עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות RO1-GM085130 ואת הקרן הלאומית למדע MCB0929394. אנו מודים לד&quot;ר שמידט מריון על האירוח שלה עבור ומאפשר לנו הסרט במעבדה שלה.

1. הכנה של ריאגנטים footprinting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ התגובה 10x המכיל נתרן 100 mM cacodylate, 1 mM EDTA, ו 1 M KCl. התאם את ה-pH ל -7.4. סנן החיץ באמצעות אצטט 0.2 מיקרומטר מסנן למכשיר (Nalgene). הערה: לא RNA pipet ישירות לתוך חוצץ 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת התגובה טיטרציה עבור כל תגובה כמפורט בטבלה 1. נפח לערבב טיטרציה (1x חיץ Mg (II) בריכוז הרצוי) צריך להיות 90 μl, לפני הוספת 10μl של רנ&quot;א במאגר 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ T1 RNAse העיכול המכיל אוריאה 6.63M, ציטרט הנתרן 20mm, 1mm EDTA, 0.25 מיקרוגרם / μl tRNA, cyanol קסילן 0.025%, וכחול bromphenol 0.025%. חיץ זה ניתן לאחסן 4 ° C עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת פנטון דורשת תמיסות מימיות המוכן טרי של 250 מ&quot;מ Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 mM EDTA, נתרן 500 mM ו-L-ascorbate. ריכוזים ציינו בפרק 1.5 הם אופטימליים עבור ניסויים שיווי משקל חיץ כגון cacodylate נתרן שאינו לחפש רדיקלים ומגוונים ריכוזי יון divalent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים עבור התגובה (1.5.2) peroxidative (1.5.1) ו footprinting חמצוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובה peroxidative פנטון דורשת תמיסות מימיות של פתרון מוכן טרי 100 Fe-EDTA מ&quot;מ, ו 50 נתרן mM L-ascorbate ו -1.5% H 2 O 2. הפתרון Fe-EDTA הוא מוכן על ידי ערבוב Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 עם EDTA יש פי 1.1 עודף של EDTA על ברזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני שיזם את התגובה מחשוף חמצוני (3.4.2), ליצור את התמהיל התגובה פנטון על ידי שילוב של 2 μl Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 מ&quot;מ), 2.2 μl של EDTA (250 מ&quot;מ), 62.5 μl נתרן L-ascorbate (500 מ&quot;מ), 22.5 תגובה μl חיץ 10x ו 135.5 μl של H 2 O להגיע אל ריכוזי הסופי בתערובת footprinting תגובה (3.4.2) של 0.10 מ&quot;מ, 0.11 מ&quot;מ, 6.61 מ&quot;מ, בהתאמה. </li></ol></li></ol> 2. RNA הכנה לקראת ניסוי footprinting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA יכול להיות מיוצר על ידי תקן שעתוק במבחנה של תבניות DNA 6 או, אם פחות מ 50 נוקלאוטידים, ניתן לרכוש (למשל ב-DNA משולב טכנולוגיות, www.idtdna.com). עקבו מומלץ ניקיון נהלים מעבדה כדי לשמור על שלמות מדגם של רנ&quot;א במהלך הניסויים footprinting 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dephosphorylation 8 של במבחנה RNA עיבד הכרחי לפני תיוג 32 P הסוף &quot;5 של רנ&quot;א. 10 pmol של רנ&quot;א הם סוף שכותרתו ידי kinasing. 9 הפתרון צריך להיות מעונן לאחר איון מוצלח של phosphatase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר RNA מסומן רדיואקטיבית בעזרת ג&#39;ל אלקטרופורזה denaturing. רנ&quot;א הוא התאושש לאחר מכן על ידי שתי עקירות באמצעות ג&#39;ל 0.3 נתרן אצטט M (pH 5.5). RNA הוא זירז ידי ערבוב 0.5 פתרון מ&quot;ל מימית עם אתנול 1 מ&quot;ל ובעקבותהדגירה דקה 1 על קרח יבש. ספין מדגם ב 4 ° C, 12,500 סל&quot;ד עבור 0.5 שעות. בטל supernatant ולשטוף RNA גלולה עם אתנול 70%. הסר supernatant לאחר צנטריפוגה נוספים יבש גלולה בחלל ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את P-32 שכותרתו דגימות רנ&quot;א ul 330 μl של 1x Buffer.Pipet 30 הפתרון RNA בצינור תגובה, המשקע עם אתנול ו-RNA יבש בחלל ריק; לשמור על צינור להפקת הסולם הפניה (שלב 3.5). לפגל הפתרון שנאגרו RNA על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מגניב דגימות לטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ולתת סיבוב מהיר כדי להפיל את ותרכיזים על העפעפיים של צינורות אל הפתרון. </li></ol> 3. ניסוי footprinting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסרק אלקטרופורזה קובע את המספר המרבי של נקודות נתונים לכל ג&#39;ל אנליטית. אנו משתמשים גם מסרק 30. סולם התייחסות תופסת 2 בארות אחד לשלוט uncleaved. הכן 27 מבחנות התגובה. Mg הסופי (II) concentratiתוספות צריכה להיות מחולקת באופן שווה על סולם לוגריתמי פורש סדרי גודל סביב אמצע טיטרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד, דגירה את הרנ&quot;א (II) פתרונות Mg ב 50 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מערבבים 10 μl של פתרון RNA עם μl 90 סכום המקביל Mg (II) במאגר 1x להגיע נפח סופי של 100 μl. דגירה הפתרונות למשך 30 דקות ב 50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הפתרונות לאזן במהירות של 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 תוך קיפול מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Peroxidative (3.4.1) או חמצוני (3.4.2) footprinting הידרוקסיל תגובה קיצונית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את התגובה peroxidative ידי הצבת טיפות של μl 2 Fe-EDTA (100 מ&quot;מ), 2 נתרן μl L-ascorbate (50 מ&quot;מ) 2 μl H 2 O 2 (1.5%) מופרדים זה מזה על החלק הפנימי העליון של התגובה שפופרת המכילה את הפתרון RNA ולהתחיל את התגובה footprinting ידי ערבוב נמרץ. עצור את התגובה לאחר 15 שניות על ידי הוספת 300 μl אתנול אבסולוטי קר. סובבו את הצינורות 3-5 פעמים. , לזרז לרחוץיבש את הכדור כמו בשלב 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את footprintingreaction חמצוני רדיקלי הידרוקסיל ידי הוספת 5 μl של תמהיל פנטון מוכן טרי התגובה (1.6). דגירה למשך 30 דקות במהירות של 25 ° C. הוסף 300 μl של אתנול אבסולוטי קר להרוות את התגובה ומערבבים על ידי סיבוב צינורות 3-5 פעמים. נמהרת, לשטוף ולייבש גלולה כמצוין בשלב 2.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור T1 RNase מדגם לעכל התייחסות פי הנהלים תקן 10 באמצעות פתרון מוכן בשלב 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כדורי רנ&quot;א 8 μl ג&#39;ל טעינת צבע II (AMBION) ולאשר RNA הוא resuspended באמצעות מונה גייגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן denaturing, 8% רצף ג&#39;ל polyacrylamide על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. 11 דגימות טען כולל שתי הפניות שליטה. הפרד RNA שברים ב 60 וואט - 75 וואט עבור 2.5 שעות. לחשוף ג&#39;ל יבשים למסך אחסון זרחן לילה. סריקה זרחן מסך עם מערכת הדמיה עבור autoradiography filmless, למשל. סטורם 865 (GE Healthcare), או טייפון (GE Healthcare). העברת קובץ התמונה ג&#39;ל למחשב. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובתיות רדיקלי הידרוקסיל של כל נוקלאוטיד נקבעת על ידי כימות עוצמת הלהקה על כל ג&#39;ל האנליטי. הורד, התקן ולפתוח ספא, קל לשימוש בתוכנות קוד פתוח עבור הולם הלהקה כימות יחיד. 12, 13 בצע את ההוראות במדריך למשתמש. בקצרה, לטעון את רצף הרנ&quot;א כמו. קובץ txt ואחריו התמונה ג&#39;ל כקובץ. ג&#39;ל. התאם בעוצמות הלהקה, להגדיר את הנתיבים, לבחור במסלול עוגן, ולבצע יישור ג&#39;ל. הקצאה של להקות כדי נוקליאוטידים מתרחשת התייחסות סולם העיכול T1 RNase. לכמת את אינטגרלים הלהקה להשתמש בתכונת נורמליזציה / colorplot לנרמל ולהקצות שאריות משתנה פוטנציאלי. שמור את הפלט כקובץ txt.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספא פלטי גיליון אלקטרוני המכיל עמודות המייצגות נתיבים על הג&#39;ל שורות המייצג את בtegrated צפיפות הלהקה של להקות בודדות המקביל לקטע RNA. ראשית, לזהות את האתרים שבהם הגנה להציג שינוי ניכר בנגישות ממס על ידי השוואת פרופיל הגנה נגזר מדגם לא Mg (II) עם פרופיל של ריכוז נקודת הסיום (II) Mg (50 מ&quot;מ בדוגמא שלנו). הנמך את הערך, המוגן יותר נוקלאוטיד הוא נגד ההתקפה מפני רדיקלים הידרוקסיל ולהיפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור איזותרמות מתקפל מן אינטגרלים הלהקה מנורמל של יחידים או קבוצות של נוקליאוטידים לעומת ריכוז (II) Mg. איזותרמות הם מדורגים בנפרד הרוויה השבר על ידי fi = L + (U - L) • <img src="files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y" /> היכן f מציין את צפיפות משולב של הלהקה (ים) להיות מנותח, L ו-U מייצגים את גבולות העליון והתחתון המעבר ו <img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y" /> היא רוויה חלקיים. 14 הנתונים הם בכושר באמצעות l שאינו ליניאריממזרח לכיכר תוכנית ניתוח (אנו משתמשים גם מקור (OriginLab) או GraphPad (GraphPad תוכנה, Inc).) למשוואה היל (1), <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" /> היכן K d הוא קבוע הדיסוציאציה בשיווי משקל, [ז] מתאים לריכוז של המשתנה כי מתווכת התגובה מתקפלים, Mg (II) בדוגמה זו, H n הוא מקדם היל. זה קשקשים הליך המעבר הרוויה השבר, קובע נקודת האמצע שלה מספק מבחן הפנומנולוגית של אם המעבר הוא sigmoidal. איזותרמות נגזר רצף ג&#39;לים (איור 3A) אשר נותחו על ידי סאפא (איור 3B) ובכושר כמתואר לעיל מוצגים באיור 3C. איזותרמות הרוויה השבר שמוצג באיור 3 נוצרו על ידי דרוג בגיליון אלקטרוני הערכים שנוצרו על ידי ספאא נגד גבולות הטוב העליון והתחתון מתאים (U ו-L) באמצעות חלק במשוואה = ערך / (U - L) - L / (U - L). </li></ol> 5. נציג תוצאות: איור 3 מציג תוצאות נציג P4-P6 RNA • ניסויים OH footprinting. התמונה ג&#39;ל (משמאל) מציין כי המחשוף) הרקע הוא מזערי (נתיב ימין), ב) הקצאה נוקלאוטיד יחיד אפשרי בגלל להקות הגדיר היטב את השביל T1 (RNase cleaves T1 בכל G), ו - ג) רדיקלי הידרוקסיל הפיצול המושרה של RNA הוא הרבה מעל הרקע. המעבר מ נמוך Mg גבוהה (II) המזוהה עם הפחתת צפיפות הלהקה משולבת של בודדים וקבוצות של להקות המעיד על היווצרות של RNA מבנה שלישוני. יחיד או קבוצות של נוקלאוטיד רציף אשר מחשוף שינויים במקביל מכונים &#39;הגנה&#39;. • הגנות OH האופייניים של Mg (II) בתיווך קיפול של P4-P6 RNA מקרוב מתאימות האזורים נגיש ממס של המולקולה שנצפתה המבנה הגבישי שלה. 15 מולקולות רנ&quot;א מקופל ג<html> יש ובמידות שונות מאוד (כלומר, כמה קרוב רקע הירידה בצפיפות הלהקה) של הגנה קשר שלישוני שלא היה בקורלציה עם תופעה מבנית או דינמי ברור. לכן, כמה מולקולות רנ&quot;א יראה מעברים מבנית מוגדרת היטב, כפי שמוצג באיור 3, וחלק לא. עוצמות בנד הם לכמת מנורמל על ידי ניתוח 12 צפא (איור 3B). הפלט הוא מזימה &quot;תרמית&quot; לדמיין את מידת היחסי של הגנה מפני • OH. המעבר צבע מתאר את השינוי על נגישות בנוסף (II) Mg. הלבן מראה אדום או כחול נוקלאוטידים נגיש יותר או מוגנת יותר, בהתאמה. מידת כל של הצללה המזוהה עם ערך מספרי אשר ניתן להתוות כמו עקומת הגנה (איור 3 ג) ונותחו על ידי מודל מחייב כגון המשוואה היל (1). שיווי משקל קבוע דיסוציאציה המזוהים עם הגנת 153-155 הוא בערך כפול מזה של הערך המקביל להגנת 163-164. ontent &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" /> באיור 1. ייצור רדיקלי הידרוקסיל ו P4-P6 קיפול RNA. א) Fe (II) מזרז לייצור של רדיקלים של הידרוקסיל מי חמצן. Ascorbate מפחית Fe (III) חזרה ברזל ברזל. ב) בהעדר Mg (II), מבנה לא P4-P6 שלישוני נוצר, המאפשר רדיקלים הידרוקסיל לחדור לפלח כל הפוזיציות עמוד השדרה נגיש. תוספת של Mg (II) יוזם קיפול של P4-P6, המאפשר רק את עמוד השדרה נגיש ממס להיות ביקע ידי רדיקלים הידרוקסיל. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" /> באיור 2. תמציתי לניסוי footprinting הידרוקסיל רדיקל. Dephophorylation) ו - 32 P 5&#39;-end תיוג של רנ&quot;א. ב) טיהור של 32 P-RNA מסומן על ג&#39;ל polyacrylamide denaturing. ג) כריתה של הלהקה RNA, לאחר מיצוי RNA, משקעים אתנול. D) ו Prefoldingקיפול של רנ&quot;א. ה) תוספת של תערובת פנטון טרי שהוכן התגובה ליצירת רדיקלים הידרוקסיל. F) RNA ההפרדה שבר ידי denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. G) quantitation של שברי RNA על ידי תוכנה סאפא. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" /> באיור 3. ניתוח של שברי RNA לאחר התגובה פנטון peroxidative footprinting. (א) RNA נחשף רדיקלים הידרוקסיל והמוצרים מחשוף נפתרו באמצעות denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד). התמונה מראה המוצרים מחשוף peroxidative עם ריכוז גדל והולך של Mg (II). נתיבי הפניה ושליטה מסומנים. זה קובץ תמונה הוא קלט לתוכנית ספא ​​אשר quantitates נפח הלהקה כל אחד. (ב) מזימה &quot;תרמית&quot; שנוצר על ידי סאפא. (ג) גיליון אלקטרוני של ערכים הנוגעים צפיפות הלהקה משולבת פלט מספר נוקלאוטידים מתוך ספא מנותח על ידי מודל מחייב כגון equati הילעל (1). אזורי הגנה נבחרו על פי להגדיל את צפיפות הלהקה אינטגרלי כפונקציה של ריכוז (II) Mg. ד K הוא הריכוז (II) Mg שבו מחצית RNA הוא מקופל באתר במעקב. מקדם היל, n H, הוא מדד של השיפוע של העקום אשר נותן מידע על cooperativity מחייב מספק הערכה נמוכה יותר עבור מספר יוני מגנזיום מעורב קיפול של האתר המסוים הזה. <img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" /> טבלה 1. כרכים נציג ליצירת דגימות RNA המכיל שונים (II) ריכוזים Mg.

<ol>
	<li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+radical+"footprinting":+high-resolution+information+about+DNA-protein+contacts+and+application+to+lambda+repressor+and+Cro+protein.">Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).</li><li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic+acid+catalyzed+cleavage+of+RNA+and+DNA+oligonucleotides:+similar+reactivity+toward+single-+and+double-stranded+forms.">Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms.</a> Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).</li><li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+higher+order+folding+of+a+catalytic+RNA+molecule.">Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule.</a> Science. 251, 401-407 (1991).</li><li>Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+folding+at+millisecond+intervals+by+synchrotron+hydroxyl+radical+footprinting.">RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting.</a> Science. 279, 1940-1943 (1998).</li><li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+radical+footprinting:+a+high-resolution+method+for+mapping+protein-DNA+contacts.">Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts.</a> Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementing+global+measures+of+RNA+folding+with+local+reports+of+backbone+solvent+accessibility+by+time+resolved+hydroxyl+radical+footprinting.">Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting.</a> Methods. 49, 142-147 (2009).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+endoribonuclease+activity+of+the+Tetrahymena+ribozyme:+enhanced+cleavage+of+certain+oligonucleotide+substrates+that+form+mismatched+ribozyme-substrate+complexes.">Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes.</a> Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).</li><li>Knapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+approaches+to+probing+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure.">Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).</li><li>Slatko, B. E., Albright, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denaturing+gel+electrophoresis+for+sequencing.">Denaturing gel electrophoresis for sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).</li><li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAFA:+semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments.">SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> RNA. 11, 344-354 (2005).</li><li>Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+and+analysis+of+kinetic+*OH+radical+footprinting+data+using+SAFA.">Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA.</a> Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).</li><li>Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+of+monovalent+and+divalent+ion+binding+in+the+folding+of+the+P4-P6+domain+of+the+Tetrahymena+ribozyme.">Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme.</a> Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).</li><li>Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+group+I+ribozyme+domain:+principles+of+RNA+packing.">Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing.</a> Science. 273, 1678-1685 (1996).</li><li>Petri, V., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+nucleic+acids+footprinting:+thermodynamic+and+kinetic+approaches.">Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).</li><li>Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+RNA+compaction:+insights+from+the+equilibrium+folding+pathway+of+the+P4-P6+RNA+domain+in+monovalent+cations.">Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations.</a> J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).</li><li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+DNase+footprint+titration:+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions.">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).</li><li>Shcherbakova, I., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl-radical+footprinting+to+probe+equilibrium+changes+in+RNA+tertiary+structure.">Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).</li><li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly.">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li><li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SHAPE+and+hydroxyl+radical+analysis+of+RNA+structure+and+ribonucleoprotein+assembly.">High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly.</a> Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).</li><li>Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+modeling+of+large+RNA+molecules+with+knowledge-based+potentials+and+structural+filters.">Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters.</a> RNA. 15, 189-199 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Footprinting רדיקלי הידרוקסיל היא כלי רב ערך כדי להעריך את אזור ממס משטח נגיש של חומצות גרעין. היווצרות איכותי וכמותי של מבנה שלישוני 14 ניתן בעקבות כפונקציה של פרמטרים כגון סוג הריכוז יונים, pH, טמפרטורה, או קיפול חלבונים מחייב שיתוף גורמים. שילוב מרתק של פרוטוקול קדימה זול ישר הנגישות ממס וכתוצאה מכך ומידע קיפול ברמה נוקלאוטיד יחיד עושה שיטה זו מאוד אטרקטיבי. באופן מסורתי תגובת • OH footprinting מבוצע באמצעות הוסיף H 2 O 2, פרוטוקול אנו מתייחסים כאל &quot;peroxidative&quot; (איור 1A). האלטרנטיבה (&quot;חמצוני &#39;) פרוטוקול 17 כי אנו מדגישים מנצל באופן טבעי מומס O 2 כדי לייצר כמויות קטנות של חמצן דרך התגובות <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq2.jpg" /> שתי שיטות generate • OH באמצעות חמצון של Fe (II) ל Fe (III) על ידי H 2 O 2 (איור 1A). העדפה אישית נראה לקבוע איזה שימוש בפרוטוקול על ידי חברי המעבדה שלנו למיפוי מבניים טיטרציה ניסויים שיווי משקל. התגובות footprinting חמצוני peroxidative לקחת על 30 ו - 1 דקות, בהתאמה. חסרון זה מקוזז על ידי פרוטוקול חמצוני להיות מעט יותר פשוט (אחד מגיב פחות מתווסף) ואת &quot;פריכות&quot; על פרופילים חמצוני הלהקה electrophoretic. בעוד תצפית זו מרמזת ההטרוגניות פחות • מוצרי OH מחשוף, השערה זו לא נבדקה. אנו ממליצים להשתמש בפרוטוקול חמצוני לנתח מספר גדול של דגימות footprinting (&gt; 15) או דוגמאות המכילות H 2 O 2 רכיבים רגישים. השימוש טעונים שלילית EDTA מורכבת של Fe (II) (איור 1A) המונע התאגדות של Fe (II) עם עמוד השדרה פוספט טעונים שלילית של גרעיןחומצה. 1 חינם Fe (II) יכול להיקשר ל-DNA ו-RNA ולפעול נמהר ו / או יכול לזרז הידרוליזה של עמוד השדרה RNA. ריכוזים של חומרים כימיים הציג פנטון הם אידיאליים לדבוק P4-P6 RNA תחת יחיד פגע קינטיקה תנאי הכרחי footprinting במאגר המצוין. קינטיקה להיט יחיד להבטיח כי מולקולת RNA הוא ביקע רק פעם אחת בממוצע. 18 אם כמות מוגזמת של מגיב פנטון משמש, מוצרים RNA יכול לנבוע מאירוע אחד או יותר של המחשוף. זה הטיות ההפצה שבר כלפי מוצרים מחשוף קצר. היקף מחשוף הרדיקלי חייב להיות מותאם כך ~ 20% בסוף שכותרתו RNA הוא ביקע ו ~ 80% בסוף שכותרתו RNA נשאר שלם. מנה תגובה הניסויים יש להשתמש כדי לזהות את Fe המתאים (II) / H 2 O 2 בריכוזים להשגת יחיד פגע קינטיקה בתנאים פתרון המחקר של החוקר. 19 Relatמפות ive נגישות ממס המתקבל מנתח • OH footprinting יכול לשמש לבדו כדי לאפיין את מבנה RNA, מבנים קיפול ביניים נוצרו במהלך הניסויים מתקפלים שיווי משקל. נתונים אלה יכולים להיות בשילוב עם התוצאות של טכניקות טיפול שינויים קונפורמציה הגלובלי 7, 20 ו / או מחקרים footprinting האנזימטית כימי 21 אשר נוצרו בתנאים זהים. גס גרגר מודלים של מבנים RNA 22 ניתן לפתח באמצעות כימיים הרדיקלי משלימים הידרוקסיל ופרופילים footprinting אנזימטיות כמו אילוצים.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Name</th>
			<th>Company</th>
			<th>Cat#</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate
			(Caution! Toxic)	 	
			</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4945-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC treated water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9915G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9902</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-7876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1543-500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EN0541</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (30%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>349887</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring equilibrium changes in rna structure by 'peroxidative' and 'oxidative' hydroxyl radical footprinting

מולקולות רנ&quot;א תפקיד חיוני בביולוגיה. בנוסף להעברת המידע הגנטי, RNA יכול להתקפל למבנה שלישוני ייחודי למלא תפקיד ביולוגיים ספציפיים כמו קלסר הרגולטור, או זרז. מידע על היווצרות קשר שלישוני הכרחי להבין את הפונקציה של מולקולות RNA. רדיקלים הידרוקסיל (OH •) הן בדיקות ייחודי של המבנה של חומצות גרעין בשל תגובתיות גבוהה שלהם בגודל קטן. 1 כאשר שימש בדיקה footprinting, רדיקלים הידרוקסיל למפות את פני השטח נגיש ממס של עמוד השדרה phosphodiester של ה-DNA ו-RNA 1 עם 2 קנס כמו רזולוציה נוקלאוטיד בודד. Footprinting רדיקלי הידרוקסיל יכול לשמש כדי לזהות את נוקלאוטידים בתוך משטח מגע מולקולאריים, למשל חלבון-DNA ו-RNA-1 חלבון קומפלקסים. שיווי משקל 3 ו 4 מעברים הקינטית ניתן לקבוע על ידי ביצוע footprinting רדיקלי הידרוקסיל כפונקציה של solutiעל משתנים או זמן, בהתאמה. תכונה מרכזית של footprinting היא כי חשיפה מוגבלת בדיקה (למשל, &quot;יחיד פגע קינטיקה &#39;) תוצאות דגימה אחידה של כל נוקלאוטיד של הפולימר. 5 במאמר זה וידאו, אנו משתמשים תחום P4-P6 של ribozyme Tetrahymena כדי להמחיש הכנה RNA מדגם וקביעת (II) בתיווך איזותרמות Mg מתקפלים. אנו מתארים את השימוש בפרוטוקול footprinting הידרוקסיל ידוע קיצוני הדורש H 2 O 2 (שאנו מכנים זה את פרוטוקול &quot;peroxidative&quot;) לבין בעל ערך, אך לא ידוע, חלופה המשתמשת O טבעי מומס 2 (אנחנו קוראים לזה &#39; חמצוני &quot;פרוטוקול). סקירה כללית של צמצום הנתונים, שינוי נהלים ניתוח מוצג.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting at JoVE.com

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

פרוטוקול זה מתאר כיצד לכמת את Mg (II) תלויי היווצרות של RNA מבנה שלישוני על ידי שתי שיטות footprinting רדיקלי הידרוקסיל.

שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה &#39;Peroxidative&#39; ו &#39;חמצוני &quot;footprinting רדיקלי הידרוקסיל

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

monitoring-equilibrium-changes-rna-structure-peroxidative-oxidative

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

14.2K Views.  Hunter College. פרוטוקול זה מתאר כיצד לכמת את Mg (II) תלויי היווצרות של RNA מבנה שלישוני על ידי שתי שיטות footprinting רדיקלי הידרוקסיל.

Video: Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...