In vivo FPOP אינטראקציות חלבון-חלבון ושינויים במבנה החלבון ב- C-elegans. בעלי חיים אלה נמצאים בשימוש נרחב כמערכת מודל לחקר מחלות אנושיות. על ידי צימוד vivo FPOP לספקטרומטריית מסה, אנו יכולים לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון בתוך תאים וגוף שונים בבעלי חיים חיים ללא צורך לבודד חלבון מסוים אחד.
התחל את הרכבת מערכת הזרימה, על ידי חיתוך חתיכה של שני סנטימטרים של פרופילן אתילן פלואורי או צינורות FPP. השתמש מחט חיטוי נקי כדי להרחיב את הקוטר הפנימי בקצה אחד של הצינור, יצירת מכתש קטן על 15 מילימטרים אורך. כדי ליצור את הקווים החדורים של מערכת הזרימה, לחתוך לחתיכות 15 ס"מ של 250 מיקרומטר קוטר פנימי התמזגו סיליקה עם חותך קרמיקה.
וקלטת שני נימים יחד עם סרט דבק עצמי, לוודא כי הקצוות הם 100% סמוקים. הכנס את שני נימים לתוך המכתש של צינורות FPP, דוחף אותם עד הקצה מאוד. מניחים נקודה קטנה של שרף אפוקסי על משטח נקי, ומערבבים אותו עם מחט ניתוח.
השתמש באותה מחט כדי למקם במהירות טיפה קטנה של השף, בסוף נימים מחדירים, שם הם מתחברים עם צינורות FPP, לאפשר את השף לייבש בצד שקע עד כמה דקות. בינתיים, לחתוך נימי חדש 250 מיקרומטר בקוטר פנימי אשר יהפוך נימי שקע של מערכת הזרימה. לאחר שהסולן התייבש, הכנס את נימי החדש לקצה שקע צינור FPP.
הקצוות הפנימיים של נימי האאוטלט ושני נימים מחדירים צריכים להיות סומקים אחד נגד השני, יצירת תה ערבוב. לאגד את צינורות נימי FPP עם שרף אפוקסי טרי כפי שתואר קודם לכן, ולאפשר למערכת הזרימה להתייבש בן לילה. הכנס ארבעה ערבוב מגנטי, בתוך מזרק אחד חמישה מיליליטר אשר ימנע תולעים להתיישב במזרק זה במהלך חמצון פוטוכימי מהיר vivo של חלבונים או ב vivo FPOP.
מלאו את זה ומזרק נוסף של חמישה מיליליטר עם M9, ודאגו להימנע מיצירת בועות. חבר מתאם תחתון לכל מזרק, ודא שהוא צמוד לאצבע ומאובטח במקומו. לאחר מכן, חבר כל מזרק ליציאה האמצעית של שסתום יחיד של שלוש ושתיים.
אבטחו כל מזרק למשאבת המזרק הכפולה, והתאיימו את הצבע המכאני כדי למנוע לחץ יתר מבלוק הדחיפה. השתמש ברשימת אוגן סופר לא שרוול FEP ומשתנה רשימת אוגן סופר לצרף כל קצה נימי מחדיר של המערכת microfluidic שנעשו בעבר ליציאה העליונה של כל שסתום שלוש ושתיים. לבסוף, לחבר נימי 10 ס"מ 450 מיקרומטר בקוטר פנימי ליציאה התחתונה של השסתום, אשר ישמש נימי מדגם נסוג.
הפעל את זרימת המשאבה ובדוק באופן חזותי את כל החיבורים לדליפות. הזרם לפחות שלושה נפחי מזרק באמצעות קצב הזרימה הניסיוני. נתיב הזרימה מסומן על ידי החצים על ידית שסתום שלוש ושתיים, וכל מזרק ניתן למלא מחדש באופן ידני על ידי הזזת ידית השסתום מגירוש למצב נסיגה.
לאחר בדיקת מערכת הזרימה המיקרופלואידית, העבר אותה לספסל הניסויים, ואבטח את נימי השקע לשלב המקרין עם איחוד נירוסטה. השתמש מצית ארוך להגיע לשרוף את הציפוי של סיליקה התמזגו בחלון הקרנה בלייזר ולנקות את הציפוי השרוף עם רקמת מוך מתנול. מקם את הבלוק המגנטי מעל המזרק עם המזרק המגנטי והתאם את המהירות, כך שהערבבים מסתובבים לאט ובהתמדה.
הפעל את לייזר excimer פלואוריד קריפטון ולאפשר טרון בלוטת התריס להתחמם. למדוד את אנרגיית הלייזר בתדר של 50 הרץ לפחות 100 פולסים על ידי הצבת החיישן האופטי בחלון יציאת הקרן. משיכה ידנית של כ- 10,000 תולעים בנפח של 500 מיקרוליטר למזרק הדגימה.
לאחר מכן מלאו אותו ב-2.5 מיליליטר של חיץ M9, ודאגו להימנע מבועות אוויר. חשוב שיהיה גודל מדגם של לפחות 10,000 תולעים. גודל מדגם קטן יותר יגרום לתפוקת חלבון נמוכה לניתוח פרוטאומי במורד הזרם.
מלא את המזרק השני בשלושה מיליליטר של מי חמצן 200 מילימולרית. בסוף נימי האאוטלט, מניחים צינור חרוט 15 מיליליטר עם שישה מיליליטר של DMTU 40 מילימולרית, 40 מילימולאר PBN, ו 1% זמן תחמוצת ריק תפוחים. הפעל את לייזר excimer מחלון התוכנה, לחכות לפעימה הראשונה ולהתחיל את זרימת המדגם מן המזרק הכפול.
לאסוף את המדגם כולו בצינור 15 מיליליטר, תוך ניטור פעיל של זרימת המדגם עבור כל דליפות חזותיות. לאחר in vivo FPOP, גלולה התולעים על ידי צנטריפוגה ב 805 פעמים g במשך שתי דקות. שאפו את פתרון ההתרוות והוסיפו 250 מיקרוליטרים של מאגר מורשה.
מעבירים את הדגימה לצינור מיקרו צנטריפוגה נקי, מקפיאים אותו ומאחסנים ב-80 מעלות צלזיוס שליליות עד לעיכול הדגימה. התאוששות תולעת הושוותה לאחר FPOP vivo באמצעות נימים עם שני קטרים פנימיים שונים. כאשר נעשה שימוש בנימים בקוטר פנימי של 250 מיקרומטר, הושגה התאוששות מדגם כוללת בין 63% ל-89% על פני שני שכפולים ביולוגיים.
שימוש נימי בקוטר פנימי 150 מיקרומטר הביא רק 21 עד 31% התאוששות. השימוש נימי בקוטר פנימי גדול יותר, מוביל לזרימת תולעת טובה יותר במהלך in vivo FPOP, נימי קטן אינו מאפשר זרימת תולעת אחת, ותולעים מרובות נראים זורמים יחד בחלון הקרנת הלייזר, אשר מקטין את כמות החשיפה לייזר לכל תולעת. נציג שחולץ כרומטוגרמות יונים של פפטיד FPOP שונה ללא שינוי הראה כי רדיקלי הידרוקסיל משנה את הכימיה של פפטידים ששונו באופן חמצוני מה שהופך אותם קוטביים יותר.
ב כרומטוגרפיה של פאזה הפוכה, לפפטידים ששונו ב- vivo FPOP יש זמני שמירה מוקדמים יותר מאשר פפטידים שלא שונו. פיצול טרשת נפוצה של פפטידים מבודדים, מאפשר זיהוי של שאריות ששונו באופן חמצוני. In vivo FPOP שינתה באופן חמצוני סך של 545 חלבונים על פני שני שכפולים ביולוגיים בתוך C-elegans.
אחד היתרונות של שיטת טביעת הרגל של החלבון, הוא היכולת לשנות חלבונים, במגוון מערכות גוף בתוך התולעים. ניתוח טנדם MS מאשר ב vivo FPOP בדיקה ממס נגישות ב vivo. דפוס החמצון של חלבון הלם החום 90 במתחם עם חלבון המלווה מיוסין UNC 45, נותחו וארבע שאריות ששונו באופן חמצוני, נמצאו.
השימוש C-elegans עבור in vivo FPOP, מציע את הפוטנציאל ללמוד את התפקיד של אינטראקציות חלבון חלבון ומבנה חלבון בפתוגנזה המחלה.
