מפגינים multipotency המשובט שיכול להצמיח שושלות תאים myogenic, melanocytic, ולאחר עצביות בתרבות תא הבודדה המשובטת מבחנה. תאים מובחנים לא ירכשו רק סמני שושלת ספציפיים אלא גם להדגים פונקציות מתאימות בתנאי vivo לשעבר. בנוסף, NCSCs אלו מראים פוטנציאל התמיינות לכיוון שושלות mesenchymal. תאים עצביים מובחנים יכולים להתמיד במוח עכבר ולשמר סמני בידול עצביים. הוכח כי שיער הזקיק נגזר NCSCs יכול לעזור לצמיחה מחודשת עצב, והם משפרים את התפקוד מוטורי בעכברים מושתלים עם תאי הגזע האלה לאחר פגיעה בחוט שדרת transecting 8. יתר על כן, עצבים היקפיים תוקנו עם שתלים של תאי גזע 9, והשתלה של תאים מבשרים עור הנגזרים סמוכים לעצבי sciatic מרוסקים הביא לחידוש יצירת המיאלין 10. לכן, NCSCs הזקיק / עור השיער נגזר כבר הראה תוצאות מבטיחות עבור rטיפול egenerative במודלים פרה. תא סומטי תכנות מחדש לתאי גזע pluripotent מושרים (IPS) הראה פוטנציאל עצום לרפואת רגנרטיבית. עם זאת, עדיין קיימות בעיות רבות עם תאי iPS, ובמיוחד על ההשפעה ארוכת הטווח של אינטגרצית אונקוגן / וירוס וtumorigenicity פוטנציאל של תאי גזע pluripotent לא טופל כראוי. יש עדיין מכשולים רבים כדי להתגבר עליהם לפני שניתן יהיו להשתמש בתאי iPS לרפואת רגנרטיבית. ואילו תאי גזע הבוגרים ידועים כדי להיות בטוח והם כבר בשימוש קליני במשך שנים רבות, כגון השתלת מח עצם. חולים רבים כבר נהנו מהטיפול. תאי גזע בוגרי autologous עדיין תאים מועדפים להשתלה. לכן, תאי גזע הבוגרים הנגישים וניתן להרחבה בזקיקי עור אדם / שיער הם מקור חשוב לרפואת רגנרטיבית.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles at JoVE.com

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

מאמר זה מציג פרוטוקול חזק לבידוד ולתרבות של תאי גזע רכס עצביים מן זקיקי שיער אדם.

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

isolation-culture-neural-crest-stem-cells-from-human-hair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.8K Views.  School of Medicine, University of Pennsylvania. מאמר זה מציג פרוטוקול חזק לבידוד ולתרבות של תאי גזע רכס עצביים מן זקיקי שיער אדם.

Video: Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

הפקה של חילוץ העובר צ&#39;יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...