这项工作是支持的国家卫生RO1 - GM085130研究所和国家科学基金会MCB0929394的资助。我们感谢她的盛情款待，让我们在她的实验室电影马里昂施密特博士。

1。足迹试剂的制备<ol><li>准备了10倍的反应缓冲液含有钠cacodylate 100毫米，1毫米EDTA和1个M氯化钾。调整pH值至7.4。使用0.2μm的醋酸纤维过滤设备（NALGENE）过滤器的缓冲区。注：不吸管的RNA直接到10倍缓冲区。 </li><li>准备如表1所示，每个反应的滴定反应混合。滴定混合量（1X缓冲和镁（二）所需的浓度）应为90μL，然后加入1X缓冲的RNA加入10μl。 </li><li>准备一个核糖核酸酶T1消化缓冲液6.63M尿素，柠檬酸钠20MM，为1mM EDTA，0.25微克/μL的tRNA，0.025％二甲苯蓝，0.025％溴酚蓝。这个缓冲区可以存储在4℃至6个月。 </li><li> Fenton反应需要250毫米的铁（NH 4）2（SO 4）2，250毫米EDTA，和500毫米L -抗坏血酸钠新鲜配制的水溶液。浓度在第1章指出.5是平衡的实验，如钠cacodylate缓冲区，不清除自由基和不同的二价离子浓度的最佳选择。 </li><li>过氧化（1.5.1）和氧化（1.5.2）的足迹反应试剂。 <ol><li>过氧化Fenton反应需要100毫米的铁EDTA的解决方案，和50毫米钠L -抗坏血酸和1.5％H 2 O 2，新鲜配制的水溶液。准备用EDTA铁EDTA溶液混合铁（NH 4）2（SO 4）2，有超逾铁EDTA的1.1倍。 </li><li>前发起的氧化裂解反应（3.4.2），创建相结合，2μL的Fe（NH 4）2（SO 4）2（250毫米），EDTA的2.2μL（250毫米），62.5μLFenton反应组合L -抗坏血酸钠（500毫米），22.5μL10X反应缓冲液和135.5μLH 2 O的终浓度达到0（3.4.2）的足迹反应混合物。，分别为10毫米，0.11毫米和6.61毫米。 </li></ol></li></ol> 2。足迹实验RNA的制备<ol><li> RNA可以在体外转录DNA模板6标准生产，如果少于50个核苷酸，购买（例如，在集成DNA技术，www.idtdna.com ）。实验室按照建议的清洁程序，以保持在足迹实验样品RNA的完整性。 </li><li> 8脱磷，在体外转录RNA是必要的前 32 P标签的RNA的5&#39;端。 10 pmol kinasing末端标记的RNA 9解决方案应该是成功的磷酸灭活后的阴天。 </li><li>净化放射性标记的RNA变性凝胶电泳。随后的两个凝胶0.3 M醋酸钠（pH 5.5）中提取的RNA恢复。 RNA沉淀混合水溶液0.5毫升，1毫升乙醇和随后孵育1分钟干冰。在4 ° C，12500 RPM 0.5小时旋转样品。弃上清，用70％乙醇洗涤RNA沉淀。额外的离心去除上清液后，在真空干燥颗粒。 </li><li> P标记的 32 RNA样品溶解在330 UL 1X Buffer.Pipet 30μL的反应管中的RNA溶液，沉淀用乙醇和真空干燥RNA生成参考阶梯（步骤3.5），保持此管。变性加热的缓冲的RNA溶液在95 ° C为2分钟。样品冷却到室温为15分钟，快速旋转，使管放回解决方案的盖子上的冷凝液。 </li></ol> 3。足迹实验<ol><li>电泳梳，确定每分析凝胶的数据点的最大数量。我们使用30梳。参考阶梯占地2井和uncleaved控制之一。准备27个反应管。最后MG（二）concentrati项应均匀分布的对数遍及各地的滴定中点量级的规模。 </li><li>另外，在50 RNA和镁（二）解决方案° C孵育5分钟。 90（二）镁相应数额在1x缓冲液10μLRNA溶液混合，达到100微升的最终体积。孵育30分钟的解决方案，在50 ° C。 </li><li>让我们的解决方案，在25 ° C为1小时的平衡而发生折叠。 </li><li>过氧化（3.4.1）（3.4.2）或氧化羟基自由基足迹反应。 <ol><li>开始放置铁EDTA（100毫米）2μL液滴的过氧化反应，反应的顶部内彼此分开2μLL -抗坏血酸钠（50毫米）和2μlH 2 O 2（1.5％ ）管内含有RNA的解决方案，并开始严厉混合的足迹反应。停止15秒后加入300μL冷无水乙醇的反应。转动管的3-5倍。沉淀，洗涤和在步骤2.4干燥沉淀。 </li><li>加入5μL新鲜配制的Fenton反应混合物（1.6）开始氧化羟自由基footprintingreaction。孵育30分钟，在25 ° C。添加300μL冷无水乙醇淬火反应和组合转向管的3-5倍。沉淀，清洗和干燥的颗粒为在步骤2.4中表示。 </li></ol></li><li>根据标准程序10使用在步骤1.3编写的解决方案生成一个核糖核酸酶T1消化参考样本。 </li><li>溶解于8μL凝胶上样染料II（Ambion公司），并确认RNA的RNA颗粒悬浮使用盖革计数器。 </li><li> 11。负载样本，包括两个引用和控制的标准协议，准备变性，8％聚丙烯酰胺测序胶。独立的RNA片段在60瓦 - 75 W为2.5小时。干凝胶置于存储荧光粉屏幕一夜之间。扫描成像系统胶片放射自显影，如荧光屏。风暴865（GE Healthcare公司）或台风（GE Healthcare公司）。凝胶图像文件传输到您的计算机。 </li></ol> 4。数据分析<ol><li>每个核苷酸的羟基自由基反应，是由每个频带的量化分析凝胶强度。下载，安装和开放SAFA，一个易于使用的开源软件为单波段的装修和量化12，13按照用户手册的说明。简而言之，负载的RNA序列。txt文件的后面。凝胶文件的凝胶图片。调整波段的强度，定义车道，选择一个锚车道，并执行凝胶对齐。频段分配到核苷酸发生在核糖核酸酶T1消化阶梯参考。乐队量化积分和使用的正常化/ colorplot功能正常化和分配潜在不变的残留物。另存为。txt文件的输出。 </li><li> SAFA输出电子表格，其中包含代表胶道和行代表在列tegrated波段相应的RNA片段的单个波段的密度。首先，确定保护的网站显示在溶剂可显着的变化，通过比较没有镁（II）与终点毫克（二）浓度在我们的例子（50毫米）的配置文件样本所得的个人资料的保护。该值越低，受保护的碱基对羟基自由基的攻击，反之亦然。 </li><li>创建折叠等温线从个人或群组的核苷酸与镁（Ⅱ）浓度的归波段积分。等温线是单独缩放FI = L +（U - L）的分数饱和度• <img src="files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Ÿ" />其中，f表示乐队的集成密度（S）分析，L和U代表的上限和下限过渡<img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Ÿ" /> 14的数据都适合使用非线性升是小数饱和。东广场分析程序（我们使用或者原产地（OriginLab）或GraphPad（GraphPad软件公司）。）向山式（1） <img alt="公式1" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" /> 其中K，D是平衡解离常数，[M]，对应的变量，可调节的折叠反应，镁（二）在这个例子中的浓度，N H Hill系数。此过程尺度过渡到小数饱和，决定了它的中点，并提供了一​​个过渡是否是S形的现象学测试。来自测序凝胶（图3A）SAFA（图3B）进行了分析和适合如上所述的等温线如图3C所示。如图3所示的分数饱和等温线所产生的电子表格中的缩放SAFA产生对最适合使用的方程分数的上限和下限（U和 L）值=值 /（U - L） - L /（ U - L）。 </li></ol> 5。代表性的成果： 图3显示了代表小四至小六的RNA•OH足迹实验的结果。凝胶图像（左）表示，一）背景乳沟是最小的（右线），B）单核苷酸分配是可能的，因为在T1巷（核糖核酸酶T1劈开每个G）定义的乐队，和c）的羟基自由基诱导的RNA碎片以及上述背景。从低到高镁（二）的过渡是隶属于下降表明RNA三级结构形成的乐队的个人和组的集成条带密度。单次或连续核苷酸的裂解变化随之而来被称为一个“保护”的群体。 •OH保护镁（二）特点的小四至小六RNA介导的折叠密切对应溶剂人迹罕至的地区，其晶体结构中观察到的分子。 折叠的RNA分子的彗星<html>一个有非常明显的结构性或动态的现象，但没有与相关的大专接触保护的不同程度（即，如何接近背景带密度下降）。因此，一些RNA分子将显示定义良好的结构转换，如在图3所示，而有些则不会。乐队强度SAFA 12分析（图3B）量化和规范化。输出是一个“热”的，可视情节对•OH的相对程度的保护。颜色过渡介绍后，镁（二）除无障碍变化。白色红色或蓝色显示更容易或多个受保护的核苷酸，分别。每个阴影的程度，是隶属于一个数值，可以被绘制成一个保护曲线（图3C），如山式（1）通过一项具有约束力的模型分析。解离常数与保护153-155附属的平衡是两倍左右，相应的价值，保护163-164。 ontent“&gt; <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" /> 图1。羟自由基的生产和P4 - P6 RNA折叠。 A）铁（II）催化羟自由基的过氧化氢的生成。抗坏血酸亚铁降低铁（Ⅲ）回。 B）在镁（二）的情况下，没有小四至小六的三级结构形成，使羟基自由基渗透和切割所有可访问的骨干岗位。增加镁（二）启动折叠小四至小六，只允许溶剂可及骨干羟基自由基裂解。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" /> 图2。大纲为羟基自由基足迹实验。一）Dephophorylation和32个P 5&#39; -端的RNA标记。二）净化32 P标记在变性聚丙烯酰胺凝胶中的RNA。三）RNA的频段切除，随后的RNA提取，乙醇沉淀。 ð）Prefolding和折叠的RNA。五）新鲜准备的Fenton反应混合物除了生成羟基自由基。 F）的RNA片段，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。 G）的定量RNA片段SAFA软件。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" /> 图3过氧化芬顿足迹反应后的RNA片段分析。 （一）的RNA被暴露的羟基自由基和卵裂产品使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）得到解决。图片显示，增加镁的浓度（二）过氧化裂解产物。参考和控制车道标记。此图像文件的SAFA的方案，其中定量每个频段的音量输入。 （二）“热”的情节所产生的SAFA。 （三）有关集成条带密度SAFA核苷酸的数量输出值的电子表格是如山equati绑定模型分析（1）。保护区被选为乐队Mg（II）浓度的功能不可或缺的密度增加。在K D是在被监控的网站，其中一半的RNA折叠的Mg（II）的浓度。 Hill系数，N H，是衡量斜坡曲线上具有约束力的协同信息，并提供了一个在这个特定的站点折叠的镁离子的数量的较低的估计。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" /> 表1卷生成的RNA样品含有不同的Mg（II）浓度的代表。

<ol>
	<li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl+radical+"footprinting":+high-resolution+information+about+DNA-protein+contacts+and+application+to+lambda+repressor+and+Cro+protein.">Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).</li><li>Celander, D. W., Cech, T. 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S., Shcherbakova, I., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+and+analysis+of+kinetic+*OH+radical+footprinting+data+using+SAFA.">Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA.</a> Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).</li><li>Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+of+monovalent+and+divalent+ion+binding+in+the+folding+of+the+P4-P6+domain+of+the+Tetrahymena+ribozyme.">Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme.</a> Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).</li><li>Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+group+I+ribozyme+domain:+principles+of+RNA+packing.">Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing.</a> Science. 273, 1678-1685 (1996).</li><li>Petri, V., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+nucleic+acids+footprinting:+thermodynamic+and+kinetic+approaches.">Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).</li><li>Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+RNA+compaction:+insights+from+the+equilibrium+folding+pathway+of+the+P4-P6+RNA+domain+in+monovalent+cations.">Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations.</a> J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).</li><li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+DNase+footprint+titration:+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions.">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).</li><li>Shcherbakova, I., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyl-radical+footprinting+to+probe+equilibrium+changes+in+RNA+tertiary+structure.">Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).</li><li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly.">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li><li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SHAPE+and+hydroxyl+radical+analysis+of+RNA+structure+and+ribonucleoprotein+assembly.">High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly.</a> Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).</li><li>Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+modeling+of+large+RNA+molecules+with+knowledge-based+potentials+and+structural+filters.">Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters.</a> RNA. 15, 189-199 (2009).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

羟基自由基足迹是一个有价值的工具，以评估核酸的溶剂可及表面面积。定性和定量的形成三级结构14，可以遵循作为一个功能参数，如离子种类和浓度，pH值，温度，结合蛋白或折叠的共同因素。引人注目的一条直线前进和廉价的协议，以及由此产生的溶剂可及单核苷酸水平上的折叠信息的结合，使得这种方法非常有吸引力的。传统的•OH足迹反应是增加H 2 O 2，我们称为“过氧?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Name</th>
			<th>Company</th>
			<th>Cat#</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate
			(Caution! Toxic)	 	
			</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4945-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9260G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC treated water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9915G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3 M)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9740</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9902</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-7876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1543-500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EN0541</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (30%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>349887</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring equilibrium changes in rna structure by 'peroxidative' and 'oxidative' hydroxyl radical footprinting

RNA分子在生物学中发挥的重要作用。除了传递遗传信息，RNA折叠成独特的三级结构，实现特定的生物学作用，作为调节剂，粘结剂或催化剂。有关大专院校的联系形成的信息是必须了解的RNA分子的功能。羟基自由基（•OH）是独特的结构由于其反应活性高，体积小的核酸探针。，作为一个足迹探头使用时，羟基自由基地图的溶剂可及表面的DNA和RNA的磷酸骨干如单核苷酸分辨率罚款。羟基自由基足可以用来识别内分子间的接触面，例如在DNA -蛋白质和RNA -蛋白质复合物的核苷酸。 3平衡和动力学4转换可以由羟基自由基足迹作为一个soluti功能进行变量或时间，分别。的足迹的一个主要特点是有限的接触探头（例如，“单次击中动力学”）中的每个核苷酸的聚合物均匀采样的结果。5 在这个视频文章中，我们使用的四膜虫核酶的小四至小六的域名，说明RNA样品制备和一个镁（II）介导的折叠等温线的决心。我们描述了使用众所周知的羟基自由基足迹协议，要求H 2 O 2（我们称之为“过氧化”协议）和一个有价值的，但并不广为人知，替代使用自然溶解O 2的（我们称之为“氧化“协议）。提交的数据压缩，转换和分析程序概述。

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Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

本协议描述了如何量化的镁（二）依赖RNA的三级结构的形成由两个羟基自由基足迹方法。

监测RNA结构平衡的变动情况“过氧化”和“氧化”羟基自由基足

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

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