ברצוננו להודות מארק ווזניאק לסיוע וידאו. אנו רוצים גם להודות שון מוריסון ב UT Southwestern בפרוטוקול המקורי של עכברים לתאים culturing NC. עבודה זו נתמכה הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט מרכז התמיכה של תוכנית אקדמית על ידי תרומות של NIH (HD36720 HD036720 ו-11S109) ו 11GRNT7690040 AHA ל PAL, מלגות predoctoral של AHA (0615209B) ו-NIH (NS065604) לווייטנאם, היה ה-ERP נתמך על ידי מתן הכשרה NIH T32HD007502.

1. הכנת פלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה סטרילית בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן fibronectin (FN) על ידי דילול 100 μL מלאי אדם FN פלזמה לתוך נפח סופי של 3.3 מ&quot;ל ב PBS Dulbecco של (dPBS). הריכוז הסופי הוא 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​וזה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים תחתית של כל אחד בצלחת סטרילית התרבות 4 רקמות היטב עם פתרון FN ולתת לשבת במשך 15 דקות. ודא את כל פני השטח מכוסה. הפוך את התקשורת במהלך תקופה זו (שלבים 2 ו -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לחוץ Fn פתרון ולאפשר צלחות לייבוש. בעדינות ולשטוף בארות עם 500 DMEM μL, הסר DMEM, ולהוסיף 500 μL של התחדשות עצמית (SR) בינוני (ראו להלן). דגירה על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכילה 5 אחוז CO 2. להשלים כשעה לפני החיתוך כך הצלחות יהיה יבש לפני השימוש. </li></ol> 2. הכנת בינוני SR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות של NC מחנק והגומתוך עשרה עוברי (כ 1 המלטה, בהתאם לרקע הגנטי של הקו העכבר), להכין 25 מ&quot;ל של מדיום SR. שלב 12.5 מ&quot;ל גלוקוז נמוכה DMEM, 7.5 מ&quot;ל Neurobasal בינוני, 25 חומצה retinoic μL (117 מיקרומטר הריכוז הסופי), ו 25 μL 2-mercaptoethanol (50 mM הריכוז הסופי). מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף צ&#39;יק 3.75 מ&quot;ל תמצית העובר, 250 μL N 2 תוספת מלח, 500 μL תוסף B27 ו 250 μL פניצילין, סטרפטומיצין (הריכוז הסופי 1%). סינון בינונית דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 IGF1 סטרילית μL (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ריכוז סופי) ו - 20 bFGF סטרילית μL (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בריכוז הסופי). מערבבים על ידי היפוך. לאחסן ב 4 ° C. </li></ol> 3. הכנת בינוני Wash <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כ 10 עוברים להכין 50 מ&quot;ל של מדיום שטיפה. שלב 50 מ&quot;ג BSA עם 35 מ&quot;ל גלוקוז DMEM נמוך, בינוני 15 מ&quot;ל Neurobasal, ו 500 μL פניצילין, סטרפטומיצין (1% ריכוז סופי). מסנן סטריליים עם 0.22מיקרומטר הסינון. </li></ol> 4. הכנת collagenase / dispase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase / dispase עד 5 dPBS מ&quot;ל. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק מסנן עם 0.2 מיקרומטר לסנן ולהוסיף 1.5 מ&quot;ל לתוך כל אחת משלוש הבארות של צלחת 12 באר. פיפטה כ 1 מ&quot;ל בינוני לשטוף את הבארות הנותרות. אחסן את כל הצלחת על הקרח עד מוכנים לעכל את הרקמה גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור קצות קצה פיפטה P20 ו p1000 מסנן בסכין גילוח סטרילית. גזור מתחת הקצה המחודד של קצה. לחתוך את p1000 ישמש להעביר את העובר כולו תוך P20 ישמש להעברת פיסות רקמה מבודדת. </li></ol> 5. בידוד מחנק צינור Trunk עצבית מ 9.5 עוברים DPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הריונות זמן קבועים, סכרים עם תקע הנרתיק נחשבים 0.5 DPC בצהריים בבוקר תקע הוא ציין. להקריב את ולהסיר את הרחם ב 9.5 DPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את decidua מהרחם בעדינות Remove העובר מן decidua. חוויתי פעם אחת עם פרוטוקול זה, לבודד 3-4 9.5 עוברים DPC בכל פעם dPBS סטריליים. השתמש בטכניקה סטרילית ומכשירים הנתיחה מעוקרות. מכשירים ניתן לעקר על ידי עיקור, מעוקר חום או דגירה של אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הקדמי מחנק NC: באמצעות מחטים אינסולין, לחתוך את הצינור העצבי על placode otic באמצע. חותכים שוב בקצה האחורי של somite 4 ה. חתוך הרקמה הגחון כדי הצינור העצבי להסיר את הקשתות הגרון והלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור NC הגזע: באמצעות מחטים אינסולין, להסיר את החלק של הצינור העצבי בין somites 16-22 (או somite האחרון אם הם עוברים שלב התפתחותי מוקדם יותר מאשר 22 somite). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את שק החלמון וכל רקמה עוברית הנותרים עבור genotyping. </li></ol> 6. הסרת האאקטודרם ללא עצבית והמזודרם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצינור העצבי המכיל קטעים לתוך collagenase / dispase בטמפרטורת החדר למשך 10 דקותs. מיד לשטוף בינוני לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור רקמות dPBS סטריליים. שימוש במחטים סטריליות אינסולין, הוצא בעדינות האאקטודרם לא העצבית מרקמת ולהפריד את somites מן הצינור העצבי. החלקים האחרונים של והמזודרם מרקמות somite ניתן להסיר על ידי triturating בעדינות באמצעות חתך למטה P20 עצה. להיזהר לא לפגוע בצינור העצבי. להתבונן מקרוב במהלך טחינה דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור העצבי מבודד באמצעות שטיפה 2 ו 3 2 30 בינוני לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעם בינוני SR, ומקום בצינור העצבי מבודד למרכז גם FN מצופה שהוכנה קודם לכן (שלב 1.3). ללחלח את החדר היפוקסיה עם צלחת של מים סטריליים. מניחים את הצלחת לתוך תא היפוקסיה ולשטוף את החדר בגז מעורבת על 3% O 2 (להשתמש במיכל המכיל תערובת של 1% מ 2, 6% CO 2, 93% N 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד להתמודד עם הקאמרית מאוד בזהירות כדי להבטיח thaexplants T הם באין מפריע ולהישאר במרכז וולס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 37 ° C. סיכום של צעדים 5-6 מוצג באיור 1. </li></ol> 7. הסרת בצינור העצבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של דגירה, הסר בצינור העצבי על ידי בעדינות מתגרה קצה הצינור העצבי מן התאים הנודדות באמצעות מחט סטרילית אינסולין. הסר וזורקים בצינור העצבי ממדיום באמצעות חתך P20 סטרילית כמו בשלב 6.2 ולהחליף בינוני עם בינוני SR טרי (איור 2). הדבר נעשה בקלות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. </li></ol> 8. נציג תוצאות לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס בתנאי חוסר חמצן, תאים צפון קרוליינה היגרו מן הצינור העצבי באוכלוסייה טהור כמעט (איור 3 א). לפעמים, פחות תרבויות אידיאליים לא תניב בצמחים חזקים. לדוגמה, ייתכן כי לאחר 24 שעות לאהוא בצינור העצבי יהיה מכורבל על עצמה ו NC לא יעברו מן הצינור העצבי (איור 3 ב). מדי פעם בצינור העצבי לא יצרף את הצלחות מצופה fibronectin. מניסיוננו, תת אופטימלית הגירה NC או בעיות עם החיבור של הצינור העצבי יכול להיות מושפע לרעה בתנאי normoxia או ריכוז של fibronectin, בהתאמה. הפעילות האנזימטית של collagenase / dispase משתנה מעט על ידי אצווה זמן עיכול חייב להיות מותאם כראוי, לעומת זאת, לא לעכל את הרקמה יותר מרבע שעה. Overdigestion של הצינור העצבי המכיל רקמות collagenase / dispase תגרור בצמחים לקויה. אם הרקמה somite לא יוסר בקלות לאחר דגירה של collagenase / dispase של הצינור העצבי, הצינור העצבי ניתן מודגרות למשך זמן ארוך יותר מעשר דקות. לפעמים בצינור העצבי לא לצרף המצע. אם זה המקרה, בדוק fibronecפח ריכוז ותנאי חוסר חמצן. למרות התנאים normoxic ניתן wild-type תרבות NC, תנאי חוסר חמצן לחקות באופן הדוק יותר בסביבה vivo 29,30. מניסיוננו, בתנאי חוסר חמצן הפכה קריטית כאשר culturing מוטציה NC. לדוגמה, כאשר Foxd3 מוטציה NC היו בתרבית בתנאים normoxic, היה המטען NC תוצאה תא הקטינה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת. פער זה בגודל תוצאה הוסר כאשר explants היו בתרבית בתנאי חוסר חמצן (איור 4). יתר על כן, כאשר wild-type explants בצינור העצבי היה מתורבת normoxia, מספר caspase-חיוביים בתאים היה גדול יותר מזה של explants דומים בתרבית היפוקסיה (מידע לא מוצג). על ידי שמירה על כל התרבות NC ב היפוקסיה, השוואות יכולים יותר בקלות בין הדינמיקה של שליטה ותרבויות מוטציה. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig1.jpg" alt="איור 1" /> <strong<html> &gt; באיור 1. סכמטית כוללת של בידוד NC. א) לנתח אזורים של עניין מן העובר. ב) לקט בצינור העצבי של collagenase / dispase עשר דקות (לא יעלה על רבע שעה). ג) לשטוף בינוני לשטוף. D) לנתח משם האאקטודרם לא עצבית והמזודרם. EF) לשטוף פעמיים בינוני לשטוף. ז) צלחת בינונית התחדשות עצמית. דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב 3% O 2 בתנאי חוסר חמצן. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הסרת בשלבים של הצינור העצבי מן explant. הצינור העצבי יש להסיר לאחר 24-48 שעות על מנת למנוע זיהום עם לא-NC תאים. א) הודעה הגבול בין הצינור העצבי ואת תולדה NC (קו מוצק). ב) גזור לאורך הקצה של הצינור העצבי עם מחט האינסולין. ג) מחק בצינור העצבי ולהחליף בינוני עם בינוני עצמית חדשה והתחדשות. קו מקווקו מציין היקף תוצאה. קיצור: NT, בצינור העצבי. &gt; <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. דוגמאות מייצגות תוצאות. א) תוצאה explant בדרך כלל אחרי 24 שעות הדגירה במדיום התחדשות עצמית בתנאי חוסר חמצן (קו מקווקו מציין היקף תוצאה). ב) יתגדל לאור תוצאה NC לאחר 48 שעות בתרבית. ג) תרבות אידיאלי פחות עם תשואה תוצאה נמוכה. A ו-C היו בתרבית בתנאים זהים. תמונות להדגים את טווח טבעי חוסן התרבות. זה יכול להיות מושפע יעילות הבידוד בצינור העצבי, ריכוז של FN, תנאי חוסר חמצן, ולאחר זמן collagenase / dispase digestions. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. בניתוח חוץ גופית של תרבויות צפון קרוליינה explant ב normoxia לעומת היפוקסיה. בקרה (סוג בטבע) צפון קרוליינה התאים נדדו מן explants בצינור העצבי לאחר 48 שעות בתנאים תרבות normoxic. לעומת זאת, מוטציה Foxd3NC לא פחותה בהרבה בצמחים תא normoxia (סימן אדום לרמות שולי בצמחים NC). כאשר explants דומים גדלו בתנאי חוסר חמצן, Foxd3 מוטציה explants צפון קרוליינה גברה comparably לבקרות, המאפשר ניתוח שלאחר מכן. שימו לב, התנהגות זו קשורה גם עם התנהגות של Foxd3 מוטציה NC in vivo.

<ol>
	<li>Le Douarin, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neural crest. , (1999).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Developmental biology. 344, 566-568 (2010).</li><li>Saint-Jeannet, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural crest induction and differentiation. , (2006).</li><li>Plank, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+and+timing+of+arrival+of+murine+neural+crest+on+pancreatic+beta+cell+development+and+maturation.">Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation.</a> Developmental biology. 349, 321-330 (2011).</li><li>Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+neural+crest+regulate+beta-cell+mass+in+the+pancreas.">Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas.</a> Development. 135, 2151-2160 (2008).</li><li>Freem, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+innervation+of+the+lung+is+derived+from+neural+crest+cells+as+shown+by+optical+projection+tomography+in+Wnt1-Cre;YFP+reporter+mice.">The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice.</a> J. Anat. 217, 651-664 (2010).</li><li>Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+approach+to+the+problem+of+neural+crest+determination.">A clonal approach to the problem of neural crest determination.</a> Developmental biology. 46, 262-280 (1975).</li><li>Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+quail+neural+crest+cells:+they+are+pluripotent+and+differentiate+in+vitro+in+the+absence+of+noncrest+cells.">Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells.</a> Developmental biology. 80, 96-106 (1980).</li><li>Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+precursors+for+neural+and+mesectodermal+derivatives+in+the+cephalic+neural+crest.">Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest.</a> Development. 112, 301-305 (1991).</li><li>White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+undergo+cell-intrinsic+developmental+changes+in+sensitivity+to+instructive+differentiation+signals.">Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals.</a> Neuron. 29, 57-71 (2001).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+avian+neural+crest:+migration+and+maturation+of+mixed+neural+crest+clones+injected+into+host+chicken+embryos.">Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos.</a> J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).</li><li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest.">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).</li><li>Chung, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+property+of+postmigratory+cranial+neural+crest+cells+and+their+utility+in+alveolar+bone+regeneration+and+tooth+development.">Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development.</a> Stem Cells. 27, 866-877 (2009).</li><li>Biernaskie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKPs+derive+from+hair+follicle+precursors+and+exhibit+properties+of+adult+dermal+stem+cells.">SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).</li><li>Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P0+and+PMP22+mark+a+multipotent+neural+crest-derived+cell+type+that+displays+community+effects+in+response+to+TGF-beta+family+factors.">P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors.</a> Development. , 126-3781 (1999).</li><li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+and+isolation+of+enteric+nervous+system+progenitors+using+Sox2.">Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2.</a> Stem Cells. 29, 128-140 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+in+reduced+levels+of+oxygen+promotes+clonogenic+sympathoadrenal+differentiation+by+isolated+neural+crest+stem+cells.">Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells.</a> J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).</li><li>Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+clonal+analysis+of+mouse+neural+crest+development.">In vitro clonal analysis of mouse neural crest development.</a> Developmental biology. 157, 517-525 (1993).</li><li>Etchevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+chick,+mouse+or+human+neural+crest+cells.">Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells.</a> Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).</li><li>Mundell, N. A., Labosky, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cell+multipotency+requires+Foxd3+to+maintain+neural+potential+and+repress+mesenchymal+fates.">Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates.</a> Development. 138, 641-652 (2011).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development. 133, 99-106 (2006).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling+is+essential+for+cranial+neural+crest+migration+and+trigeminal+ganglion+condensation.">Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation.</a> Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph/ephrins+and+N-cadherin+coordinate+to+control+the+pattern+of+sympathetic+ganglia.">Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia.</a> Development. 133, 4839-4847 (2006).</li><li>Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin/neuropilin+signaling+influences+the+positioning+of+migratory+neural+crest+cells+within+the+hindbrain+region+of+the+the+chick.">Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick.</a> Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).</li><li>Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+1+signaling+guides+neural+crest+cells+to+coordinate+pathway+choice+with+cell+specification.">Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).</li><li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function.">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).</li><li>Ivanovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+or+in+situ+normoxia:+The+stem+cell+paradigm.">Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm.</a> J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן בשלב ההתפתחותי של העובר על מנת להבטיח את ההצלחה של גישה זו. ספירת somites של עוברי עכברים מוקדם הוא קריטי גם לשלב התאמת עוברים בתוך פסולת וקביעת אזורים הנכונות של הצינור העצבי של בידוד. וריאציה של אחד או שניים somites בין העוברים נמצא בטווח סביר ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM (גלוקוז נמוכה) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal בינוני </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A3912-10G </td><td></td></tr><tr><td> dPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> IGF1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354037 </td><td> חנות 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> BD Biosciences </td><td> 354060 </td><td> חנות 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Gibco </td><td> 33016-015 </td><td> מאוחסן 1mg/mL אלiquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Retinoic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> R2625 </td><td> חנות 35 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​aliquots לאחר לשחזר באתנול ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> סיגמא </td><td> D-5637 </td><td></td></tr><tr><td> N 2 תוספת </td><td> Gibco </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> תוסף B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Steriflip 0.22 מיקרומטר מסננים </td><td> Millipore </td><td> SCGP00525 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> מסננים 0.20 מיקרומטר </td><td> קורנינג </td><td> 431219 </td><td></td></tr><tr><td> מזרקים (לסינון) </td><td> BD Biosciences </td><td> 301604 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> ארבע צלחות גם </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> רוש </td><td> 269 ​​638 </td><td> פעילות משתנה לפי אצווה. חנות 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> אינסולין מחטים (29 מד ½) </td><td> בקטון דיקסון </td><td> 309306 </td><td></td></tr><tr><td> היפוקסיה הקאמרית </td><td> Billups-רוטנברג </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חמצן Analyzer </td><td> Billups-רוטנברג </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים # 5 </td><td> מדע כלים עדינים </td><td></td><td> להסרת הרחם decidua. </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA (0.25%) </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube

עובריים עצביים לפסגה (NC) היא האוכלוסייה אבי multipotent שמקורו ב היבט הגב של הצינור העצבי, עובר אפיתל המעבר mesenchymal (EMT) ו נודד ברחבי העובר, והוליד סוגי תאים שונים 1-3. NC גם יש את היכולת הייחודית להשפיע על התמיינות והתבגרות של אברי המטרה 4-6. כאשר explanted במבחנה, אבות צפון קרוליינה לעבור עצמית והתחדשות, להעביר להתמיין למגוון של סוגי רקמות כולל נוירונים, גליה, תאים שריר חלק, סחוס ועצמות. Multipotency NC תוארה לראשונה מ explants של הצינור העצבי העופות 7-9. בבידוד מבחנה של תאים צפון קרוליינה מאפשר לימוד NC Dynamics כולל התפשטות, הגירה, ו multipotency. עבודה נוספת במערכות העופות ואת העכברים הראו כי explanted תאים צפון קרוליינה NC לשמור על הפוטנציאל שלהם כאשר מושתלים בחזרה העובר 10-13. בגלל מאפיינים אלה הסלולר הטמונות נשמרים explanted אבות צפון קרוליינה, assay עצבית explant הצינור מספק אופציה אטרקטיבית ללימוד NC במבחנה. כדי להשיג הבנה טובה יותר של NC יונקים, שיטות רבות הועסק לבודד אוכלוסיות NC. NC-derived אבות יכול להיות מתורבת מתוך הפוסט נודדות למקומות בעובר וגם למבוגרים ללמוד את הדינמיקה של פוסט נודדות אבות צפון קרוליינה 11,14-20 עם זאת הבידוד של אבות צפון קרוליינה כפי שהם להגר הצינור העצבי מספק שימור מיטבי של NC תא הפוטנציאל ומאפיינים נודדות 13,21,22. פרוטוקולים מסוימים להעסיק תא הקרינה מיון מופעל (FACS) כדי לבודד את האוכלוסייה NC מועשר עבור אבות מסוימים 11,13,14,17. עם זאת, כאשר החל עוברים בשלבים מוקדמים, מספרים סלולריים הולמים עבור ניתוחים קשה להשיג עם FACS, שמסבך את בידודה של צפון קרוליינה מוקדם populatioNS מעוברים בודדים. כאן, נתאר גישה זו אינה מסתמכת על FACS ותוצאות ב האוכלוסייה כ 96% טהור NC על פי כתב Wnt1-Cre שושלת הופעל 23. השיטה המוצגת כאן הוא עיבוד פרוטוקולים מותאם לתרבות של עכברוש NC 11,13. יתרונותיה של פרוטוקול זה לעומת שיטות קודמות הן כי 1) התאים לא גדלים על שכבה מזין, 2) FACS לא נדרש לקבל האוכלוסייה טהור יחסית NC, ​​3) premigratory תאים צפון קרוליינה מבודדות 4) התוצאות בקלות לכמת. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש הבידוד של צפון קרוליינה מהמודל כל עכבר מוטנטי, להקל על מחקר של מאפיינים צפון קרוליינה עם מניפולציות גנטיות שונות. הגבלה של גישה זו היא כי NC מוסר בהקשר של העובר, אשר ידוע להשפיע, הישרדות הגירה והבחנה של NC 2,24-28.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube at JoVE.com

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את השימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; שיטות לחקר ההגירה, התחדשות עצמית, ו multipotency של הרכס העצבי.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

isolation-culture-neural-crest-cells-from-embryonic-murine-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.1K Views.  Vanderbilt University Medical Center. הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את השימוש במבחנה שיטות לחקר ההגירה, התחדשות עצמית, ו multipotency של הרכס העצבי.

Video: Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

הפקה של חילוץ העובר צ&#39;יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). However, the study of mouse embryos in utero is limited by our inability to directly pharmacologically manipulate the embryos in isolation from the effects of maternal metabolism on the reagent of interest. Whether using a small molecule, recombinant protein, or siRNA, delivery of these substances to the mother, through the diet or by injection will subject these unstable compounds to a variety of bodily defenses that could prevent them from reaching the embryo. Investigations in cultures of whole embryos can be used to separate maternal from intrinsic fetal effects on development.
Here, we present a method for culturing mouse embryos using highly enriched media in a roller incubator apparatus that allows for normal neural tube closure after dissection (Crockett, 1990). Once in culture, embryos can be manipulated using conventional in vitro techniques that would not otherwise be possible if the embryos were still in utero. Embryo siblings can be collected at various time points to study different aspects of neurulation, occurring from E7-7.5 (neural plate formation, just prior to the initiation of neurulation) to E9.5-10 (at the conclusion of cranial fold and caudal neuropore closure, Kaufman, 1992). In this protocol, we demonstrate our method for dissecting embryos at timepoints that are optimal for the study of cranial neurulation. Embryos will be dissected at E8.5 (approx. 10-12 somities), after the initiation of neural tube closure but prior to embryo turning and cranial neural fold closure, and maintained in culture till E10 (26-28 somities), when cranial neurulation should be complete.

A method allowing for direct pharmacological manipulation of mouse embryos during neurulation that bypasses maternal metabolism is described. The technique can be adapted to study different aspects of neurulation by varying the time point and pharmacological agent.

Tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

<meta charset="utf8"></head><body>נוקלאופקציה יעילה של NSCs מבודדים מהאזור התת-חדרי של מורין

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>זרקור המחבר: נוקלאופקציה משופרת להעברת גנים ביעילות גבוהה בתרביות תאי גזע עצביים שמקורם באזור תת-חדרי של מורין

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...