ספקטרומטריית מסות אומצה באופן נרחב ליישומים שונים. המתודולוגיה במאמר זה מספקת את האפיון החד משמעי של מקטעי RNA המתקבלים מתהליך אנזימטי במבחנה. היתרונות של טכניקה זו כוללים את קבלת שיא הברזל של המולקולה, כי הניסויים יכולים להתבצע עם כמויות קטנות של חומר עבור יישומים במבחנה, וכי ניתן לבצע את הפרוטוקול עם אימון מינימלי.
ניתן ליישם את המתודולוגיה המתוארת באופן נרחב בתהליכי מחקר המערבים דנ"א, רנ"א או חלבונים. דוגמאות לכך כוללות טרנספורמציות ביוכימיות כגון מידע צולב, זיהוי שינויים כימיים, או אינטראקציות ותגובתיות ביופולימריות אחרות. קושי אחד יכול להתרחש מהנגישות לספקטרומטר MALDI או למתקני ליבה המציעים שירות זה.
היבט נוסף הוא קביעת מגבלת הזיהוי שעשויה להיות גבוהה או נמוכה יותר בהתאם למכשיר. כדי להתחיל, הפעל את הספקטרופוטומטר UV-Vis, ולאחר מכן לחץ על סמל PerkinElmer UV WinLab כדי לפתוח את חלון בקרת פעולת המכשיר. הפעל את הספקטרופוטומטר של בקר הטמפרטורה Peltier באמצעות המתג הממוקם מימין למכשיר ולחץ על Scan-Lambda 365, הנמצא תחת שיטות בסיס.
מסך נוסף ייפתח ויבקש מהמשתמש לוודא שמחזיקי התאים ריקים. לחץ על אישור ואפשר למכשיר לבצע את בדיקות המערכת שלו. כעת, התאם את פרמטרי הסריקה על-ידי בחירה באיסוף נתונים.
בחלון החדש תחת הגדרות סריקה, שנה את ההתחלה ל-350 ננומטר ואת הסוף ל-215 ננומטר. הפעל את ה- Peltier על-ידי בחירת הפלוס משמאל לאביזר. לאחר מכן לחץ על Multi Cell Peltier, שנה את מעלות הטמפרטורה צלזיוס ל- 25, ולחץ על Peltier On.נווט לכרטיסיית המידע לדוגמה והזן את מספר הדגימות, השמות ומיקום התא הרצויים.
לחץ על Autozero והוסף את הקובט המכיל את פתרון הרקע. לחץ על התחל והכנס את הקובטה לתא הרצוי וודא שחלון הקובטה מכוון במקביל לפנים הקדמיות של המכשיר. כעת, לחץ על אישור כדי להתחיל את הסריקה הראשונה ב 25 מעלות צלזיוס.
למדידות בטמפרטורות גבוהות יותר, לחצו על Multi Cell Peltier, שנו את הטמפרטורה לטמפרטורת הדגימה הרצויה ושחקו על הסריקה. לחץ על קובץ, ייצא ובחר את מיקום הקובץ הרצוי ובחר XY Data כדי להשיג קובץ טקסט. כדי לבצע 5'פוספורילציה של רנ"א, הכינו תמיסה בצינור מיקרו צנטריפוגה של 0.6 מיקרוליטרים על ידי הוספת 33.5 מיקרוליטרים מים נטולי RNase, חמישה מיקרוליטרים של תמיסה A, שישה מיקרוליטים של 10 אדנוזין טריפוספט מילימולרי, מיקרוליט אחד של 200 מיקרומולרים RNA תמיסה מימית, ו-4.5-מיקרוליטרים של פולינוקלאוטיד קינאז וערבבו את התמיסה בעדינות.
דגירה של תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות על ידי הנחתה באמבטיית מים. לאחר מכן השבתת האנזים על ידי הצבת צינור התגובה בבלוק חום, שחומם מראש ב-65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אפשרו לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר כדי להניב תמיסת RNA סופית של 5'phosphorylated.
לאחר הדגירה, השתמש ב-50 מיקרוליטרים של פתרון זה, הוסף חמישה מיקרוליטרים של פתרון B, וחמישה מיקרוליטרים של תמיסת 1-femtomole של Xrn-1 כדי לבצע הידרוליזה של RNA. דגירה של צינור התגובה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. מעבירים את תערובת התגובה הזו למכשיר צנטריפוגלי בגודל נקבובית של 10 קילודלטון ומסננים את האנזימים על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-700 פעמים G.העבירו את התסיס לתוך צינור צנטריפוגה של 0.6 מיליליטר.
לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase כדי לשטוף את שאריות הרנ"א על הצינור הצנטריפוגלי, ולאחר מכן צנטריפוגה. לבסוף, שלבו את התסיס הזה עם התסיס המתקבל שהושג בעבר על ידי צנטריפוגה במכשיר צנטריפוגלי בגודל נקבובית של 10 קילודלטון, והקפיאו את התמיסה באפס מעלות צלזיוס או ספינה לניתוח. כדי להתפלות ולרכז את הדגימה, השתמש בקצות פיפטה של החלפת קטיונים C18 הזמינים מסחרית, הטעונים במצע של מדיית כרומטוגרפיה C18 בקצהה.
לשם כך, מקם את קצה הפיפטה של 10 מיקרוליטר על פיפטה של 10 מיקרוליטר ושטף את הקצה הזה פעמיים עם תמיסת אצטיל ניטריל מימית של 50%. השליכו את הנפחים המשומשים לתוך צינור פסולת נפרד בכל פעם ושיזבו את קצה C18 עם 10 מיקרוליטרים של תמיסת חומצה תלת-פלואורואצטית מימית של 0.1% פעמיים. הסירו ידנית את קצה ה-C18 מהפיפטה והצמידו אותו לפיפטה של 200 מיקרוליטר המכילה קצה פיפטה P200.
לאחר מכן לטבול את קצה C18 לתוך התמיסה המתקבלת שהוכנה במהלך הידרוליזה של אוליגונוקלאוטידים של RNA על ידי Xrn-1 ולשאוף לשחרר את התמיסה דרך קצה C18 10 פעמים. כעת, נתקו את קצה ה-C18 מהפיפטה P200, מיקמו אותו לפיפטה של 10 מיקרוליטר ושטפו את קצה ה-C18 באמצעות תמיסה מימית של תמיסת חומצה טריפלואורואצטית של 0.1% פעמיים. יש להשליך את אמצעי האחסון המשומשים לצינור פסולת נפרד בכל פעם.
שטפו את קצה ה-C18 עם מים נטולי RNase של 10 מיקרוליטרים פעמיים. לצורך תצפית על לוחית ה-MALDI, יש להבהיר את ה-RNA oligonucleotide מקצה ה-C18 על ידי טבילת הדגימה לתוך המטריצה הרצויה והעברת התמיסה בחזרה לתוך הצינור 10 פעמים. פיפטה את התמיסה הזו על שני כתמים נפרדים של מיקרוליטר אחד כל אחד על הצלחת ומאפשרת לכתמים להתייבש באוויר.
ריכוז הרנ"א ששימש בעבודה זו נקבע באמצעות ספקטרוסקופיה של UV-Visible שנרשמה ב-90 מעלות צלזיוס כדי למנוע קריאות שגויות הנובעות מהיווצרות פוטנציאלית של המבנים המשניים. רצף האירועים הכולל כלל שני חלקים. האחד, 5'phosphorylation יעיל של RNA, עדות לכך היא הופעתו של שיא אחד בלבד המתאים למוצר הצפוי.
ושתיים, שבר ההשהיה הנובע מהטיפול בתערובת הדגימה עם Xrn-1. אותן תוצאות התקבלו באמצעות רצף שונה שהכיל שני נגעים חמצוניים. שינויים אפשריים שיש לקחת בחשבון כוללים ביטול השימוש בהתקן הסינון או התחשבות במטריצות שונות לאיתור MALDI.
לדוגמה, חומצה סינפינית או חומצה פיקולינית. שברי הרנ"א התקבלו מתהליך אנזימטי. תהליך זה הוקם על ידי צימוד MALDI, אנליזה אלקטרופורטית, סינתזה של פאזה מוצקה ודיכרואיזם מעגלי.
לפרוטוקול המתואר יש פוטנציאל לשמש בתחומים שונים, החל ממחקר במדעי הכימיה וכלה ביישומים בתחום הביו-רפואי.
