פרוטוקול מוגדר היטב זה בוחן את נדידת הסמל העצבי העיקרית ביונקים. אנו משתמשים בנדידת סמל עצבי ראשוני כדי לחקור מומים מולדים המשפיעים על הסמל העצבי. גישה זו מאפשרת לנו להעיף מבט מקרוב על תאי הסמל העצבי כשהם מגיחים מתוך הלוח העצבי.
בדיקה של התנהגויות תאים ברקמות הנושאות פיתויים של גנים מוטנטים או לאחר טיפול תרופתי, מאפשרת סינון בריאותי להשפעות של טיפול תרופתי או שינויים סביבתיים במהלך התפתחות עוברית. גישה דומה יכולה לשמש לחקר תאי סמל עצבי הנודדים ללב או למעיים או לחקר תאי גידול גרורתיים. ניחוש האנטומיה של זכות העובר הוא מאתגר.
הרקמות שלה משתנות במהירות רבה במהלך ההתפתחות המוקדמת. אנו מציעים לתרגל מיקרו-דיסקטוריה לפני ביצוע ניסוי גדול. מכיוון שהעוברים חיים ותלת מימדיים, מהירות ודיוק הם קריטיים.
ביום העוברי 8.5, השתמש בכלים סטריליים ופתרונות כדי לקצור את הרחם לתוך מיכל של PBS קר כקרח. חותכים את mesometrium להפריד כל עובר. לנתח את הרחם בזהירות, הפרדת כל נפיחות נשירית.
קצירת העובר בשלב ההתפתחותי הנכון היא קריטית להפחתת השונות ולהגברת ההצלחה בהיתוך הנציל למטריצה כמו גם נדידת תאים. החלק מדפים בין שכבת השריר לרקמה המחוששת של העובר ולהשתמש בזוג מדפים שני כדי להסיר את שכבת השריר. השתמש במקלפים כדי לנקב את decidua בשולי כוח המשיכה mesometrial ולהשתמש בזוג השני של מטלפים לקרוע את הרקמה פתוח בניצב למשיכה.
מקלפים בחזרה את הרקמה העשרונית עם המדפים כדי לדמיין את קרום ricarts לפני הסרת הממברנה בזהירות. סאק החלמון הקרביים יהיה גלוי ועובר יצפה בפנים. הסר את סאק החלמון הקרביים ואת אניון, ולמקם את העובר כדי לאפשר הדמיה של קיפול הראש.
חותכים את הראש לקפל מעל הלב ולגרד את mesoderm הבסיסית כדי להשיג צלחת עצבית נקייה. לאחר מכן יש לנתח גבולות לוח עצבי. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, להעביר את הצלחת העצבית ניתוק על צלחת מצופה הידרוג'ל מלא בינוני סמל עצבי מותנה בעדינות מערבל את המנה כדי למקם את הצלחת העצבית באמצע באר.
לאחר מכן הדגירה את הלוח העצבי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לתקופת הזמן הניסיונית המתאימה. ב 24 שעות לאחר explanting, למקם את צלחת תרבות הרקמה לתוך מחזיק הדגימה של מיקרוסקופ ניגודיות פנים, וקלטת במורד מכסה הצלחת ומחט פחמן דו חמצני כדי למנוע רעידות במהלך רכישה מרובת בארות. לאחר מכן התמקדו בתאי הפסגה העצבית הגולגולתית בהגדלה של פי 10 עם טבעת פאזה תואמת במצומד שנבחר.
כדי לכמת את יכולת הנדידה של תאי הפסגה העצבית, הגדר את המיקרוסקופ לרכוש מסגרת אחת כל חמש דקות בהגדלה של פי 10. כדי לכמת מורפולוגיה של תאים, הגדר את המיקרוסקופ כך שיזך פריים אחד לדקה בהגדלה של פי 40. כדי לכמת את הדינמיקה של לאמליפודיה, הגדר את המיקרוסקופ לרכוש מסגרת אחת כל 10 שניות למשך 10 דקות בהגדלה של פי 40.
עבור הדמיה מרובת בארות, הגדר את השלב המכאני לעבור בין עמדות עניין נבחרות X, Y, ולאשר כי תאי פסגת העצב הגולגולת נמצאים בפוקוס כי עמדות הבמה נכונות. לאחר מכן לחץ על רכוש כדי להתחיל את דימות הזמן לשגות. למעקב אחר תאים בודדים, פתחו את image J וייבאו את הנתונים כקבצי מחסנית tiff.
שנה את רמות הכיוון והבהירות והניגודיות ולחץ על נתח והגדר קנה מידה כדי לכייל את קובצי stk הנקודות במיקרומטרים של פיקסלים בהתאם להגדרות המיקרוסקופ. לחץ על תוספים, מעקב ומעקב ידני כדי לפתוח את התמונה J ידני מעקב אחר תאים תוסף ובחר להוסיף רצועה כדי להתחיל מעקב אחר תאים. לאחר מכן עקוב אחר תאים דרך כל המסגרות של סרטים לשגות בזמן באמצעות הגרעין כנקודת התייחסות.
כדי להעריך את יכולת הנדידה של סמל העצבי, פתח תוכנה מתאימה לניתוח העברה ולחץ על הכרטיסיה נתוני ייבוא כדי לייבא את נתוני המעקב אחר תאים כקובץ txt נקודה. תחת ערכות נתונים ואתחול, בחר את מספר הפרוסות או המסגרות שיש לנתח והגדר את כיול X Y ואת מרווח הזמן בין המסגרות. בחר החל הגדרות כדי לשמור את ההגדרות.
לאחר מכן בחר את סמל נתוני ההתוויה כדי ליצור התוויות מסלול ובחר את הסמל הסטטיסטי כדי לכמת את המרחק ואת מידות המהירות. כדי לכמת אזור ועגול של תאי סמל עצבי, פתח את תמונה J ותחת ניתוח והגדר מידות, לחץ כדי לבחור את הפרמטרים של צורת התא, אזור התא, ההיקף ומתאר הצורה. השתמש בכלי בחירת היד החופשית כדי לצייר חלוקה לרמות באופן ידני סביב כל תא באמצעות גבולות קרום התא כמדריך.
הקש Control+B מקשים בלוח המקשים כדי לשמור על שכבת-על של קו מיתאר התא בתמונה וחזור על הפעולה עבור כל תא לאורך כל זמן. לחץ על שכבת-על של תמונה כדי להגיע למנהל העניין ולבחור את תאי העניין. לאחר מכן לחץ על מדידה כדי להשיג את הערכים עבור הפרמטרים של צורת התא שנבחרה מעניינים.
בתוך 24 שעות של הסבר ותרבות, אזור של סמל עצבי אפיתל טרום נודד ניתן לראות בבירור להקיף את הלוח העצבי explant. יתר על כן, תת-תפוסה של תאי סמל עצבי תעבור אפיתל למעבר mesenchymal ותופיע mesenchymal מלא. תרבות הסבר מצופות הידרוג'ל על בסיס מטריצה חוץ-תאית או פיברונקטין, יוצרות מבני הסבר דומים המורכבים מפסגות עצביות נודדות ואוכלוסיות של תאי סמל עצבי נודדים.
עם זאת explants מצופים fibronectin לייצר תאים עם lamellipodia בולט יותר בקצה המוביל של התא לכאורה מקוטב יותר בכיוון הנדידה. מיקרוסקופיה לשגות זמן מאפשר מעקב של X, Y קואורדינטות של תאים בודדים וניתוח של נדידת תאים סמל עצבי וניתוח של דינמיקה מורפולוגיה של תאי סמל עצבי גולגולתי לאורך זמן. על-ידי מיתאר קרום תא בודד, ניתן לחשב את אזור התא ואת מידות ההיקף מכל מסגרות הסרטים כדי לאפשר כימות עוקב של אזור התא ועגוליות של תאים בודדים וקבוצות תאים.
שים לב כי כמו התאים נודדים מן explant, אזור התא גדל באופן משמעותי בעוד מעגליות התאים נשאר קבוע יחסית, מה שמרמז כי כמו תאים לצאת מקצה האפיתל ולאבד תאים למגע תא, הם מראים שטח התפשטות תאים מוגברת. שים לב במיוחד לגרד את mesoderm הבסיסית כדי להשיג צלחת עצבית נקייה, כמו זה מקדם את הנדידה של תאי סמל עצבי מן הרקמה. טכניקות רבות אחרות כגון immunostaining, RTPCR, או ניתוח תא יחיד יכול להתבצע כדי לנתח חלבונים שונים או גנים של עניין בקרב אוכלוסיות שונות של תאי תרבות.
אנו מעוניינים לחמניות התפתחותיות של כמה גנים נוירובלסטומה מפתח שעשויים להיות מעורבים בנדידת תאים סמל עצבי באמצעות גישה זו לחקר גנים של מחלות אנושיות.
